程漢

關(guān)鍵詞：禽流感;免疫抗體;血凝;血凝抑制試驗(yàn)

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 1%紅細(xì)胞懸液

采集至少3只SPF公雞或無(wú)禽流感或新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用PH7.2、0.01mol/LPBS液或生理鹽水洗滌3次，每次均以1000r/min，洗滌后用PBS或生理鹽水配制成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 診斷液

標(biāo)準(zhǔn)禽流感（H4、H6）病毒抗原、標(biāo)準(zhǔn)禽流感（H4、H6）陽(yáng)性血清，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疫病診斷液制備中心提供。

1.1.3 儀器

96孔V型微量反應(yīng)版，移液器，微量振蕩器等。

1.1.4 被檢血清樣品

來(lái)自睢寧縣各地相當(dāng)規(guī)模的雞場(chǎng)的雞群，每個(gè)雞群隨機(jī)采取健康雞血樣，翅靜脈采血2ml/羽，20℃以下氣溫24h后大部分血清自動(dòng)析出，可直接檢測(cè)，不能自動(dòng)析出的則進(jìn)行離心分離血清，當(dāng)天來(lái)不及檢測(cè)的則將血清分離至4℃保存。

1.2 檢測(cè)方法及步驟

該試驗(yàn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的試驗(yàn)方法，用來(lái)檢測(cè)禽血清中的免疫抗體。按照《GB/T18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)》采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)，利用血凝素（HA）蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細(xì)胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，用來(lái)檢測(cè)禽血清中的免疫抗體，在進(jìn)行HI試驗(yàn)之前必須先進(jìn)行HA試驗(yàn)，以確定HI試驗(yàn)中所用抗原的HA滴度。完成HA試驗(yàn)后，以4個(gè)HA單位的抗原進(jìn)行HI試驗(yàn)，以完全抑制4個(gè)血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度，抗體效價(jià)以㏒2表示。

1.2.1 血凝（HA）試驗(yàn)

（1）在v型微量反應(yīng)板的1～12孔均加入0.025ml

PBS或者生理鹽水。

（2）吸取0.025mL病毒懸液（病毒抗原），加入第1孔，混勻。

（3）從第1孔吸取25ul病毒懸液加入第2孔，混勻后吸取25ul加入第3孔，如此進(jìn)行倍比稀釋至11孔，從第11孔吸取25ul，棄去。

（4）每孔加入25ul的生理鹽水。

（5）每孔加入25ul 1﹪雞紅細(xì)胞懸液（紅細(xì)胞懸液充分混勻）。

（6）振蕩搖勻，在溫室下靜置40min后觀察結(jié)果 。對(duì)照紅細(xì)胞將成明顯的紐扣狀沉到孔底。

結(jié)果判定：將血凝板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無(wú)呈淚滴狀流淌，完全血凝（不流淌）的抗原或者病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位。

1.2.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)

根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4HUA的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HUA的抗原的稀釋倍數(shù)。

（1）在微量反應(yīng)板的1～11孔加入25ul、第12孔加入50ul的生理鹽水。

（2）吸取25ul血清加入第一孔，充分混勻后吸25ul于第二孔，依次對(duì)比稀釋至第10孔，棄去25ul。

（3）1～11孔均加入含4HUA混勻的病毒抗原液25ul，溫室靜置至少30min。

（4）每孔加入25ul1﹪紅細(xì)胞懸液，輕輕混勻，室溫靜置40min。

結(jié)果判定：將血凝板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無(wú)呈淚滴狀流淌。以完全抑制4個(gè)HAU的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴數(shù)。

2 統(tǒng)計(jì)

根據(jù)血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)來(lái)如實(shí)統(tǒng)計(jì)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)的雞群禽流感免疫抗體合格率。（各鎮(zhèn)血清樣本數(shù)量是20，各鎮(zhèn)合格率達(dá)到90%以上即為合格）

H6總體合格率為91.77%

3 大規(guī)模免疫抗體監(jiān)測(cè)在防疫中思考與討論

近幾年來(lái)，隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，畜禽飼養(yǎng)量日益增加，集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)層出不窮，有的村組幾乎每個(gè)農(nóng)戶(hù)家中都養(yǎng)雞，雞舍一幢挨著一幢，且雞群的批次多、品種不一、雞群的免疫時(shí)間不同等因素，一旦發(fā)生疫情，將會(huì)產(chǎn)生“多米諾骨牌”效應(yīng)，損失慘重，甚至血本無(wú)歸。因此為防止疫情的發(fā)生，避免損失，最重要的是做好免疫工作，并確保免疫雞群的抗體在免疫保護(hù)范圍內(nèi)，同時(shí)做好生物安全管理工作。但在實(shí)際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖從業(yè)人員素質(zhì)參差不齊，養(yǎng)殖數(shù)量多、批次多、疫苗種類(lèi)繁多、免疫程序混亂，導(dǎo)致免疫工作存在諸多問(wèn)題，如應(yīng)免未免、免疫接種的途徑錯(cuò)誤、免疫劑量較少（拔針?biāo)俣冗^(guò)快）、超量頻繁免疫造成免疫麻痹等等，其最終的結(jié)果就是免疫失敗，免疫后的抗體沒(méi)有達(dá)到應(yīng)有的保護(hù)水平。而如何判斷雞群的抗體水平是否達(dá)到保護(hù)雞群且不發(fā)生疫病，抗體監(jiān)測(cè)是唯一最直接、最有效的手段。

