楊 砥，徐遠(yuǎn)坤

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)作為慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)于中老年群體，以膝關(guān)節(jié)疼痛及活動(dòng)障礙為主要表現(xiàn)[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，KOA已成為全球公認(rèn)的主要致殘?jiān)颍医陙?lái)KOA發(fā)病呈年輕化發(fā)展趨勢(shì)，故有效預(yù)防KOA對(duì)人類健康具有重要裨益[2-3]。目前，KOA發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有學(xué)者[4-5]指出，miR-138在KOA患者關(guān)節(jié)液中呈低表達(dá)，提示其可能參與KOA的發(fā)生發(fā)展，造成軟骨損傷，但其具體作用機(jī)制尚不明確?；诖耍撐慕OA模型，通過(guò)TrkA-TRPV1信號(hào)通路調(diào)控miR-138，探究miR-138對(duì)KOA大鼠軟骨損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取40只健康SD大鼠，體質(zhì)量203～252(227.50±20.82)g，由科文斯醫(yī)藥研發(fā)(上海)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(滬)2021-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的有關(guān)規(guī)定，飼養(yǎng)環(huán)境恒溫(21.50±2.00)℃，相對(duì)濕度42%～50%左右，自由飲水?dāng)z食，12 h/12 h黑夜光照循環(huán)，以維持基礎(chǔ)狀態(tài)。

1.1.2主要試劑 TrkA一抗(兔來(lái)源，批號(hào):ab76291)、二抗(抗兔，批號(hào)：ab150078)購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司；TRPV1(兔來(lái)源，批號(hào)：ab6166)購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；antago miR-138、ago miR-138購(gòu)自漢恒生物科技(上海)有限公司。

1.1.3主要儀器 ELISA試劑盒購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自上海賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1建模及分組 將40只健康SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、沉默組、過(guò)表達(dá)組。正常組：給予大鼠尾部注射等劑量0.9%氯化鈉溶液處理；模型組：給予大鼠麻醉、作右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，離斷摘除前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)半月板，給予尾部注射等劑量0.9%氯化鈉溶液處理；沉默組：給予尾部注射30 mg/kg antago miR-138處理；過(guò)表達(dá)組：尾部注射30 mg/kg ago miR-138處理。同時(shí)各組給予腹腔注射8×104U青霉素(1 ml/kg)預(yù)防感染，連續(xù)注射1周。均連續(xù)給藥7 d。

1.2.2樣本采集及HE染色 于藥物干預(yù)7 d后，空氣栓塞法處死大鼠，抽取各組大鼠右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液置于試管內(nèi)，低溫、3 000 r/min(半徑：12 cm)離心10 min，分離上清液，-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存待檢。剪開(kāi)膝關(guān)節(jié)囊，無(wú)菌操作分離股骨內(nèi)踝關(guān)節(jié)軟骨組織，剪取部分軟骨組織制備勻漿液，將軟骨組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定，24 h后脫水處理，石蠟包埋，切成4 μm切片，依次經(jīng)二甲苯、梯度乙醇水化后，蘇木精浸染5 min，鹽酸乙醇分色，自來(lái)水沖洗，1%伊紅染色2～3 min，脫水、透明、封片，光鏡進(jìn)行觀察。

1.3 指標(biāo)觀察

1.3.1行為學(xué)、軟骨組織學(xué)檢測(cè)

1.3.1.1行為學(xué)檢測(cè) 于藥物干預(yù)7 d后，應(yīng)用改良Lecuesne MG膝關(guān)節(jié)評(píng)估法[6]對(duì)各組大鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估，包括步態(tài)改變、關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)活動(dòng)及疼痛刺激反應(yīng)等。

1.3.1.2軟骨組織學(xué)檢測(cè) 使用顯微鏡對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理切片進(jìn)行觀察，包括血管充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及軟骨細(xì)胞壞死等病理變化，應(yīng)用Mankin評(píng)分[8]對(duì)各組大鼠軟骨組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行評(píng)估。0分：軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞數(shù)量如常，潮線完整，基質(zhì)染色正常；1分：軟骨細(xì)胞彌漫性分布，數(shù)量增多，軟骨表面存在不規(guī)則裂隙，出現(xiàn)多重潮線，基質(zhì)染色減退；2分：軟骨細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，軟骨裂隙深達(dá)肌層，軟骨下血管浸潤(rùn)肌層，基質(zhì)染色明顯減退；3分：軟骨細(xì)胞顯著減少，軟骨裂隙深達(dá)輻射層，基質(zhì)染色顯著減退；4分：軟骨裂隙深達(dá)鈣化層，基質(zhì)染色完全消失；5分：軟骨層脫落。

