顧夢云，曾偉達(dá)，黃明翅，宿慶連，馮肖梅，劉艷艷，張雪蓮，周曉云

（廣州花卉研究中心，廣東 廣州 510360）

【研究意義】粗肋草（Aglaonema commutatum）是天南星科（Araceae）粗肋草屬（Aglaonema）多年生草本觀葉植物［1］，較耐蔭，觀葉觀賞期長［2］，作為家庭小盆栽廣泛用于室內(nèi)。紅葉粗肋草是近年來國內(nèi)較為流行的彩葉品種之一，因其葉片具有較大的紅色斑塊、中肋粗大、色彩鮮艷亮麗，能夠填補(bǔ)淡花季節(jié)室內(nèi)外單調(diào)色彩的不足［3-4］，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，紅葉粗肋草的種植及市場前景看好。隨著紅葉粗肋草種苗產(chǎn)量的逐年增多，部分紅葉粗肋草品種種苗和成品盆花易出現(xiàn)葉色褪紅返綠、葉色紅艷程度不高等問題，極不利于紅葉類粗肋草品種的大量生產(chǎn)和推廣。紅葉粗肋草繁殖方式主要有分株繁殖、扦插繁殖和組培快繁等，分株、扦插這兩種傳統(tǒng)繁殖方式因有傷口處理不當(dāng)容易受病原菌或病毒的重復(fù)感染［5］，繁殖速率也相應(yīng)較低［6］；組培快繁日益成為粗肋草種苗供應(yīng)的主要方式，但通過組培快繁方式繁育的紅葉粗肋草種苗的葉色和紅艷度一直存在不穩(wěn)定性，成為粗肋草種苗繁殖和促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制瓶頸。因此，通過研究紅葉粗肋草在組織培養(yǎng)過程中影響葉色的因素，對保持其葉片色彩紅艷度、提高組培生產(chǎn)效率具有非常重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高等植物葉片中的光合色素主要包括葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮和花青素等［7］，所含色素的種類、比例和分布位置是影響其葉色變化的直接因素［8-9］，花色素苷是引起植物葉片呈紅色的主要物質(zhì)［10］，其含量變化受植物自身遺傳特性［9］、營養(yǎng)物質(zhì)含量［11］、外界環(huán)境光照［12-13］、溫度［14］、干旱脅迫［15］等因素影響。王萌等［10］研究發(fā)現(xiàn)園林樹木葉片呈現(xiàn)不斷變紅的趨勢，主要是由可溶性糖不斷積累促進(jìn)花色素苷合成、花色素苷含量與葉綠素含量比值不斷上升造成的；徐莉莉等［11］發(fā)現(xiàn)初夏噴施0.3%KH2PO4溶液可促進(jìn)紅葉桃葉片花色素苷含量的增加（保持紅色）；楊露等［12］發(fā)現(xiàn)充足光照更有利于紫葉風(fēng)箱果葉片呈色。然而，研究影響紅葉類粗肋草葉色因素的相關(guān)報(bào)道較少，且主要集中在光照和溫度條件對彩葉粗肋草小苗和盆花［3,14］生長時期葉色的影響研究方面，而組織培養(yǎng)階段對其葉色穩(wěn)定影響因素的研究尚未見報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】以紅葉的廣花紅粗肋草為研究對象，針對其組培快繁方式繁育種苗葉色和紅艷度存在不穩(wěn)定性以及組培工廠化生產(chǎn)效率需進(jìn)一步提高等問題，從紅葉粗肋草組織培養(yǎng)的增殖培養(yǎng)基、增殖方式和培養(yǎng)條件（光照）等方面，探究紅葉粗肋草組織培養(yǎng)過程中影響葉色的因素?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討在組培環(huán)節(jié)保持其葉片色彩鮮艷程度的可行性，為進(jìn)一步穩(wěn)定紅葉類粗肋草高效組培技術(shù)及調(diào)控葉色提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料廣花紅粗肋草，為廣州花卉研究中心自主選育品種，組織培養(yǎng)材料均以廣花紅粗肋草莖段為外植體誘導(dǎo)而來。試驗(yàn)于2019 年11 月至2021 年10 月在廣州花卉研究中心從化基地組培實(shí)驗(yàn)室和溫室大棚進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 增殖培養(yǎng)基比較試驗(yàn) 供試基本培養(yǎng)基包括MS、1/2MS、改良MS（NH4NO3含量減半）3 種，分別添加0、0.5、1.0 g/L K2SO4，共9 種培養(yǎng)基組合（表1）。每種培養(yǎng)基均添加0.2 mg/L KT、3.0 mg/L 6-BA、0.02 mg/L IBA、30 g/L 蔗糖和5.5 g/L瓊脂，pH 6.0。

