蔣智勇，楚品品，陳天寶，李春玲，蔡汝健

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站，廣東 廣州 510640）

【研究意義】豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）主要感染豬的呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，可引發(fā)高度傳染性疾病，造成重大經(jīng)濟損失。PRRSV 自1987 年在美國發(fā)現(xiàn)以來，迅速蔓延至全世界頻繁暴發(fā)。我國于1996 年分離到該病毒［1］，2006 年夏秋季南方多個省區(qū)暴發(fā)高致病性PRRSV（HP-PRRSV）造成了大量豬只死亡，引起豬價大幅波動，對生豬產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展構(gòu)成嚴重威脅。PRRSV 分子流行病學的調(diào)查與研究對制定以PRRSV 疫苗免疫和生物安全防控為基礎的綜合防控措施具有重要意義。

【前人研究進展】PRRSV 分為兩個基因型，即歐洲型（PRRSV 1）和美洲型（PRRSV 2），它們感染豬的臨床癥狀和病理變化相似，但抗原特性和遺傳學特征卻存在顯著差異。目前我國的流行株主要為PRRSV 2。2010 年從廣東地區(qū)使用MLV 疫苗的豬場中分離到屬于Lineage 3 譜系毒株QYYZ 和GM2，重組分析表明GM2 是野毒株QYYZ 與疫苗毒株Resp/PRRS 的重組病毒［2］。2013 年周峰等［3］分離獲得1 株Nsp2 區(qū)與2008年美國學者分離的NADC30 株［4］具有相同缺失特征的毒株，命名為NADC30-like，此后該毒株逐漸成為我國北方地區(qū)的主要流行毒株。2014 年以來我國報道了基因組出現(xiàn)明顯變異和易重組的NADC30-like 毒株［5-6］。分子流行病學研究發(fā)現(xiàn)，我國流行的PRRSV 可分為4個譜系：Lineage 8（JXA1-like 和CH-1a-like）、Lineage 5（VR-2332-like）、Lineage 3（QYYZ-like）和Lineage 1（NADC30-like）［7］。

【本研究切入點】PRRSV 為單股正鏈RNA病毒，基因組長度約為 15 kb，其長度變化主要決定于Nsp2 區(qū)域缺失與插入片段長度。ORF2-7以亞基因組形式編碼病毒的8 種結(jié)構(gòu)蛋白，其中以GP5 變異最大，是PRRSV 最主要的保護性抗原蛋白，因此在病毒分子遺傳變異分析中ORF5基因常作為基因分型依據(jù)用于 PRRSV 分子流行病學監(jiān)測［8］?！緮M解決的關鍵問題】為了監(jiān)測PRRSV 在廣東省的流行動態(tài)和進化趨向，本研究2021 年采集了廣東地區(qū)規(guī)模豬場臨床疑似PRRS癥狀的豬只組織樣品，通過對ORF5基因測序進行遺傳變異分析，探查廣東省內(nèi)各地區(qū)流行毒株的分布情況，為制定PRRSV 防控措施提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病料為521 份肺臟組織樣品，采于2021 年廣東省不同地區(qū)37 個規(guī)模豬場疑似PRRS 癥狀的仔豬和流產(chǎn)胎兒。

病毒DNA/RNA 提取試劑盒（Magen）購自廣州美基生物科技有限公司；PrimeScript?One Step RT-PCR Kit 購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1.2 引物設計

參照GenBank 中不同譜系PRRSV 代表株基因組序列設計1 對特異性引物擴增ORF5基因，具體序列如下，ORF5-F：5'-CATTTCATGACACCTGAGAC-3'，ORF5-R：5'-CGGCATCTGGAGGTGATGA-3'，預期擴增長度為970 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 PRRSV ORF5 基因的RT-PCR 擴增與測序

分別取少量肺臟加入500 μL PBS 勻漿、離心取200 μL 上清按照病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明書提取病毒RNA，然后按照一步法RT-PCR 試劑盒配制RT-PCR 反應體系并進行RT-PCR 擴增，反應結(jié)束后將電泳檢測為陽性的PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 PRRSV ORF5 基因及編碼蛋白的序列比對與遺傳進化樹構(gòu)建

對雙向測序結(jié)果截取完整的ORF5基因，用DNAStar 與GenBank 中的16 株國內(nèi)外代表株（表1）作為參考毒株，對其基因序列以及推導的氨基酸序列進行比對。使用ClustalX 2.1 和Mega 7.0軟件基于 Neighbor-Joining 方法繪制系統(tǒng)遺傳進化樹。