1.3.2關(guān)節(jié)液中炎性因子水平檢測(cè) 利用雙抗體夾心法測(cè)定TNF-α、IL-1、IL-6，按照1 ∶2比例稀釋樣品；于每孔內(nèi)加入100 μl已稀釋好的待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃恒溫孵育箱中濕育2 h；后以專用的洗滌液重復(fù)洗滌反應(yīng)板，再加入1 ∶100稀釋的抗體工作液100 μl/孔，37 ℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6溶液100 μl/孔，置于37 ℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μl/孔終止反應(yīng)，在測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光度值，依據(jù)反應(yīng)顏色深淺與待測(cè)指標(biāo)水平成正比，計(jì)算TNF-α、IL-1、IL-6水平。

1.3.3軟骨組織骨代謝標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè) 利用免疫組化法測(cè)定MMP-13、Col Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)，將石蠟切片脫水、PBS漂洗、3%過(guò)氧化氫與甲醇混合液浸泡10 min，超純水漂洗、抗原、修復(fù)、PBS漂洗后，加入一抗，常溫孵育2 h，PBS漂洗5 min，加入二抗，常溫孵育40 min，PBS漂洗5 min，DAB室溫顯色20～30 min，清洗、封片，光鏡下觀察細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloproteinase-13，MMP-13)、Ⅱ型膠原(collagen Ⅱ，Col Ⅱ)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。根據(jù)顯色程度由淺至深記為0、1、2、3分，以細(xì)胞核著色記為陽(yáng)性。每張片子以400×觀察，統(tǒng)計(jì)10個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4RT-PCR檢測(cè)軟骨組織miR-138表達(dá) microRNA提取分離試劑盒分離miR-138細(xì)胞總RNA，采用TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行microRNA逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Premix ExTaq II kit進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，內(nèi)參為U6。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃、10 min，40 ℃、60 min，85 ℃、5 min；設(shè)置擴(kuò)增條件:94 ℃、20 s，72 ℃、30 s，60 ℃、30 s，35個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算出需要檢測(cè)的miR-138表達(dá)量。

1.3.5Western blot檢測(cè)法對(duì)各組大鼠TrkA、TRPV1表達(dá) 取大鼠待測(cè)軟骨組織按1 ∶5加入裂解液裂解、勻漿、提取總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(1 ∶300)，孵育過(guò)夜。加入二抗(1 ∶5 000)，常溫孵育2 h，顯影、定影、沖洗、晾干，掃描膠片，采用Image J軟件分析TrkA、TRPV1表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白水平=目標(biāo)條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料經(jīng)levene法檢測(cè)具備方差齊性，shapiro-wilk檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，計(jì)量資料使用進(jìn)行描述，組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 治療后各組大鼠右后膝關(guān)節(jié)軟骨切片HE染色圖正常組：軟骨細(xì)胞大小均一，排列整齊；模型組、沉默組：軟骨細(xì)胞增生，軟管表面細(xì)胞受損嚴(yán)重，表層軟骨細(xì)胞稀少；過(guò)表達(dá)組：軟骨細(xì)胞基本呈正常狀態(tài)，表層軟骨細(xì)胞增多。見(jiàn)圖1。

圖1 治療后各組大鼠右后膝關(guān)節(jié)軟骨切片HE染色圖 ×400A：正常組；B：模型組；C：沉默組；D：過(guò)表達(dá)組

2.2 各組大鼠行為學(xué)、軟骨組織學(xué)評(píng)估比較與正常組相比，模型組、沉默組、過(guò)表達(dá)組大鼠行為學(xué)、軟骨組織學(xué)評(píng)分升高(P<0.05)；與過(guò)表達(dá)組相比，模型組、沉默組大鼠行為學(xué)、軟骨組織學(xué)評(píng)分升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)、軟骨組織學(xué)評(píng)估比較分，n=10]

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)液中炎性因子水平比較與正常組相比，模型組、沉默組、過(guò)表達(dá)組大鼠TNF-α、IL-1、IL-6水平升高(P<0.05)；與過(guò)表達(dá)組相比，模型組、沉默組大鼠TNF-α、IL-1、IL-6水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)液中炎性因子水平比較

2.4 各組大鼠軟骨組織骨代謝標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)比較與正常組相比，模型組、沉默組、過(guò)表達(dá)組大鼠MMP-13表達(dá)升高，Col Ⅱ表達(dá)降低(P<0.05)；與過(guò)表達(dá)組相比，模型組、沉默組大鼠MMP-13表達(dá)升高，Col Ⅱ表達(dá)降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠軟骨組織骨代謝標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)比較

2.5 各組大鼠軟骨組織中TrkA、TRPV1、miR-138表達(dá)比較與正常組相比，模型組、沉默組、過(guò)表達(dá)組大鼠TrkA、TRPV1表達(dá)升高，miR-138表達(dá)降低(P<0.05)；與過(guò)表達(dá)組相比，模型組、沉默組大鼠TrkA、TRPV1表達(dá)升高，miR-138表達(dá)降低(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖2。

