徐 靚，吳玉嬌，袁曉陽，張 峰，程 剛，張運芳，魏 偉，嚴尚學

骨關節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種以關節(jié)軟骨退變和關節(jié)腔炎癥為主要病理變化的慢性關節(jié)退變疾病[1]。軟骨細胞作為軟骨組織中唯一的細胞類型，其功能的改變在OA中發(fā)揮著不可替代的關鍵作用[2]。細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是一種由gasdermin蛋白介導的細胞程序性壞死[3]，表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內容物釋放進而激活強烈的炎癥反應。最近研究認為，細胞焦亡與OA病理進展密切相關，如焦亡在滑膜變化中起關鍵作用[4]，與OA疼痛的病理機制相關[5]，并且會加劇軟骨的退化[6]。已有關于細胞焦亡方面的研究多集中于OA滑膜細胞、巨噬細胞，軟骨細胞的相關研究較少。

基于細胞焦亡在OA發(fā)生發(fā)展過程中的作用，探索建立軟骨細胞焦亡的細胞模型，對進一步闡明OA的病理機制，評價和篩選OA治療藥物具有重要意義。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是參與OA的重要促炎性細胞因子，可驅動炎癥級聯反應、誘導大量炎癥和分解代謝因子產生[7]。該研究擬采用兩步酶消化法收集大鼠軟骨細胞進行體外培養(yǎng)，以不同質量濃度TNF-α誘導，模擬OA微環(huán)境，篩選出穩(wěn)定的軟骨細胞焦亡體外模型，為進一步闡明OA發(fā)生機制、篩選治療OA的藥物并評價其療效及作用機制提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SPF級SD大鼠，體質量約120 g，安徽省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(皖)2017-001。本實驗已通過安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理審查委員會批準(編號：PZ-2020-044)。

1.2 主要試劑Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；大鼠IL-1β、IL-18酶聯免疫試劑盒購自上海酶聯公司；TNF-α購自美國Peprotech公司；抗磷酸化核轉錄因子-κB p65 (Phospho-NF-κB p65, P-p65)抗體及抗p65抗體為美國CST公司產品；抗半胱天冬酶1(caspase-1)抗體及抗gasdermin D(GSDMD)抗體為美國Proteintech公司產品；抗核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 (nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor containing protein 3, NLRP3)抗體及抗β-actin抗體為美國Affinity公司產品；抗基質金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13, MMP-13)抗體及抗Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen, Col Ⅱ)抗體為美國Novus公司產品。

1.3 主要儀器全波長多功能酶標儀(型號: Infinite M1000 Pro，瑞士Tecan公司)；熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)(型號: ImageQuant LAS 4000，美國GE公司)；激光共聚焦顯微鏡(型號：TCS SP8)、倒置LED顯微鏡(型號：DMil)(德國徠卡公司)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(型號：GeminiSEM 300，德國蔡司公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1軟骨細胞的分離、培養(yǎng) 使用手術刀片緩慢刮取大鼠膝關節(jié)軟骨，無菌眼科剪將關節(jié)軟骨剪碎至體積為1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.25%胰蛋白酶置于37 ℃搖箱消化40 min，用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化后，加入0.2%Ⅱ型膠原酶于37 ℃搖箱內繼續(xù)消化2 h，結束后將消化液吹散混勻，離心后PBS重懸，再離心，加入完全培養(yǎng)基分散細胞后轉移到普通培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，48 h后首次換液。待細胞長滿后進行傳代處理，三代以內原代軟骨細胞用于后續(xù)實驗。

1.4.2軟骨細胞鑒定 以甲苯胺藍染色與Col Ⅱ免疫組織化學染色進行軟骨細胞鑒定。采用爬片技術，細胞貼壁后取出蓋玻片，4 %多聚甲醛固定20 min，3 %過氧化氫室溫下孵育10 min，5% BSA封閉10 min，滴加Col Ⅱ一抗，4 ℃過夜。復溫后滴加生物素標記的二抗，室溫下孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。對于甲苯胺藍染色，固定后用甲苯胺藍染色5 min，梯度乙醇脫水后常溫干燥，中性樹膠封片。

1.4.3CCK-8法檢測軟骨細胞的活力 制備細胞懸液，96孔板每孔加入5 000個細胞，過夜，細胞充分貼壁，給予TNF-α(0、5、10、20、40 ng/ml)不同濃度刺激，其中TNF-α(0 ng/ml)為對照組。48 h后每孔加入10 μl CCK-8，避光孵育1.5 h，酶標儀測定450 nm 處吸光度A值。細胞活力(%)=[ (A刺激組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

