劉佳欣，付朝旭，代霖，金慧玲，許妍姬

延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，延吉 133002

增塑劑具有延展性、能夠增加塑料的強(qiáng)度及穩(wěn)定性，因此在現(xiàn)代生產(chǎn)生活中被大量應(yīng)用到塑料制品中[1-2]，鄰苯二甲酸二乙基己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)是產(chǎn)量最大且被使用最為廣泛的一種增塑劑，也是人類經(jīng)常暴露的環(huán)境污染物[3]；由于DEHP與塑料之間僅依靠鍵能較弱氫鍵或范德華力連接，其結(jié)合不緊密，導(dǎo)致了環(huán)境污染和對(duì)機(jī)體的毒性損傷[4]，本文將探討其對(duì)神經(jīng)毒性的影響。另一種增塑劑雙酚A(bisphenol A, BPA)，是一種烷基酚類的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其在生殖毒性、肝臟毒性和免疫毒性方面的研究已得到證實(shí)[5-8]；隨著發(fā)展與進(jìn)步，BPA的神經(jīng)毒性逐漸受到關(guān)注。

DEHP和BPA這類的環(huán)境污染物對(duì)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)具有負(fù)面影響，現(xiàn)有研究表明，孕期母體攝入的DEHP會(huì)影響子代小鼠的神經(jīng)發(fā)育[9]；人體主要通過經(jīng)口、呼吸吸入、醫(yī)療和皮膚接觸等途徑暴露于DEHP中[10]，BPA主要經(jīng)過環(huán)境和食物等途徑進(jìn)入人體，在機(jī)體中能夠通過胎盤屏障和血腦屏障，從而損害中樞神經(jīng)[11]。阿爾茲海默病(Alzheimer disease, AD)作為一種典型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病隱襲且病程較為緩慢，容易受環(huán)境污染物的影響，淀粉樣前體蛋白(APP)酶解通路異常是AD致病機(jī)制中的重要過程。相關(guān)塑料制品的磨損老化以及高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等條件下的使用使得人體經(jīng)常同時(shí)暴露于2種毒物中。以往的研究中DEHP和BPA二者的單獨(dú)毒性作用均已得到證實(shí)[10-12]，實(shí)際生產(chǎn)生活中，由于人體經(jīng)常會(huì)同時(shí)暴露在DEHP與BPA的環(huán)境中，其聯(lián)合毒性引發(fā)的安全問題需要重新進(jìn)行探討；為探究二者的聯(lián)合毒性作用，為職業(yè)場(chǎng)所和生活場(chǎng)所DEHP和BPA聯(lián)合暴露導(dǎo)致的健康問題提供實(shí)驗(yàn)參考和科學(xué)依據(jù)，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行聯(lián)合染毒并采用動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試和生化指標(biāo)的檢測(cè)，探討B(tài)PA與DEHP聯(lián)合染毒的毒性作用與機(jī)制以及對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇80只SPF級(jí)昆明(Kun Ming, KM)種雄性小鼠，體質(zhì)量為(20.0±2.0) g，由延邊大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；在延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)房集中飼養(yǎng)5 d，光、暗周期交替，溫度控制在22～25 ℃，相對(duì)濕度保持在40%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司，型號(hào)BioTek)、超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(上海喬躍電子有限公司，型號(hào)JY96-Ⅱ)、電泳儀(上海碧云天生物科技有限公司，型號(hào)165-8033)、小動(dòng)物避暗穿梭測(cè)試儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)，型號(hào)YLS3TB)和小動(dòng)物跳臺(tái)記錄儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)，型號(hào)YLS-17B)、Morri水迷宮(上海欣軟，型號(hào)XR-XM101)、高速冷凍離心機(jī)(Thermo Electron，型號(hào)CR3i)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

雙酚A(純度99.0%，上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司)、鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯(純度99.0%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)、吐溫80(純度99.0%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；丙二醛(MDA)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、單胺氧化酶(MAO)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒均購于南京建成生物工程有限公司；APP、PS1、tau、BACE1、tubulin抗體(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；Aβ1-42酶聯(lián)免疫試劑盒、β-分泌酶和γ-分泌酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.3 試劑配制