圖2 各組大鼠軟骨組織中TrkA、TRPV1 Western blot圖A：正常組；B：模型組；C：沉默組；D：過(guò)表達(dá)組

表4 各組大鼠軟骨組織中TrkA、TRPV1、miR-138表達(dá)比較

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨作為一種特殊的結(jié)締組織，其軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化率較低。因此，軟骨損傷后自我修復(fù)能力較差。同時(shí)，軟骨細(xì)胞更新及代謝過(guò)程極為復(fù)雜，由多種細(xì)胞因子參與完成。研究[7]表明，軟骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解是導(dǎo)致KOA軟骨降低的主要因素。

既往研究[8]表明，炎性因子變化通過(guò)調(diào)節(jié)、刺激各種酶活性對(duì)關(guān)節(jié)軟骨代謝造成直接影響。徐英杰 等[9]研究顯示，TNF-α、IL-1、IL-6在KOA患者關(guān)節(jié)液中呈異常高表達(dá)，通過(guò)對(duì)局部的刺激，造成關(guān)節(jié)軟骨退變加重。其中，TNF-α可參與免疫應(yīng)答、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等，在KOA模型大鼠關(guān)節(jié)液中呈異常高表達(dá)；而IL-6具有多種生物學(xué)活性，可增強(qiáng)TNF-α、IL-1效應(yīng)，誘導(dǎo)合成多種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白。相關(guān)研究[10]證實(shí)，KOA動(dòng)物模型關(guān)節(jié)液中可檢測(cè)到TNF-α、IL-1、IL-6，且含量明顯高于正常組，在通過(guò)干預(yù)后，TNF-α、IL-1、IL-6含量降低，提示通過(guò)下調(diào)關(guān)節(jié)液中炎性因子可達(dá)到治療KOA療效。本研究結(jié)果顯示，對(duì)KOA大鼠給予過(guò)表達(dá)miR-138干預(yù)后，軟組織病理?yè)p傷減輕，關(guān)節(jié)液內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-6水平降低，提示基于TrkA-TRPV1信號(hào)通路調(diào)控miR-138可改善KOA病理組織形態(tài)學(xué)，抑制關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)蔓延，證實(shí)miR-138對(duì)機(jī)體炎性反應(yīng)具有良好的抑制作用。此研究結(jié)果為預(yù)防、治療KOA軟骨損傷提供重要參考依據(jù)。

MMPs作為軟骨基質(zhì)內(nèi)機(jī)制降解的主要蛋白酶，其中MMP-13作為降解基質(zhì)內(nèi)Col Ⅱ的主要膠原酶亞型，在骨性關(guān)節(jié)炎疾病的整個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。相關(guān)研究[12]證實(shí)，Col Ⅱ合成減少及降解加速與KOA發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)，且MMP-13通過(guò)裂解Col Ⅱ蛋白促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解，造成軟骨發(fā)生破壞和缺損。故通過(guò)檢測(cè)MPP-13、Col Ⅱ水平為軟骨退化情況評(píng)估提供重要參考。本研究結(jié)果顯示，基于TrkA-TRPV1信號(hào)通路對(duì)KOA大鼠進(jìn)行過(guò)表達(dá)miR-138干預(yù)，大鼠軟骨組織內(nèi)MPP-13表達(dá)降低、Col Ⅱ表達(dá)升高；表明過(guò)表達(dá)miR-138可抑制MPP-1合成增加，促進(jìn)Col Ⅱ生產(chǎn)，減少軟骨細(xì)胞凋亡，緩解/減輕軟骨損傷；由此提示調(diào)控miR-138對(duì)改善細(xì)胞外基質(zhì)降解、延緩關(guān)節(jié)軟骨退變具有重要意義。

相關(guān)研究指出，TrkA-TRPV1信號(hào)通路作為疼痛信號(hào)傳遞的關(guān)鍵通路，其信號(hào)阻斷對(duì)KOA疼痛抑制具有重要意義[13]。TrkA作為神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的特異性受體可激活PI3K等降低TRPV1開(kāi)放閾值，上調(diào)TRPV1表達(dá)產(chǎn)生反饋?zhàn)饔?，是炎性因子釋放而降低痛閾；而TRPV1作為KOA治療的潛在靶點(diǎn)，TRPV1拮抗劑炎性關(guān)節(jié)疼痛緩解具有重要作用，但目前未見(jiàn)TrkA-TRPV1信號(hào)通路對(duì)miR-138調(diào)控的影響[14]。樊萍 等[15]研究指出，miR-138在參與KOA發(fā)生發(fā)展的同時(shí)與機(jī)體炎癥存在密切相關(guān)，TrkA-TRPV1信號(hào)通路與KOA大鼠炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，由此推測(cè)miR-138與TrkA-TRPV1信號(hào)通路間可能密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)對(duì)KOA大鼠給予過(guò)表達(dá)miR-138干預(yù)，TrkA、TRPV1表達(dá)降低，miR-138表達(dá)升高，提示上調(diào)miR-138對(duì)減輕軟骨損傷具有獨(dú)特意義，分析其原因或與抑制軟骨組織中TrkA-TRPV1信號(hào)通路激活相關(guān)。