表1 PRRSV 代表毒株信息Table 1 Information of representative PRRSV strains

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV ORF5 基因RT-PCR 擴增及序列測定

對供試的37 個豬場521 份疑似PRRS 癥狀的組織樣品提取病毒RNA，經(jīng)RT-PCR 擴增后，產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1，擴增產(chǎn)物約1 000 bp，與預期大小一致。其中檢出PRRSV 陽性樣品127 份，來自17 個豬場，樣品陽性率為24.4 %，豬場陽性率為45.9%。每個陽性樣品雙向重復測序2 次，測序結(jié)果表明同一陽性豬場的陽性樣品測序結(jié)果一致，獲得了來自17 個不同豬場的PRRSVORF5基因序列，其中有3 株（GD MM、GD FS 和GD LN）在同一位置缺失3 個堿基，其他ORF5基因全長均為603 bp，并根據(jù)樣品來源地進行命名。

圖1 PRRSV ORF5 基因的RT-PCR 產(chǎn)物Fig.1 RT-PCR products of PRRSV ORF5 gene

2.2 PRRSV ORF5 基因序列遺傳進化分析

將17 株PRRSVORF5基因序列與表1 的16 株PRRSV 參考序列用Mega 7.0 構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果（圖2）顯示，17 株PRRSV 分別屬于PRRSV 2 的3個譜系。Lineage 1 譜系分為2 個分支（NADC30-like 和NADC34-like），分別包含了近幾年美國流行的ORF5RFLP 1-4-4 代表株1-4-4 lineage 1c 和ORF5RFLP 1-7-4 代表株IA/2014NADC34。本研究得到的8 株PRRSV（GD YC、GD FS、GD MM、GD YJ、GD ZQ、GD GZ、GD LN 和GD JM）屬于 Lineage 1（NADC30-like）譜系，1株PRRSV（GD MZ）屬于 Lineage 1（NADC34-like）譜系；3 株PRRSV（GD HY、GD HZ、和GD ZJ）屬于 Lineage 3 譜系（QYYZ-like）；5 株PRRSV（GD JM2、GD TS、GD YF、GD QY 和GD SH）屬于Lineage 8（JXA1-like 和 CH-1a-like）譜系。17 株PRRSV 中Lineage 1、Lineage 8 和Lineage 3占比分別為52.94%、29.41%和17.65%，沒有檢測到Lineage 5（VR2332-like）譜系的毒株。

圖2 PRRSV 基于ORF5 基因的系統(tǒng)遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of PRRSV based on ORF5 gene

采用DNAstar 對17 株PRRSVORF5基因及參考序列進行核苷酸同源性分析，結(jié)果（圖3）顯示，ORF5基因核苷酸序列同源性為81.3%～99.5%；與HP-PRRSV 中的JXA 1 株、Hu4 株、TJ 株核苷酸同源性為81.1%～98.5%；與美國VR-2332 株的核苷酸同源性為83.1%～89.7%；與歐洲型LV 株的核苷酸同源性為61.8%～64.3%。屬于 Lineage 1 （NADC30-like 和 NADC34-like） 譜系的9 株分離株之間的核苷酸同源性為84.8%～95.8%；屬于Lineage 3（QYYZ-like）譜系的3 株分離株之間核苷酸同源性為92.9%～94.4%；屬于Lineage 8（JXA1-like 和 CH-1a-like）譜系的5 株分離株之間核苷酸同源性為97.8%～99.5%，與JXA1 株核苷酸同源性為98.7%～99.5%。

圖3 PRRSV ORF5 基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果Fig.3 Results for homology analysis of nucleotide sequence of PRRSV ORF5 gene

2.3 PRRSV ORF5 基因推導的氨基酸序列分析

通過DNAstar 分析ORF5基因編碼蛋白GP5 推導的氨基酸序列同源性，結(jié)果（圖4）顯示，17 株PRRSV GP5 氨基酸序列同源性為78.5%～98.5%；與Lineage 1 中NADC30 株的氨基酸同源性為84.6%～94.5%；與Lineage 3 中GM2 株的氨基酸同源性為77.5%～93.5%；與Lineage 5 中VR-2332株的氨基酸同源性為80.5%～88.1%；與Lineage 8中JXA 1 株、Hu4 株、TJ 株氨基酸序列同源性為83.0%～98.5%；與歐洲型LV 株的氨基酸同源性為50.7%～57.7%。屬于 Lineage 1 （NADC30-like 和NADC34-like） 譜系的9 株分離株之間的氨基酸同源性為85.0%～95.0%；屬于Lineage 3（QYYZlike）譜系的3 株分離株之間的氨基酸同源性為92.9%～94.4%。

圖4 PRRSV ORF5 基因編碼蛋白GP5 推導的氨基酸序列同源性分析結(jié)果Fig.4 Results for homology analysis of the deduced amino acid sequence of protein GP5 encoded by PRRSV ORF5 gene

