盧琳， 胡繼芬， 陳麗紅， 何麗丹， 吳秀燕， 李建華

遺傳性溶血性貧血(hereditary hemolytic anemia， HHA)是由于編碼紅細(xì)胞膜蛋白、紅細(xì)胞代謝酶及血紅蛋白的基因突變引起的一組遺傳異質(zhì)性貧血[1]。HHA病因復(fù)雜多樣，不同病因引起的溶血常表現(xiàn)出相似的臨床特點(diǎn)，如黃疸、肝脾腫大、紅細(xì)胞壽命縮短或破壞增多、骨髓紅系增生、輸血依賴性溶血性貧血等，常需進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)才能明確溶血原因，有時(shí)甚至存在病因未明現(xiàn)象。目前，已發(fā)現(xiàn)的KLF1基因變異可產(chǎn)生廣泛的臨床表型，如遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)表達(dá)(hereditary persistence of fetal hemoglobin， HPFH)、臨界性HbA2水平升高、Lutheran血型、HHA和先天性紅細(xì)胞生成不良性貧血Ⅳ型(congenital dyserythropoietic anemia Ⅳ， CDA-Ⅳ)等。

KLF1基因位于染色體19p13.13，跨越2.78 kb的基因組DNA，由3個(gè)外顯子組成，編碼362個(gè)氨基酸。KLF1蛋白包含2個(gè)N端反轉(zhuǎn)錄激活域(TAD1、TAD2)、3個(gè)C端鋅指(ZF1、ZF2和ZF3)形成DNA結(jié)合域，能夠與相應(yīng)的靶基因位點(diǎn)特異性結(jié)合(圖1)。KLF1基因變異所致的HHA呈常染色體隱性遺傳，患者臨床上常表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血、黃疸、肝脾腫大，目前最有效的治療手段是定期輸血，脾切除并不能使該病得到有效緩解，骨髓移植的有效性也尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。此類病例十分罕見(jiàn)，在高通量測(cè)序技術(shù)廣泛開(kāi)展前，可能存在漏診或誤診，因此真實(shí)發(fā)病率可能被低估。

KLF1基因位于19p13，定位用紅色箭頭表示，由3個(gè)外顯子組成(Exon1、Exon2、Exon3)。黑框：編碼區(qū)；白框：非編碼區(qū)；藍(lán)線為內(nèi)含子區(qū)域；紅框?yàn)榈说姆词郊せ钣颉Ｅc本研究突變相對(duì)應(yīng)的核苷酸改變用紅色字體表示，與本研究相對(duì)應(yīng)的編碼序列改變用藍(lán)色字體表示。KLF1蛋白包含2個(gè)氮端反轉(zhuǎn)錄激活域和3個(gè)碳端(C2H2)鋅指結(jié)合域。圖1 KLF1基因位置及結(jié)構(gòu)圖Fig.1 KLF1 gene location and structure

本研究分析1例HHA患兒的致病原因，采用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行相關(guān)基因變異分析，對(duì)可疑致病變異位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，檢測(cè)到患兒KLF1基因存在c.519_525dupCGGCGCC(p.Gly176ArgfsTer*179)和c.1012C>A(p.Pro338Thr)復(fù)合雜合變異，并復(fù)習(xí)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，該病例為目前已知的KLF1基因突變導(dǎo)致HHA的第6個(gè)報(bào)道(共累及14例)，且在國(guó)內(nèi)為首次報(bào)道，現(xiàn)將該病例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)情況匯總?cè)缦隆?/p>