將經(jīng)過150 d 誘導(dǎo)的廣花紅粗肋草愈傷組織塊剪切成1.5 cm×1.5 cm 大小一致的方形小塊，每個小塊具4 個長1 cm 小芽，分別接種到9 種培養(yǎng)基中，每瓶4 塊，每個處理30 瓶。測量增殖分化的單株苗，每個處理測30 株，測量株高、葉長和葉寬，觀察葉色和葉形，將葉片中紅色斑塊剪出，用葉形紙稱重法計(jì)算紅色斑塊占葉面積比例（分＜ 20%、20%～50%、50%～80%、＞ 80% 4個等級）；將分化出的單株苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，40 d 后移植到溫室大棚種植，120 d 后統(tǒng)計(jì)成苗率。

成苗率（%）＝（葉色紅艷、生長狀況良好、無變異的正常苗株數(shù)/種植總株數(shù)）×100

1.2.2 增殖方式比較試驗(yàn) 將滅菌后的廣花紅粗肋草外植體分別采用愈傷組織增殖、叢生芽增殖兩種增殖方式進(jìn)行增殖擴(kuò)繁，愈傷組織塊剪切成1.5 cm×1.5 cm 大小一致的方形小塊，每個小塊具4個長1 cm小芽，叢生芽每一叢具4個長1 cm小芽，每個處理10 瓶，后全部轉(zhuǎn)接生根培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光照時間10 h/d，溫度25（±1）℃，40 d 后轉(zhuǎn)移到溫室大棚種植，120 d 后統(tǒng)計(jì)兩種增殖方式繁育苗的成苗率。

1.2.3 光照強(qiáng)度比較試驗(yàn) 將增殖分化和生根培養(yǎng)階段的廣花紅粗肋草無菌瓶苗分別放在3 000、4 000 lx 的光照條件下培養(yǎng)，光照時間10 h/d，溫度25（±1）℃，每個處理30 瓶。增殖培養(yǎng)50 d后，測量增殖分化出的單株苗株高、葉長、葉寬，每個處理測定30 株；繼續(xù)轉(zhuǎn)生根培養(yǎng)40 d，觀察葉色，統(tǒng)計(jì)紅色斑塊占葉面積比例，然后全部移植到溫室大棚，120 d 后按1.2.1 方法統(tǒng)計(jì)成苗率。

1.2.4 光質(zhì)比較試驗(yàn) 設(shè)白光（LED 燈）、紅光、紅光∶藍(lán)光=7 ∶3、紅光∶藍(lán)光=5 ∶5、紅光∶藍(lán)光=3 ∶7、藍(lán)光、紫光共7 個處理，光照時間為10 h/d，溫度為25（±1）℃。將增殖分化和生根培養(yǎng)階段的廣花紅粗肋草無菌瓶苗分別放在以上7 種光質(zhì)處理?xiàng)l件下培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)50 d，每個處理30 瓶，然后繼續(xù)轉(zhuǎn)生根培養(yǎng)40 d。觀察組培苗葉色，取從上往下第1～2 片平展葉，測定葉綠素、花色素苷含量。其中，葉綠素提取和含量測定參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》［16］方法，花色素苷提取和含量測定參照王佳婉［17］和劉曉東等［18］方法。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 辦公軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS 9.2 進(jìn)行方差分析和多重比較（Duncan）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同增殖培養(yǎng)基對紅葉粗肋草增殖分化苗生長及葉色的影響

9 種不同的培養(yǎng)基配方增殖培養(yǎng)結(jié)果（表1）顯示，采用3 種不同基本培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)（未添加K2SO4），MS 培養(yǎng)基和改良MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖分化苗的株高、葉長和葉寬均顯著高于1/2MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)植株。其中，MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的增殖分化苗株高（3.44 cm）、葉長（3.29 cm）、葉寬（2.11 cm）均為最高；葉片紅色斑塊占比以1/2MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的最大，但該處理組培苗的成苗率最低、為66.67%，而改良MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的成苗率最高、為89.89%。增殖所用基本培養(yǎng)基配方對粗肋草增殖分化苗的生長量、葉色、組培苗成苗率均有影響，且MS 培養(yǎng)基和改良MS 培養(yǎng)基顯著優(yōu)于1/2MS 培養(yǎng)基；1/2MS 培養(yǎng)基和添加0.5 g/L K2SO4的改良MS 培養(yǎng)基增殖分化苗的葉片紅色斑塊最多，但由于1/2MS 培養(yǎng)基增殖分化苗矮小且不夠健壯、成苗率最低，因此不適于增殖培養(yǎng)。