3.1 抗體監(jiān)測(cè)能及時(shí)了解雞群免疫后的免疫效果

當(dāng)疫苗接種到動(dòng)物體內(nèi)后，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的反應(yīng)之后才能夠產(chǎn)生保護(hù)，而這種保護(hù)力的產(chǎn)生往往又容易受到多種因素的影響，如疫苗方面、動(dòng)物方面、接種方式方法及時(shí)機(jī)選擇、飼養(yǎng)管理以及環(huán)境等，每一個(gè)方面出現(xiàn)變化都有可能對(duì)免疫效果產(chǎn)生或多或少的影響。加之動(dòng)物體的免疫應(yīng)答過(guò)程是以一種人們?nèi)庋劭床坏?、摸不著的方式進(jìn)行的，因此在對(duì)動(dòng)物接種疫苗之后，究竟體內(nèi)的免疫應(yīng)答情況如何，產(chǎn)生的保護(hù)情況怎樣，雖然涉及的方面很多，但起決定作用的還是針對(duì)該接種抗原所產(chǎn)生的抗體，抗體滴度或效價(jià)的高低直接影響著免疫效果，因此對(duì)雞群及時(shí)采血檢測(cè)抗體上升情況，從監(jiān)測(cè)即時(shí)抗體水平或抗體水平的動(dòng)態(tài)變化，來(lái)判斷雞群接種疫苗的免疫效果能否抵抗與疫苗相對(duì)應(yīng)的疫病，免疫完成后只有通過(guò)抗體檢測(cè)免疫效果，才能有效控制疾病的發(fā)生。

3.2 定期進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)，可以根據(jù)抗體滴度的高低及時(shí)進(jìn)行免疫

體內(nèi)抗體水平會(huì)隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降到保護(hù)值以下，定期檢測(cè)雞群的抗體水平，根據(jù)抗體滴度的高低確定加強(qiáng)免疫的時(shí)間。系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)可更多地掌握各類(lèi)疫病的抗體變化規(guī)律，及時(shí)做好免疫工作和時(shí)間安排，確保雞群抗體始終處于免疫保護(hù)水平以上，方能發(fā)揮最佳的生產(chǎn)性能。

3.3 根據(jù)抗體監(jiān)測(cè)的結(jié)果，制定和調(diào)整雞群的免疫程序

免疫程序受母源抗體和自身抗體水平、免疫時(shí)間、免疫方法、疫苗種類(lèi)、免疫次數(shù)和當(dāng)?shù)匾卟×餍星闆r等因素的影響。良好免疫效果的獲得依賴(lài)于首次免疫和再次免疫時(shí)機(jī)是否合適，母源抗體水平?jīng)Q定首次免疫的時(shí)間，再次免疫時(shí)體內(nèi)的殘留抗體水平?jīng)Q定再次免疫的時(shí)間。由于各方面的影響，一個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的免疫程序今年、明年適合，后年可能就不太適合，須隨時(shí)加以調(diào)整修訂。一些場(chǎng)照搬其他場(chǎng)免疫程序，或連年不變的做法難免有時(shí)免疫失誤而引發(fā)疫病的流行。因此，不能機(jī)械地仿效其他場(chǎng)的免疫程序，而應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)匾咔榍闆r結(jié)合上一代次的免疫情況，以所測(cè)的實(shí)際抗體水平為依據(jù)，制定適合本場(chǎng)的免疫程序，并隨時(shí)監(jiān)測(cè)、及時(shí)修訂。

3.4 抗體監(jiān)測(cè)可提示某些疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)

如新城疫、禽流感抗體超過(guò)13log2，雞群有可能感染了病毒;低于4log2則不足以抵抗病毒的侵襲。采血檢測(cè)發(fā)病前后雞群的抗體水平，剛發(fā)病時(shí)新城疫或禽流感抗體水平低，大部分雞抗體水平在保護(hù)值以下，離散度在5個(gè)以上。病情恢復(fù)時(shí)的抗體上升3～5個(gè)滴度以上，且高于免疫所產(chǎn)生的抗體，提示該雞群可能發(fā)生了新城疫或禽流感。