1 病例介紹

1.1 臨床資料 患兒，男，5歲，系第1胎第1產(chǎn)，孕母定期產(chǎn)檢未見(jiàn)異常，足月順產(chǎn)，出生時(shí)Apgar評(píng)分10-10-10，外觀無(wú)畸形，出生后當(dāng)天即出現(xiàn)皮膚明顯黃染，轉(zhuǎn)入當(dāng)?shù)蒯t(yī)院新生兒科治療。出生后半個(gè)月因皮膚及鞏膜黃染加重、持續(xù)性高膽紅素血癥及嚴(yán)重貧血予輸血治療后癥狀好轉(zhuǎn)，之后每3個(gè)月輸血1次，維持至今。家族史：父母非近親婚配且身體健康，否認(rèn)家族遺傳病史。查體：神志清楚，對(duì)答配合，中度貧血面容，皮膚、眼瞼膜、口唇黏膜及甲床均蒼白，全身淺表淋巴結(jié)未觸及腫大，心肺聽(tīng)診無(wú)明顯異常。腹軟，無(wú)壓痛、反跳痛。肝臟肋緣下未觸及，脾臟肋緣下2 cm。輔助檢查：血常規(guī)示白細(xì)胞(white blood cell， WBC)15.26×109L-1，血紅蛋白74 g/L，平均紅細(xì)胞體積(mean red blood cell volume， MCV)81 fl，平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(mean erythrocyte hemoglobin， MCH)32.5 pg，血小板(platelet，PLT)228×109L-1；外周血檢查提示為小細(xì)胞低色素性貧血、網(wǎng)織紅細(xì)胞比例增多；肝功能示丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶均正常，總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素分別為82.0、12.5和69.5 μmol/L。骨髓穿刺可見(jiàn)紅細(xì)胞系大量增生、核碎裂現(xiàn)象。未檢出常見(jiàn)的α、β地中海貧血基因缺失或變異。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院進(jìn)行了血紅蛋白電泳、Coombs試驗(yàn)、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)試驗(yàn)等相關(guān)檢查，結(jié)果排除了常見(jiàn)的溶血性疾病，如地中海貧血、同種免疫性溶血、遺傳性球形細(xì)胞增多癥、G-6-PD缺乏癥等。患兒的生長(zhǎng)及智力發(fā)育在正常水平。臨床診斷“貧血原因待查”。為進(jìn)一步明確診斷及要求優(yōu)生咨詢就診筆者醫(yī)院。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(〔2016〕005號(hào))。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及DNA提取 在充分溝通并簽署知情同意書后，抽取患兒及其父母外周血各3 mL， EDTA抗凝。采用DNA Mini Kit試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取外周血基因組DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 高通量測(cè)序檢測(cè)及Sanger測(cè)序驗(yàn)證 將基因組DNA打斷成片段并構(gòu)建基因組文庫(kù)，通過(guò)探針雜交捕獲與遺傳病相關(guān)的基因外顯子及鄰近內(nèi)含子區(qū)域(±10 bp)進(jìn)行測(cè)序。富集后的DNA片段在高通量測(cè)序儀(NovaSeq 6000，美國(guó)Illumina公司)上測(cè)序。根據(jù)與臨床表型相關(guān)的疑似致病位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，并對(duì)患兒及其父母的目標(biāo)序列進(jìn)行Sanger 測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果。

1.2.3 變異位點(diǎn)致病性分析 測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Burrow-Wheeler Aligner(BWA，version 0.7.12)軟件進(jìn)行人類基因組參考序列比對(duì)，用Genome Analysis Toolkit(GATK， version 3.3)軟件對(duì)核苷酸多態(tài)性、插入、缺失進(jìn)行檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析。用Annovar軟件進(jìn)行變異的篩選和注釋，用千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和dbSNP等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)檢出的變異進(jìn)行嚴(yán)格過(guò)濾，用Mutation taster等軟件對(duì)可疑變異進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。嚴(yán)格按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics， ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行致病性分析[2]。

1.2.4 文獻(xiàn)來(lái)源與檢索方法 檢索以“KLF1”“溶血性貧血”“Kruppel-Like Factor 1”“congenital hemolytic anemia”“hypochromic anemia”為關(guān)鍵詞在PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)、萬(wàn)方醫(yī)學(xué)網(wǎng)、維普中文生物醫(yī)學(xué)期刊等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。

1.3 結(jié)果

1.3.1 基因測(cè)序結(jié)果 全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，患兒攜帶KLF1基因(NM_006563.3)復(fù)合雜合變異，包括第2個(gè)外顯子c.519_525dupCGGCGCC(p.Gly176ArgfsTer*179)的移碼突變和第3個(gè)外顯子c.1012C>A(p.Pro338Thr)的錯(cuò)義突變，變異分別來(lái)源于患兒母親和父親。Sanger測(cè)序圖見(jiàn)圖2。

1.3.2 變異位點(diǎn)致病性分析結(jié)果KLF1基因c.519_525dupCGGCGCC(p.Gly176ArgfsTer*179)為無(wú)功能性變異。根據(jù)ACMG指南的判斷標(biāo)準(zhǔn)，該變異被判定為致病性變異(PVS1+PS4+PM2)。c.1012C>A(p.Pro338Thr)根據(jù)ACMG指南的判斷標(biāo)準(zhǔn)被判定為可能致病性(PS4+PM2+PM5+PP3)。