表1 不同增殖培養(yǎng)基對紅葉粗肋草增殖分化苗生長及葉色的影響Table 1 Effects of different culture medium on growth and leaf color of proliferation and differentiation seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

在同一種基本配方培養(yǎng)基中，添加0、0.5、1.0 g/L K2SO4對增殖分化苗的株高、葉長和葉寬的影響差異不顯著，但對分化苗葉片紅色斑塊占比和種植成苗率影響明顯。其中，1/2MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)植株的紅色斑塊占比最大，但其種植成苗率均比其他兩種基本配方培養(yǎng)基低；且添加0.5 g/L K2SO4的改良MS 培養(yǎng)基分化苗的紅色葉片斑塊占比與1/2MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的一樣，種植成苗率則在所有配方中最高（90.00%）。

綜合上述分析，僅從穩(wěn)定葉色上考慮，1/2 MS培養(yǎng)基和改良MS 培養(yǎng)基可用于紅葉粗肋草增殖培養(yǎng)，但改良MS 培養(yǎng)基成苗率顯著高于1/2 MS培養(yǎng)基，且種苗長勢整體優(yōu)于1/2 MS 培養(yǎng)基，尤其是添加了0.5 g/L 的改良MS 培養(yǎng)基分化苗的葉片紅色斑塊較多，瓶苗植株健壯，種植成苗率最高，增殖培養(yǎng)能保持葉色紅艷度，綜合比較最優(yōu)。

2.2 不同增殖方式對紅葉粗肋草增殖效率和組培苗生長及葉色的影響

由表2 可知，愈傷組織增殖方式前期經(jīng)過3次轉(zhuǎn)接，于150 d 后誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織再經(jīng)過2 次增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)為1.5～2.0，增殖培養(yǎng)100 d，共計(jì)250 d 后分化出芽，每個愈傷組織塊可分化出4～5 個芽，芽個數(shù)較多（圖1A）。叢生芽增殖方式，由外植體直接誘導(dǎo)出芽需50 d，后進(jìn)行叢生芽增殖培養(yǎng)，增殖4 次，增殖系數(shù)為2.5～3.0，增殖培養(yǎng)200 d，共計(jì)250 d 后叢生芽較健壯（圖1B）?？梢姡鷤M織增殖方式前期愈傷組織誘導(dǎo)時間較長，叢生芽增殖方式前期需要進(jìn)行叢生芽增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)250 d 后均可進(jìn)入生根培養(yǎng)階段，兩種增殖方式的增殖效率差異不大。

從表2 和圖1 可以看出，經(jīng)叢生芽增殖方式培養(yǎng)的紅葉粗肋草組培生根苗葉色優(yōu)于愈傷組織增殖方式，叢生芽增殖方式的紅葉粗肋組培生根苗成苗率為83.33%，明顯高于愈傷組織增殖方式，且叢生芽增殖方式的組培生根苗穴盤種植后長勢較均勻，葉片紅艷度高的植株較多，整體葉色優(yōu)于愈傷組織增殖方式?？梢?，通過叢生芽增殖方式，其組培分化芽較健壯，能更有效保持葉色穩(wěn)定性。

表2 不同增殖方式對紅葉粗肋草增殖效率和組培苗生長及葉色的影響Table 2 Effects of different propagation modes on proliferation efficiency,tissue culture seedling growth and leaf color of Aglaonema commutatum with red leaves

圖1 不同增殖方式對紅葉粗肋草組培苗生長及葉色的影響Fig.1 Effects of different propagation modes on the growth and leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