1.4.4Western blot檢測軟骨細胞焦亡信號蛋白、MMP-13及Col Ⅱ的表達 收集TNF-α(0、5、10、20、40 ng/ml)不同濃度刺激后的細胞，提取細胞總蛋白，電泳，轉膜，封閉，分別加入P-p65、p65、NLRP3、caspase-1、GSDMD、MMP-13、Col Ⅱ、β-actin等一抗孵育過夜，加二抗37 ℃孵育2 h，洗膜顯影。ImageJ軟件分析灰度值并進行統(tǒng)計分析。

1.4.5ELISA檢測軟骨細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18的水平 收集TNF-α(20 ng/ml )刺激組和對照組的細胞培養(yǎng)上清液，ELISA法測定IL-1β、IL-18的濃度。

1.4.6免疫熒光檢測軟骨細胞GSDMD表達 將軟骨細胞以TNF-α(20 ng/ml)處理48 h后，采用爬片技術以4%多聚甲醛固定20 min，用5%BSA封閉1 h，加入抗GSDMD抗體4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育1.5 h，以DAPI染核10 min，用抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.4.7掃描電鏡觀測軟骨細胞的形態(tài)學改變 將軟骨細胞以TNF-α(20 ng/ml)處理48 h后，采用爬片技術以2.5%戊二醛固定，乙醇梯度脫水、臨界點干燥、鍍膜、掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。

2 結果

2.1 軟骨細胞形態(tài)學觀察經過兩步酶消化法分離得到的原代軟骨細胞為球形，呈懸浮狀態(tài)，大小均一，具有較強的折光性。貼壁后的軟骨細胞大部分呈圓形、橢圓形或短梭形，培養(yǎng)4 d后，軟骨細胞呈不規(guī)則的卵圓形或多角形，可見成簇現象。細胞基本爬滿瓶底后，此時軟骨細胞多為圓形，胞體豐滿，胞質均勻，核大而圓并且互相連接成“鋪路石”樣結構。傳代后細胞貼壁時間較原代細胞縮短，增殖速度加快(圖1)。

2.2 軟骨細胞鑒定3代內的陽性軟骨細胞甲苯胺藍染色可見細胞內有藍紫色異染顆粒，Col Ⅱ免疫組織化學染色可見胞漿呈棕黃色。分離培養(yǎng)后二者均為陽性的軟骨細胞比例約為98%。見圖2。

圖2 大鼠軟骨細胞鑒定 ×100A：甲苯胺藍染色；B：Col Ⅱ染色

2.3 不同濃度TNF-α對細胞活力的影響以不同濃度TNF-α處理軟骨細胞48 h，CCK-8檢測結果顯示(圖3)，隨著TNF-α濃度增加，軟骨細胞活力逐漸下降。與對照組比較，TNF-α(20、40 ng/ml)可抑制軟骨細胞活力(F=4.474，P<0.05)。

圖3 不同濃度TNF-α對細胞活力的影響(n=3)與對照組比較：*P<0.05

2.4 不同濃度TNF-α對軟骨細胞焦亡信號蛋白的影響圖4結果顯示，TNF-α(5、10、20、40 ng/ml)均可促進軟骨細胞P-p65、NLRP3、caspase-1、GSDMD的蛋白表達，且隨著濃度增加，蛋白表達水平逐漸升高。TNF-α(5 ng/ml)組P-p65、NLRP3、caspase-1、GSDMD的蛋白表達與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義。TNF-α(10 ng/ml)組P-p65、NLRP3的蛋白表達與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。而TNF-α(20 ng/ml)和TNF-α(40 ng/ml)處理的焦亡信號蛋白表達均存在顯著性差異(P<0.05或0.01)。結合CCK-8結果，選擇TNF-α濃度為20 ng/ml進行后續(xù)實驗。

圖4 TNF-α對軟骨細胞焦亡信號蛋白的影響(n=3)A：GSDMD/β-actin；B：caspase-1/β-actin；C：NLRP3/β-actin；D：P-p65/p65；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5 TNF-α對軟骨細胞MMP-13和Col Ⅱ表達的影響為進一步了解TNF-α對軟骨細胞膠原代謝的影響，實驗檢測了TNF-α(20 ng/ml)刺激軟骨細胞后MMP-13和Col Ⅱ的表達水平。圖5結果顯示，TNF-α(20 ng/ml)可提高軟骨細胞MMP-13水平(t=4.337，P<0.05) ，降低Col Ⅱ的表達(t=4.287，P<0.05 )。結果提示TNF-α(20 ng/ml)破壞了軟骨細胞內的基質平衡。