1.3.3 文獻(xiàn)回顧分析結(jié)果 關(guān)于HHA的病例最早于2014年報(bào)道，共檢索到符合KLF1變異導(dǎo)致HHA診斷的文獻(xiàn)5篇，均為外文文獻(xiàn)，累及患兒13例，男女比例為10∶2(其中1例文獻(xiàn)未訴性別)，就診年齡大多在胎兒期到4歲之間(1例12歲)。病因均為KLF1上的2個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生復(fù)合雜合變異，臨床表型極其相似，如貧血、黃疸、肝脾腫大，主要治療手段均為定期輸血。

A：先證者c.519_525dupCGGCGCC雜合變異；B：先證者c.1012C>A雜合變異；C：母親c.519_525dupCGGCGCC雜合變異；D：父親c.1012C>A雜合變異(紅色箭頭表示突變位點(diǎn))。圖2 KLF1基因Sanger測(cè)序圖Fig.2 Sanger sequencing of KLF1 gene

2 討 論

HHA常發(fā)生于嬰幼兒期，輕型患者也可能到成年后才被發(fā)現(xiàn)。該病是因紅細(xì)胞的內(nèi)在先天性缺陷所導(dǎo)致，常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)有黃疸、肝脾腫大、貧血、高膽紅素血癥、骨髓造血增生活躍等。治療手段也因病因不同不盡相同。近年來(lái)，HHA的診療技術(shù)雖有所進(jìn)展，但仍不盡人意，血庫(kù)技術(shù)的發(fā)展大大改善了患兒的預(yù)后[3]。

KLF1是一種紅細(xì)胞生成的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，參與激活、抑制、調(diào)節(jié)多個(gè)血型抗原表達(dá)、珠蛋白基因表達(dá)和轉(zhuǎn)換、細(xì)胞循環(huán)及周期、血紅素合成酶、細(xì)胞膜及細(xì)胞骨架、自噬調(diào)節(jié)、血紅蛋白合成等多個(gè)環(huán)節(jié)，幾乎控制了紅細(xì)胞發(fā)育與成熟的所有方面[4]。一項(xiàng)針對(duì)KLF1基因敲除的小鼠胚胎因嚴(yán)重紅細(xì)胞缺陷導(dǎo)致死亡的研究也證實(shí)，KLF1基因?qū)t細(xì)胞的生成起著關(guān)鍵性作用[5]。

KLF1基因突變分為4種類型，主要通過(guò)影響蛋白編碼序列影響其轉(zhuǎn)錄活性[6]：(1)突變位于DNA結(jié)構(gòu)域外，不影響或輕微影響功能。(2)突變?cè)贒NA結(jié)構(gòu)域內(nèi)，包括一些錯(cuò)義突變和小的編碼區(qū)缺失，能影響基因功能。(3)無(wú)義突變或移碼突變，能產(chǎn)生截短蛋白，為功能性突變。(4)顯性突變，使ZF2上一個(gè)高度保守的氨基酸發(fā)生錯(cuò)義突變(p.E325K)，導(dǎo)致嚴(yán)重的CDA-Ⅳ(#613673)。目前，HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的KLF1變異已有60余種，盡管鋅指結(jié)構(gòu)僅占KLF1的20%，但大部分錯(cuò)義突變均位于這個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)或之間[7]。

不同類型的突變可對(duì)下游靶基因產(chǎn)生不同的影響，從而引起廣泛的臨床表型，由表型輕微的罕見(jiàn)In(Lu)(inhibitor of Lutheran)血型攜帶、HPFH、臨界性HbA2水平升高，到嚴(yán)重的遺傳性血紅蛋白疾病，如CDA-Ⅳ型、HHA，甚至出現(xiàn)胎兒水腫及胚胎致死[8-15]。因KLF1雜合突變常表現(xiàn)為單倍劑量不足[16]，大多數(shù)攜帶者通過(guò)傳統(tǒng)篩查難以發(fā)現(xiàn)。在中國(guó)南方，KLF1基因突變的攜帶率為1.25%，而北方攜帶率為0.08%[17]。但在應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)之前，KLF1基因變異極其罕見(jiàn)。因此由其導(dǎo)致的遺傳性血液疾病的病因無(wú)法闡明，推測(cè)部分死胎可能與該基因功能受損有關(guān)。