總之，動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)是動(dòng)物疫病防治工作中最重要的技術(shù)手段，是預(yù)防、控制直至根除動(dòng)物疫病的基礎(chǔ)性工作。只有通過(guò)長(zhǎng)期、連續(xù)、可靠地監(jiān)測(cè)，才能及時(shí)準(zhǔn)確地掌握動(dòng)物疫病的發(fā)生和流行趨勢(shì)，制定并實(shí)施國(guó)家動(dòng)物疫病預(yù)防、控制措施，界定動(dòng)物疫情的發(fā)生范圍、數(shù)量和疫源等疫情信息。

3.5 通過(guò)調(diào)查免疫抗體不合格的禽群分析原因

主要是養(yǎng)殖戶(hù)僥幸，怕麻煩，隱瞞未防疫的真相，二是未按照程序。三是免疫方法不當(dāng)，用苗劑量不足。通過(guò)這次大規(guī)模的免疫抗體檢測(cè)，找出我縣禽流感免疫工作中存在的問(wèn)題和不足。針對(duì)存在問(wèn)題，我們對(duì)免疫不合格的禽群逐戶(hù)監(jiān)督進(jìn)行補(bǔ)免。

3.6 引起抗體效價(jià)不同的原因

家禽機(jī)體免疫系統(tǒng)是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)，由免疫器官、免疫細(xì)胞組成。用疫苗對(duì)家禽進(jìn)行免疫接種，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生特異免疫力。機(jī)體受到抗原物質(zhì)（疫苗）刺激后，由免疫器官、免疫細(xì)胞產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白即抗體，具有各種免疫功能，主要存在于機(jī)體的血液、淋巴液、組織液中，并以血液中抗體存在最高，血清抗體即循環(huán)抗體是主要免疫力。根據(jù)抗體產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)，動(dòng)物機(jī)體初次和再次接觸抗原后，引起體內(nèi)產(chǎn)生抗體的水平有較大差異，機(jī)體初次接觸抗原，在一定時(shí)期內(nèi)體內(nèi)抗體產(chǎn)生很少，抗體水平維持時(shí)間也較短。免疫還具有記憶功能，動(dòng)物機(jī)體在初次接觸抗原物質(zhì)時(shí)，除刺激機(jī)體形成產(chǎn)生抗體外，也形成了免疫記憶細(xì)胞，對(duì)再次接觸的相同抗原物質(zhì)可產(chǎn)生更快的免疫應(yīng)答，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體第二次接觸相同的抗原時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生的抗體，含量高，而且維持時(shí)間長(zhǎng)。因此，在對(duì)肉雞進(jìn)行初次免疫后由于免疫系統(tǒng)是初次應(yīng)答，加上母源抗體的干擾，因而血清抗體產(chǎn)生慢，數(shù)量少，抗體效價(jià)普遍較低;而蛋雞由于在首次免疫禽流感疫苗后，機(jī)體對(duì)該種疫苗已具有免疫記憶，當(dāng)再次用此種疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫時(shí)，機(jī)體可迅速產(chǎn)生比上次免疫時(shí)更多的抗體，抗體效價(jià)普遍較高。同時(shí)，禽流感疫苗屬油乳劑滅活疫苗，滅活疫苗不同于活疫苗，滅活疫苗特性是接種后不能在動(dòng)物體內(nèi)繁殖，使用安全，但滅活苗接種劑量較大，免疫期相對(duì)短，并需要重復(fù)接種。

通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖戶(hù)禽流感免疫抗體的全面監(jiān)測(cè)，使每個(gè)養(yǎng)禽戶(hù)對(duì)自己禽群的實(shí)際免疫效果有一個(gè)真正地了解，大多數(shù)免疫不合格的養(yǎng)禽戶(hù)能認(rèn)真分析免疫工作中存在的問(wèn)題，更加堅(jiān)信科學(xué)免疫，按程序免疫的決心。對(duì)少數(shù)抱有僥幸心理，不按規(guī)定免疫的抗體不達(dá)標(biāo)的養(yǎng)禽戶(hù)在監(jiān)督補(bǔ)免后15～20d再次進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè);對(duì)個(gè)別拒防疫用戶(hù)，通過(guò)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)介入，實(shí)行強(qiáng)制免疫，同時(shí)鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)站與拒防戶(hù)簽訂免疫責(zé)任狀，真正使高致病性禽流感免疫工作實(shí)行強(qiáng)制化。全面進(jìn)行禽流感抗體免疫檢測(cè)，需要花費(fèi)大量的人力，物力，單靠市獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督所很難做到，我們的做法是在每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)培訓(xùn)2～3名能力強(qiáng)的防疫員負(fù)責(zé)血樣工作。

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