將DEHP與吐溫80(Tween-80)按照體積為1∶1助溶，并使用雙蒸水配制成濃度分別為100、250和500 mg·kg-1的染毒液。將1 mg BPA溶解于10 mL的無水乙醇，加入1 L水配制成1 mg·L-1的染毒液；2種毒物均采用灌胃染毒的方式對(duì)小鼠進(jìn)行染毒處理。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與模型建立

白金等[13]通過對(duì)小鼠進(jìn)行染毒，研究DEHP對(duì)雄性小鼠大腦皮質(zhì)氧化損傷及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)影響，結(jié)果表明，DEHP各染毒組的大腦皮質(zhì)Bcl-2蛋白表達(dá)減少，500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1劑量組Bax蛋白表達(dá)增高，提示DEHP可致小鼠大腦皮質(zhì)氧化損傷及凋亡相關(guān)蛋白改變；馮強(qiáng)偉[14]進(jìn)行了DEHP聯(lián)合甲醛暴露實(shí)驗(yàn)，生化指標(biāo)測(cè)試結(jié)果表明，1.0 mg·m-3和3.0 mg·m-3甲醛與500 mg·kg-1DEHP以及聯(lián)合暴露組1.0 mg·m-3甲醛+50 mg·kg-1DEHP和3.0 mg·m-3甲醛+500 mg·kg-1DEHP可以導(dǎo)致小鼠氧化損傷、炎癥反應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)以此為依據(jù)確定了染毒暴露組濃度[14]。選擇80只昆明種小鼠，隨機(jī)分為8組，每組各10只，具體分組如表1所示。

BPA和DEHP處理組每天按照0.01 mL·g-1的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃染毒，對(duì)照組按照相同比例的劑量給予雙蒸水(double distilled water, DDW)灌胃處理，各組均自由攝食、飲水，連續(xù)染毒42 d。實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察小鼠的毛色、呼吸和狀態(tài)，并記錄各組小鼠的體質(zhì)量、攝食量以及飲水量。

表1 實(shí)驗(yàn)分組與染毒劑量(n=10)Table 1 Experimental grouping and exposure dose (n=10)

1.5 動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)1.5.1 小鼠Morris水迷宮測(cè)試

實(shí)驗(yàn)周期的第42天進(jìn)行小鼠Morris水迷宮訓(xùn)練，訓(xùn)練期間照常定時(shí)給藥。水迷宮由直徑為1.2 m的圓形水池構(gòu)成，水池分為4個(gè)象限，平臺(tái)位于第4象限，水池水位位于平臺(tái)上2 cm處，由頂部攝像頭進(jìn)行錄像拍攝。實(shí)驗(yàn)過程中，水溫保持在(23±1) ℃。實(shí)驗(yàn)前5 d為定位航行實(shí)驗(yàn)：每次將小鼠的頭朝向池壁，分別從1、2、3、4象限的固定位置投入水池中，時(shí)長為60 s,記錄小鼠從不同象限游上平臺(tái)的時(shí)間，在平臺(tái)停留5 s為成功上臺(tái)；若未能成功找到平臺(tái)，則通過引導(dǎo)棒將其引導(dǎo)上臺(tái)，并讓小鼠在平臺(tái)停留10 s，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力。每間隔24 h訓(xùn)練一次，訓(xùn)練5 d；第6天、第7天、第9天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將小鼠從平臺(tái)對(duì)角線的象限固定點(diǎn)投入水中，記錄路線、穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間，以此來測(cè)試小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

1.5.2 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)

第6周時(shí)訓(xùn)練，分為模擬訓(xùn)練和正式測(cè)試。將小鼠放進(jìn)避暗儀的明箱中，使其消除恐懼，適應(yīng)環(huán)境；3 min后打開明暗室的隔板，開啟避暗儀進(jìn)行測(cè)定，電壓設(shè)定為36 V，持續(xù)記錄5 min，24 h后進(jìn)行相同的測(cè)試為正式測(cè)試，記錄小鼠第1次從明箱到暗箱受到電擊所用的時(shí)間和小鼠從明箱穿梭到暗箱受到電擊的次數(shù)，即其潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。