2.3 不同光照強(qiáng)度對紅葉粗肋草組培苗生長量及葉色的影響

從表3 可以看出，3 000 lx 光照強(qiáng)度處理紅葉粗肋草組培苗的株高為3.42 cm，顯著高于4 000 lx 處理，其葉寬1.89 cm、葉長2.49 cm，葉寬/葉長0.77，均小于4 000 lx 光照強(qiáng)度處理；可見，3 000 lx 光照強(qiáng)度處理的組培苗植株較細(xì)高、葉面積較小，植株葉片偏長圓型，4 000 lx 光照強(qiáng)度處理的組培苗植株較矮壯、葉面積大、葉片偏圓。葉色方面，3 000 lx 光照強(qiáng)度處理的紅葉粗肋草生根苗葉片紅色偏淡，紅色斑塊占比較?。▓D2A）；4 000 lx 光照強(qiáng)度處理的紅葉粗肋草生根苗紅色斑塊占比大，葉色較紅（圖2B）。移栽種植后，4 000 lx 光照強(qiáng)度處理的紅葉粗肋草生根苗種植成苗率為88.89%，明顯高于3 000 lx 光照強(qiáng)度處理。結(jié)果表明，4 000 lx 光照強(qiáng)度處理的紅葉粗肋草組培苗更加矮壯，生根苗葉片呈色更佳，種植成苗率更高，更適合用于紅葉粗肋草組培光照培養(yǎng)。

圖2 不同光照強(qiáng)度對紅葉粗肋草組培苗葉色的影響Fig.2 Effects of different light intensity on leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

表3 不同光照強(qiáng)度對紅葉粗肋草組培苗生長量及葉色的影響Table 3 Effects of different light intensity on growth and leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

2.4 不同光質(zhì)條件對紅葉粗肋草組培苗葉色的影響

從7 個不同光質(zhì)處理對紅葉粗肋草葉片光合色素含量的影響結(jié)果（表4）可以看出，經(jīng)紅光照射的組培苗葉片葉綠素a+b 含量最高、為0.058 mg/g，與經(jīng)白光、紫光照射的組培苗葉片葉綠素a+b 含量差異不顯著，但顯著高于其他光照處理；其葉片花色素苷相對含量最低、為0.056 Units/g，與經(jīng)白光、紫光照射的組培苗花色素苷相對含量差異不顯著，但明顯低于其他光照處理。經(jīng)紅光∶藍(lán)光=3 ∶7 照射的組培苗葉片葉綠素a+b 總含量最低、為0.037 mg/g，與經(jīng)藍(lán)光照射的組培苗葉綠素a+b 總含量差異不顯著，均顯著低于其他光質(zhì)處理；其葉片花色素苷相對含量最高、為0.399 Units/g，均顯著高于其他處理。結(jié)果表明，紅光不利于紅葉粗肋草組培苗葉片花色素苷的積累，葉色最差，葉片呈綠白色（圖3B）；藍(lán)光在一定光質(zhì)比例條件下可促進(jìn)組培苗葉片花色素苷的積累，其中紅光∶藍(lán)光=3 ∶7 處理的組培苗葉片花色素苷相對含量最高，葉色紅艷（圖3E），其次是純藍(lán)光、紅光∶藍(lán)光=7 ∶3、紅光∶藍(lán)光=5 ∶5 處理。

圖3 不同光質(zhì)條件對紅葉粗肋草組培苗葉色的影響Fig.3 Effects of different light quality conditions on leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

表4 不同光質(zhì)條件對紅葉粗肋草組培苗葉片光合色素含量的影響Table 4 Effects of different light quality conditions on photosynthetic pigment content in tissue culture seedling leaves of Aglaonema commutatum with red leaves

3 討論

植物組織培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基中包含有植物所需的大量元素、微量元素、激素等，同時根據(jù)品種特性及生產(chǎn)實(shí)際進(jìn)行優(yōu)化，如大量元素減半的1/2MS 培養(yǎng)基、減少NH4NO3含量的改良MS 培養(yǎng)基、富K 的MS 培養(yǎng)基等。在本研究中，采用1/2MS 培養(yǎng)基增殖分化的紅葉粗肋草組培苗過于弱小、移栽淘汰率高，因此不適合用于紅葉粗肋草的增殖培養(yǎng)。大量元素除滿足植物生長外，對植株葉片色素含量也有一定影響，植物葉片中很大一部分氮結(jié)合在葉綠素中［19］，胡靜靜等［20］、孫澤晨等［21］研究表明，N 元素與黃連木、紅葉南天竹葉片中的葉綠素含量呈正相關(guān)，與其葉片中的花色素苷含量呈負(fù)相關(guān)；K 元素可以通過促進(jìn)糖的合成和運(yùn)輸，提高紅葉石楠葉片中的花色素苷含量［22-23］，李小康等［24-25］研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施3‰KH2PO4后中紅楊葉片顏色更鮮艷。本研究采用增加0.5 g/L K2SO4的改良MS 培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)紅葉粗肋草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)增殖分化苗葉色紅艷，與上述研究結(jié)果較一致。