圖5 TNF-α對軟骨細胞MMP-13和Col Ⅱ表達的影響(n=3)A：MMP-13/β-actin；B：Col Ⅱ/β-actin；與對照組比較：*P<0.05

2.6 TNF-α對軟骨細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18水平的影響ELISA結果顯示，與對照組細胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β、IL-18水平相比，TNF-α(20 ng/ml)刺激可上調關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)上清液中促炎細胞因子IL-1β[(10.210±0.512)vs(24.680±0.449)，t=21.230，P<0.001]和IL-18水平[(40.000±3.408)vs(96.360±5.598)，t=8.599，P<0.01]。結果提示TNF-α(20 ng/ml)可促進軟骨細胞內炎癥因子IL-1β、IL-18的釋放。

2.7 TNF-α對軟骨細胞GSDMD表達的影響GSDMD定位于細胞質中，炎癥環(huán)境下細胞膜上亦有表達。與對照組軟骨細胞相比，TNF-α(20 ng/ml)刺激后的關節(jié)軟骨細胞GSDMD熒光表達增強。見圖6。

圖6 TNF-α刺激對軟骨細胞GSDMD表達的影響 ×630

2.8 TNF-α對軟骨細胞焦亡形態(tài)學的影響掃描電鏡結果(圖7)顯示，對照組軟骨細胞結構完整，TNF-α(20 ng/ml)刺激后關節(jié)軟骨細胞腫脹變形，細胞膜穿孔并破裂，顯微結構破壞。結果提示TNF-α(20 ng/ml)可誘導軟骨細胞發(fā)生焦亡形態(tài)學變化。

圖7 掃描電鏡下軟骨細胞的形態(tài)變化 ×1 000A：對照組；B：TNF-α組

3 討論

在經典的焦亡信號中，危險信號可刺激細胞膜上的模式識別受體并與之結合，形成由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白和效應分子caspase-1組成的NLRP3炎癥小體[8]，這些炎癥小體激活caspase-1后進一步切割GSDMD產生膜孔，導致細胞腫脹并最終溶解，釋放大量的促炎細胞因子，如IL-1β、IL-18等，這些致炎性細胞因子又進一步促進了焦亡的發(fā)生[9]。近年來研究[6]表明，OA患者的NLRP1和NLRP3表達水平顯著升高；在OA患者的軟骨中，未及時被吞噬的凋亡小體，可連同軟骨鈣化的增加通過繼發(fā)性細胞焦亡加重OA[10]，這些研究提示細胞焦亡與OA的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關。

在本研究中，采用兩步酶消化法提取的大鼠軟骨細胞，細胞形態(tài)特征明顯，甲苯胺藍和Col Ⅱ染色為陽性，且純度達到98%以上，提示軟骨細胞提取分離成功。TNF-α(20 ng/ml)可抑制大鼠軟骨細胞活力，致細胞穿孔破裂、顯微結構破壞，其焦亡特征性信號分子P-p65、NLRP3、caspase-1和GSDMD表達水平上升，且培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18水平升高。這些結果表明，TNF-α(20 ng/ml)可以成功誘導大鼠軟骨細胞焦亡模型。細胞外基質丟失被認為是OA軟骨損傷的主要原因之一[11-12]。在基質組成中，Col Ⅱ與其它膠原蛋白及非膠原蛋白結合，形成穩(wěn)定的網狀結構，為軟骨提供拉伸強度[13]。在炎癥過程中，NF-κB途徑的激活抑制了軟骨細胞合成代謝，并誘導基質金屬蛋白酶的表達[2]。TNF-α(20 ng/ml)通過激活NF-κB信號促進大鼠軟骨細胞MMP-13表達升高，誘導Col Ⅱ降解，導致了軟骨細胞基質破壞。

綜上所述，TNF-α(20 ng/ml)可模擬炎癥微環(huán)境誘導大鼠軟骨細胞焦亡發(fā)生。該模型可廣泛用于研究OA發(fā)病機制及體外篩選治療OA的潛在藥物。