1.5.3 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

第6周時(shí)進(jìn)行訓(xùn)練，分為模擬訓(xùn)練和正式測(cè)試2部分。實(shí)驗(yàn)開始之前將動(dòng)物放入跳臺(tái)箱內(nèi)適應(yīng)3 min，底部通電，動(dòng)物受到電刺激，正常反應(yīng)時(shí)跳上平臺(tái)躲避傷害性刺激，染毒作用的小鼠會(huì)削弱這種反應(yīng)記憶能力；第2天將小鼠再次重復(fù)該操作，進(jìn)行正式測(cè)試，時(shí)間設(shè)置為5 min，觀察并記錄小鼠從絕緣平臺(tái)跳下所花費(fèi)的時(shí)間和小鼠從平臺(tái)跳下的次數(shù)，即逃避潛伏期和跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)。

1.6 生化指標(biāo)的測(cè)定1.6.1 小鼠腦組織MDA含量以及MAO、AchE、CAT活性的檢測(cè)

小鼠處死后置于冰上取腦，用天平稱其1/4的質(zhì)量，按照9(mL)∶1(g)的比例加入生理鹽水，置于冰上用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，2 500 r·min-1離心10 min，取其上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.2 ELISA法檢測(cè)腦組織中β、γ-分泌酶活性和Aβ1-42含量

小鼠處死后置于冰上取腦，用天平進(jìn)行準(zhǔn)確稱量，按照9(mL)∶1(g)的比例加入PBS，置于冰上用粉碎機(jī)粉碎，離心后取上清液，采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.6.3 腦組織中APP、PS1、BACE1和Tau蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用蛋白印跡法，殺鼠后將腦組織加入RIPA緩沖液和PMSF，充分研磨，超聲粉碎，再次加入PMSF，冰上孵育30 min，離心后取上清液，嚴(yán)格根據(jù)說明書測(cè)得蛋白濃度。在SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，取樣量為20 μL，電泳后轉(zhuǎn)移印記至PVDF膜，洗滌液洗滌，封閉液封閉2 h，加入一抗后在搖床中震蕩1.5 h后，4 ℃冰箱孵育過夜，次日回收一抗，洗滌后在搖床中孵育二抗1 h，回收二抗，再次洗滌，曝光取影，觀察各組蛋白表達(dá)水平。

1.7 免疫組化染色

將固定在10%福爾馬林固定液中的腦組織依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、封片和顯微鏡觀察等操作，觀察腦組織海馬區(qū)的形態(tài)及結(jié)構(gòu)差異。

1.8 聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)分析

目前聯(lián)合染毒作用評(píng)價(jià)方式主要有濃度加和模型(CA)、效應(yīng)相加模型(ES)、獨(dú)立作用模型(IA)和聯(lián)合指數(shù)法(CI)[15-16]。為更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本實(shí)驗(yàn)采用效應(yīng)相加模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。該模型假設(shè)各物質(zhì)之間不存在相互作用，將這2種毒物聯(lián)合處理時(shí)的毒性效應(yīng)作為“實(shí)測(cè)值”，單獨(dú)處理時(shí)的毒效應(yīng)作為“預(yù)測(cè)值”，2個(gè)值進(jìn)行顯著性差異分析判斷其聯(lián)合作用；若該項(xiàng)指標(biāo)實(shí)測(cè)值大于預(yù)測(cè)值，聯(lián)合染毒作用表現(xiàn)為協(xié)同作用。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異使用LSD-t的檢驗(yàn)方法，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

空間探索結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠穿臺(tái)次數(shù)明顯高于其他組，目標(biāo)象限停留時(shí)間較長，空間探索具有較強(qiáng)的目的性；DEHP和BPA單獨(dú)作用組小鼠軌跡雜亂，對(duì)于平臺(tái)的記憶能力較弱；聯(lián)合染毒組幾乎不穿過目標(biāo)象限，軌跡極其不規(guī)律，空間探索能力很差；與對(duì)照組相比，差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2和圖1)。

表2 定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期Table 2 Evasion incubation period of positioning navigation experiment n=10)

圖1 各組空間探索實(shí)驗(yàn)活動(dòng)軌跡Fig. 1 The trajectory of each group of space exploration experiments