本例中KLF1基因c.519_525dupCGGCGCC(p.Gly176ArgfsTer*179)為移碼變異，會(huì)導(dǎo)致所編碼蛋白質(zhì)自第176位甘氨酸開(kāi)始發(fā)生移碼，從而產(chǎn)生1個(gè)缺失ZF結(jié)構(gòu)域的截短蛋白，為無(wú)功能性變異。c.1012C>A(p.Pro338Thr)位于ZF2和ZF3結(jié)構(gòu)域之間，在GnomAD基因組聚合數(shù)據(jù)庫(kù)中有收錄，在ESP6500siv2_ALL、千人基因組(1000g2015aug_ALL)和dbSNP147等數(shù)據(jù)庫(kù)正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)，該變異在人群中發(fā)生頻率極低(0.000 05)，但在同一個(gè)突變位點(diǎn)導(dǎo)致另一個(gè)氨基酸發(fā)生的變異chr19:12995776G>A(Pro338Ser)已被確認(rèn)是致病性的，且該病表型與患者癥狀高度相符。對(duì)不同哺乳動(dòng)物的KLF1進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，338位點(diǎn)的Pro保守。經(jīng)Mutation taster、Mutation Assessor等軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析其均有致病可能，會(huì)使所編碼蛋白質(zhì)第338位氨基酸由脯氨酸變?yōu)樘K氨酸。對(duì)同源性基因的建模發(fā)現(xiàn)，第338位的脯氨酸變?yōu)樘K氨酸能通過(guò)破壞R337和A347之間的氫鍵，導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)松弛，從而改變ZF1和ZF2之間正常的橋接結(jié)構(gòu)，對(duì)KLF功能造成有害影響[18]。

VIPRAKASIT等[13]對(duì)8例嚴(yán)重的溶血性貧血患者的研究發(fā)現(xiàn)，患兒均是KLF1復(fù)合雜合子突變，表型與遺傳性非球形細(xì)胞溶血性貧血極其相似?？偨Y(jié)全球已報(bào)道的13例KLF1基因復(fù)合雜合變異所致的HHA發(fā)現(xiàn)，患兒均攜帶2種不同的二類突變或是1種二類突變與1種三類突變共存的復(fù)合雜合狀態(tài)；幾乎所有患兒都在嬰幼兒期發(fā)病，臨床表現(xiàn)為貧血、黃疸、脾腫大，大部分需要定期輸血維持治療(僅1例在不輸血的情況下血紅蛋白濃度能維持在80～90 g/L)。本研究中的患兒與文獻(xiàn)報(bào)道的2例的復(fù)合雜合變異完全相同，1例為水腫胎，分別于孕27、29、34周行胎兒宮內(nèi)輸血治療后，于孕34周分娩，出生后仍需每月輸血1次，患兒體質(zhì)量明顯低于同齡兒水平[13]；另1例為男嬰，出生后有嚴(yán)重的貧血，立即予輸血治療，此后定期輸血[19]。但需要注意的是，并非所有的KLF1復(fù)合雜合突變都有嚴(yán)重的臨床表型，與KLF1突變產(chǎn)生的蛋白類型及對(duì)靶基因的影響有關(guān)。對(duì)其中8例溶血性貧血的患者進(jìn)行紅細(xì)胞酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，丙酮酸激酶(pyruvate kinase， PK)缺乏，但對(duì)編碼PK的相關(guān)基因進(jìn)行測(cè)序并未發(fā)現(xiàn)變異[12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，KLF1基因能特異性地與PKLR基因啟動(dòng)子結(jié)合，推測(cè)KLF1部分類型的突變可能影響PK的功能，從而產(chǎn)生與遺傳性非球形細(xì)胞溶血性貧血相似的臨床表型，表明KLF1還能與其他基因協(xié)同作用參與溶血性貧血的發(fā)病。

本病例與已報(bào)道的病例有著十分相似的臨床特點(diǎn)，與前兩例相同突變位點(diǎn)病例不同的是，該患兒在孕期并無(wú)胎兒水腫，出生后定期輸血的時(shí)間間隔也較長(zhǎng)，且生長(zhǎng)發(fā)育正常。推測(cè)即使具有相同突變位點(diǎn)的復(fù)合雜合變異，臨床表型的嚴(yán)重程度也可能存在差異，這為今后的遺傳咨詢提供了指導(dǎo)信息。

綜上所述，筆者對(duì)1例HHA患兒進(jìn)行了KLF1基因變異分析，證實(shí)了KLF1復(fù)合雜合突變?yōu)槠渲虏≡?。該?bào)道不僅豐富了HHA的基因診斷，也為進(jìn)一步研究KLF1基因突變與臨床表型嚴(yán)重程度的關(guān)系提供了新的依據(jù)。