不同植物可采用不同的組培增殖方式。例如，紅掌一般通過誘導(dǎo)愈傷組織再分化不定芽方式進(jìn)行擴(kuò)繁［26］；黑果枸杞誘導(dǎo)愈傷組織的分化能力較弱，通過萌發(fā)基莖叢生芽的方式增殖效果更好［27］；粗肋草通過愈傷組織增殖和叢生芽增殖兩種方式均可進(jìn)行增殖擴(kuò)繁［28-31］，本研究中兩種方式的增殖效率表現(xiàn)大致相同，但通過叢生芽增殖方式增殖的芽更加健壯、生根苗葉片顏色更穩(wěn)定、移栽成苗率明顯高于愈傷誘導(dǎo)增殖方式，這與劉麗鋒等［32］“以大花蕙蘭莖尖作為外植體，不經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)可直接誘導(dǎo)叢生芽，是一種變異率低的快繁方法”的結(jié)論相一致。

光照是影響彩葉植物呈色的重要環(huán)境因素，葉片中的色素含量和比例均受光照強(qiáng)度和光質(zhì)因素影響［3,8］。周佐葡等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在光照強(qiáng)度1 000～4 000 lx 范圍內(nèi)，隨著光照強(qiáng)度增加，如意和煙花紅葉粗肋草小苗葉色越艷麗，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，4 000 lx 光照強(qiáng)度處理的組培苗相比3 000 lx 光照強(qiáng)度處理的組培苗，葉片呈色更佳。王冬雪［33］研究表明紅光處理可以促進(jìn)楓香幼苗葉片葉綠素合成，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似，本研究表明紅光條件下，紅葉粗肋草組培苗葉片葉綠素總含量最高。范皓月［34］研究發(fā)現(xiàn)紅光最有利于紅葉腺柳葉片呈現(xiàn)紅色，藍(lán)光和綠光會促使紅葉轉(zhuǎn)綠，本試驗(yàn)中紅光不利于紅葉粗肋草組培苗葉片花色素苷的積累，葉片呈綠白色，藍(lán)光在一定比例條件下可促進(jìn)葉片花色素苷的積累，其中以紅光∶藍(lán)光=3 ∶7（30%R ∶70%B）處理葉片花色素苷含量最高，與范皓月結(jié)論不一致，這可能是由于不同植物的色素系統(tǒng)對不同波長范圍的光具有吸收特異性，從而使不同植物對不同光質(zhì)的反應(yīng)存在差異［35］。

本試驗(yàn)研究雖然對紅葉粗肋草組織培養(yǎng)的增殖培養(yǎng)基、增殖方式和光照條件進(jìn)行了葉色影響因素分析，但紅葉粗肋草的葉色穩(wěn)定性還受自身遺傳特性影響，我們在紅葉粗肋草組織培養(yǎng)采用的外植體跟蹤調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，采用不同批次外植體組織培養(yǎng)的紅葉粗肋草組培苗也存在一定差異，外植體遺傳性狀穩(wěn)定是紅葉粗肋草品種進(jìn)行穩(wěn)定無性繁殖的前提，是保證后續(xù)紅葉粗肋草種苗和盆花生產(chǎn)質(zhì)量的重要因素，本研究未涉及紅葉粗肋草葉色遺傳學(xué)研究，后期還應(yīng)加強(qiáng)對紅葉粗肋草葉色基因調(diào)控的研究，結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)手段，繁育出葉色更加穩(wěn)定的粗肋草品種和種苗。

4 結(jié)論

綜上，紅葉粗肋草組織培養(yǎng)的增殖培養(yǎng)基、增殖方式、光照條件，均對其葉色有影響。增殖培養(yǎng)基選擇0.5 g/L K2SO4的改良MS 培養(yǎng)基，紅葉粗肋草增殖分化苗健壯，葉片紅色斑塊占比在80%以上，成苗率為90.00%；與愈傷組織增殖方式相比，叢生芽增殖方式能更有效保持紅葉粗肋草組培苗葉色穩(wěn)定性，且組培苗移栽成苗率比愈傷組織增殖方式高12.22%；光照強(qiáng)度為4 000 lx，紅葉粗肋草組培苗紅色斑塊面積增大，移栽成苗率達(dá)89.99%；合理調(diào)節(jié)紅藍(lán)光比例，可增加紅葉粗肋草組培苗葉片花色素苷相對含量，其中紅光∶藍(lán)光=3 ∶7 光質(zhì)處理最佳，葉片葉綠素總含量最低為0.037 mg/g，花色素苷相對含量最高為0.399 Units/g，葉色紅艷。