2.2 避暗和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

與對(duì)照組相比，BPA或DEHP單獨(dú)染毒組以及聯(lián)合染毒組的潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(P<0.05)，聯(lián)合染毒組與其對(duì)應(yīng)的單獨(dú)染毒組比較，其逃避潛伏期與錯(cuò)誤次數(shù)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

2.3 小鼠腦組織MDA含量以及MAO、AchE和CAT活性的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，染毒組MDA含量、MAO和AchE活性逐漸增加，腦組織中CAT活性逐漸降低，具有顯著差異性(P<0.05)；聯(lián)合染毒組與對(duì)應(yīng)的單獨(dú)染毒組相比，MDA含量、MAO和AchE活性明顯增加，CAT活性明顯降低(P<0.05)，實(shí)測(cè)值超過其理論值，表現(xiàn)為協(xié)同作用(表3)。

2.4 小鼠腦組織β、γ-分泌酶活性和Aβ1-42的含量

與對(duì)照組相比，單獨(dú)染毒組與聯(lián)合染毒組的β、γ-分泌酶活性和Aβ1-42的含量增多(P<0.05)，聯(lián)合染毒組與其對(duì)應(yīng)的單獨(dú)染毒組比較，β、γ-分泌酶活性和Aβ1-42的含量增加更明顯(P<0.05)(圖3)。

2.5 蛋白表達(dá)水平

與正常組對(duì)比，單獨(dú)染毒組APP、PS1、BACE1和Tau蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)(P<0.05)，其中，聯(lián)合染毒組APP、PS1、BACE1和Tau的蛋白表達(dá)水平明顯高于單獨(dú)染毒組(P<0.05)(圖4)。

圖2 各組避暗、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)的比較注：a表示與CT組比較，P<0.05；b表示與BPA組比較，P<0.05；c表示與相同劑量DEHP染毒組比較，P<0.05；1表示CT組，2表示BPA組，3表示低DEHP組，4表示中DEHP組，5表示高DEHP組，6表示低DEHP+BPA組，7表示中DEHP+BPA組，8表示高DEHP+BPA組。Fig. 2 Comparison of the latency and the number of errors in the dark avoidance and platform jump experiments in each groupNote: a means compared with CT group, P<0.05; b means compared with BPA group, P<0.05; c means compared with the same dose of DEHP group, P<0.05; 1 indicates CT group; 2 indicates BPA group; 3 indicates low dose DEHP group; 4 indicates medium dose DEHP group; 5 indicates high dose DEHP group; 6 indicates low dose DEHP+BPA group; 7 indicates medium dose DEHP+BPA group; 8 indicates high dose DEHP+BPA group.

表3 小鼠腦組織中丙二醛(MDA)含量、單胺氧化酶(MAO)、乙酰膽堿酯酶(AchE)和過氧化氫酶(CAT)活性的比較Table 3 Comparison of malondialdehyde (MDA) content and the activities of monoamine oxidase (MAO), acetylcholinesterase (AchE) and catalase (CAT) in mouse brain tissue n=10)

圖3 小鼠腦組織中β-分泌酶、γ-分泌酶活性和Aβ1-42含量注：a表示與CT組比較，P<0.05；b表示與BPA組比較，P<0.05；c表示與相同劑量DEHP染毒組比較，P<0.05；1表示CT組，2表示BPA組，3表示低DEHP組，4表示中DEHP組，5表示高DEHP組，6表示低DEHP+BPA組，7表示中DEHP+BPA組，8表示高DEHP+BPA組。Fig. 3 The activities of β-secretase, γ-secretase and Aβ1-42 content in mouse brain tissueNote: a means compared with CT group, P<0.05; b means compared with BPA group, P<0.05; c means compared with the same dose of DEHP group, P<0.05; 1 indicates CT group; 2 indicates BPA group; 3 indicates low dose DEHP group; 4 indicates medium dose DEHP group; 5 indicates high dose DEHP group; 6 indicates low dose DEHP+BPA group; 7 indicates medium dose DEHP+BPA group; 8 indicates high dose DEHP+BPA group.

2.6 腦組織海馬區(qū)HE染色結(jié)果

采用HE染色方法對(duì)小鼠進(jìn)行腦組織石蠟切片并染色，觀察其海馬區(qū)形態(tài)變化及病理性特征。對(duì)照組形態(tài)正常，海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，顏色較淺，形態(tài)正常；單獨(dú)染毒組排列不規(guī)則且雜亂，染色顏色較深。聯(lián)合染毒組與其對(duì)照組相比：其細(xì)胞核較多，顏色較深，呈現(xiàn)出更深的顏色，排列極其不規(guī)則(圖5)。

3 討論(Discussion)

DEHP與BPA經(jīng)常聯(lián)合暴露于職業(yè)環(huán)境和室內(nèi)空氣環(huán)境中，例如，化工行業(yè)用作原料生產(chǎn)的各類塑料制品、醫(yī)療器械和餐飲食品外包裝等[17-18]，二者聯(lián)合毒性作用值得探討。

環(huán)境污染物是近年來影響健康的不可忽視因素，日常暴露的環(huán)境污染物除了損傷呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和肝臟系統(tǒng)外，大腦亦是其攻擊的靶點(diǎn)之一[19]，AD作為最常見的一種神經(jīng)退行性疾病，與環(huán)境污染物的暴露存在密切關(guān)系。Feng等[20]的研究表明，DEHP的潛在神經(jīng)毒性機(jī)制可能與cAMP-PKA-ERK1/2-CREB信號(hào)傳導(dǎo)和Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)途徑協(xié)同介導(dǎo)相關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的APP酶解通路異常存在潛在的關(guān)聯(lián)性。DEHP由于可以通過血腦屏障，接觸后會(huì)在大腦中積累，通過調(diào)節(jié)突觸前膜Ca2+通道的活力對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響；現(xiàn)有研究表明，DEHP是一種過氧化物酶體增殖劑，通過激活生物體內(nèi)過氧化物酶體增殖物從而激活受體(PAPR)，使活性氧為主的各種自由基增加，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激[21-22]，加速細(xì)胞凋亡，與本實(shí)驗(yàn)MDA、CAT、MAO和AchE等生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果相符。研究表明，BPA通過影響神經(jīng)元細(xì)胞的遷移，造成神經(jīng)遞質(zhì)和突觸可塑性的形成障礙，降低海馬體中椎體神經(jīng)元的樹突棘密度，影響突觸可塑性持續(xù)重塑，因此難以建立復(fù)雜的大腦神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)[23]，從而引起認(rèn)知功能障礙和學(xué)習(xí)記憶能力的衰退。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BPA與DEHP均會(huì)對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生消極影響，使其空間定位能力出現(xiàn)障礙，聯(lián)合染毒組神經(jīng)毒性作用明顯高于單獨(dú)染毒組，使用效應(yīng)相加模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

圖4 各組APP、PS1、BACE1和Tau蛋白表達(dá)注：a表示與CT組比較，P<0.05；b表示與BPA組比較，P<0.05；c表示與相同劑量DEHP染毒組比較，P<0.05；1表示CT組，2表示BPA組，3表示低DEHP組，4表示中DEHP組，5表示高DEHP組，6表示低DEHP+BPA組，7表示中DEHP+BPA組，8表示高DEHP+BPA組。Fig. 4 APP, PS1, BACE1 and Tau protein expression in each groupNote: a means compared with CT group, P<0.05; b means compared with BPA group, P<0.05; c means compared with the same dose of DEHP group, P<0.05; 1 indicates CT group; 2 indicates BPA group; 3 indicates low dose DEHP group; 4 indicates medium dose DEHP group; 5 indicates high dose DEHP group; 6 indicates low dose DEHP+BPA group; 7 indicates medium dose DEHP+BPA group; 8 indicates high dose DEHP+BPA group.

圖5 蘇木精-伊紅(HE)染色小鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)Fig. 5 Hematoxylin-Eosin (HE) staining neuron morphology of mouse hippocampus

為進(jìn)一步探討其毒性作用及機(jī)制，對(duì)MDA、CAT、MAO和AchE等生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果提示，隨著DEHP濃度增加，MDA含量、MAO和AchE活性逐漸增加，聯(lián)合染毒組MDA含量、MAO和AchE活性增加明顯，實(shí)測(cè)值超過其理論值，表現(xiàn)為協(xié)同作用。聯(lián)合染毒組與對(duì)照組及單獨(dú)染毒組相比，腦組織中CAT活性逐漸降低，通過觀察其活性可以判斷經(jīng)聯(lián)合染毒處理的小鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷程度更高；提示聯(lián)合染毒處理組的小鼠體內(nèi)活性氧作用增加，抗氧化能力降低，抵抗衰老和認(rèn)知功能障礙的能力減退[24]。神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的正常與穩(wěn)定，是保證學(xué)習(xí)記憶能力的重要環(huán)節(jié)[25-26]；本實(shí)驗(yàn)中生化指標(biāo)結(jié)果顯示染毒處理組小鼠腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與乙酰膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)含量減少，提示其發(fā)生學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

秦晉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，DEHP可引起INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激，使線粒體膜電位降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。異常的細(xì)胞代謝反過來會(huì)影響β-淀粉樣蛋白(amyloid, Aβ)和過度磷酸化Tau蛋白的產(chǎn)生與積累，這會(huì)加劇線粒體功能障礙和活性氧(ROS)的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致惡性循環(huán)[28-29]。Aβ由APP經(jīng)過β、γ-分泌酶水解產(chǎn)生，正常情況下APP經(jīng)α-分泌酶水解產(chǎn)生可溶性的SAPP-α和CTFα，此途徑可阻止Aβ的形成和沉積[30]，而經(jīng)過γ-分泌酶水解會(huì)產(chǎn)生異常的Aβ，目前認(rèn)為Aβ1-42是細(xì)胞外淀粉樣變性的主要成分，神經(jīng)元內(nèi)的病變也與Aβ1-42相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各染毒處理組β、γ-分泌酶活性增加，Aβ1-42含量增加，聯(lián)合染毒組相比單獨(dú)染毒組酶活性增加更為明顯。

APP酶解通路是造成學(xué)習(xí)記憶障礙和AD發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)過度磷酸化的Tau神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)和細(xì)胞外淀粉樣老年斑(SP)是AD的主要病理變化特征[29](圖6)。神經(jīng)原纖維纏結(jié)的主要成分是異常沉積的tau蛋白，SP的核心成分是Aβ[31-32]。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定相關(guān)生化指標(biāo)及蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)DEHP與BPA聯(lián)合染毒對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷作用與APP酶解通路異常有關(guān)。

圖6 淀粉樣前體蛋白(APP)酶解通路示意圖Fig. 6 Schematic diagram of amyloid precursor protein (APP) processing pathway

聯(lián)合染毒毒性作用評(píng)價(jià)目前主要有濃度加和模型(CA)、效應(yīng)相加模型(ES)、獨(dú)立作用模型(IA)和聯(lián)合指數(shù)法(CI)[15-16]。本次實(shí)驗(yàn)選擇了效應(yīng)相加模型判斷，通過效應(yīng)相加模型研究可知，DEHP與BPA二者聯(lián)合染毒，毒性作用增強(qiáng)，表現(xiàn)為協(xié)同作用，這與化學(xué)毒物自身的結(jié)構(gòu)及內(nèi)部相關(guān)反應(yīng)結(jié)合有關(guān)，有待于進(jìn)一步探討。未來降低環(huán)境污染物的重要途徑可以是研發(fā)DEHP和BPA的替代品，從根源上降低環(huán)境污染物對(duì)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等方面的損害作用，從而降低和避免環(huán)境污染物聯(lián)合暴露對(duì)人類造成的損害。

綜上所述，BPA與DEHP聯(lián)合染毒對(duì)小鼠腦組織具有明顯的神經(jīng)毒性作用，其聯(lián)合作用表現(xiàn)為協(xié)同作用，造成小鼠的認(rèn)知功能障礙，損傷神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，機(jī)制可能與氧化應(yīng)激及APP酶解通路異常相關(guān)，更深的分子生物學(xué)機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

通訊作者簡介：許妍姬(1973—)，女，博士，教授，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)毒理學(xué)。