ORF5基因編碼蛋白GP5 推導的氨基酸序列比對結(jié)果如圖5 所示，有3 株（GD MM、GD FS和GD LN）缺失了第33 位氨基酸，其氨基酸突變位點主要位于GP5 的信號肽（Signal peptide）、中和位點（PNE）、2 個高變區(qū)（HVR）、B 細胞抗原位點（B cell epitop）和2 個T 細胞抗原位點附近［9］。GP5 的N-糖基化位點在病毒感染、免疫逃避方面起重要作用，GP5 有2 個保守的糖基化位點（第44、51 位）［10］，而位于高變區(qū)的第32、33、34、35 位N-糖基化位點容易突變，HP-PRRSV 第32 位突變?yōu)镾，而第35 位又由S突變?yōu)镹；Lineage 3 譜系第33 位N 突變?yōu)镚。有些氨基酸位點的突變具有譜系特異性，Lineage 1 特異的突變位點有第47 位L 突變I、第57 位A突變N/R/D、第168 位E 突變D 和第192 位V 突變I；HP-PRRSV 特異的氨基酸位點第9、13、24、25、32、35、161、189、191 位分別為C、R、Y、L、S、N、V、L 和R；Lineage 3 特異的氨基酸位點第34、38、39、66、92、170 位分別為G、Y、S、C、S 和G。

圖5 推導的GP5 氨基酸序列比對分析Fig.5 Alignment analysis of the deduced amino acid sequence of GP5

3 討論

PRRSV 的聚合酶復制保真度差、點突變、重組和免疫壓力選擇促進PRRSV 不斷演化，被認為是產(chǎn)生病毒變異性和多樣性的潛在分子機制。自2006 年我國首次報道HP-PRRSV 毒株（以JXA1 為代表）以來，在隨后的幾年中，JXA1-like 毒株成為我國流行的優(yōu)勢毒株。但隨著2010年和2013 年在我國大陸分別出現(xiàn)QYYZ-like 和NADC30-like 毒株，RPRSV 的多樣性顯著擴大，使得PRRS 的防控日趨復雜。同時多種弱毒活疫苗在全國范圍內(nèi)廣泛使用，無疑加大了豬群的免疫選擇壓力，外來新毒株的入侵以及與疫苗株間重組進一步加劇了PRRSV 的多樣化。

廣東省內(nèi)PRRSV 優(yōu)勢流行毒株與我國北方地區(qū)不一致，2014—2016 年從廣東省內(nèi)分離的毒株測序結(jié)果表明以Lineage 8（JXA1-like 和CH-1a-like）譜系和 Lineage 3（QYYZ-like）譜系為主［11］；2019—2020 年監(jiān)測結(jié)果表明廣東省內(nèi)PRRSV 以Lineage 3（QYYZ-like）譜系為主，其次為Lineage 8（JXA1-like 和CH-1a-like）譜系和 Lineage 1（NADC30-like）譜系［12］。本研究對2021 年廣東省內(nèi)不同豬場的PRRSV 測序分析結(jié)果顯示，有52.94%（9/17）屬于Lineage 1（NADC30-like 和NADC34-like）譜系、29.41%（5/17）屬 于Lineage 8（JXA1-like 和CH-1a-like）譜 系和17.65%（3/17）屬于Lineage 3（QYYZ-like）譜系。由此可見，2021 年廣東省內(nèi)PRRSV 流行毒株以Lineage 1 譜系為主，Lineage 3 譜系在廣東省內(nèi)流行比前幾年大幅縮小，流行毒株的變化可能與近年來種豬的頻繁調(diào)運有關。從臨床PRRS癥狀檢測屬于Lineage 8（JXA1-like 和CH-1alike）譜系的毒株核苷酸序列與JXA1 株同源性為98.7%～99.5%，可能與疫苗使用不當有關，疫苗免疫以弱毒疫苗免疫后再以滅活疫苗加強免疫可以獲得較好的免疫效果［13］。

2014 年首次報道在美國至少5 個州檢測到RFLP 1-7-4 PRRSV，其代表毒株為IA/2014/NADC34 株，感染仔豬后可引起嚴重的臨床癥狀［14］。2017 年在我國遼寧省首次監(jiān)測到NADC34-like PRRSV［15］，隨后在黑龍江、福建、江蘇和四川均有報道［16-19］。本研究從廣東梅州地區(qū)分離的毒株GD MZ 2021 株ORF5基因具有RFLP1-7-4 模式特點，與IA/2014/NADC34 株同源性為97.3%，且NSP2 區(qū)域有100 aa 的連續(xù)缺失，還需要通過全基因組測序進一步驗證。

2020 年10 月以來，美國豬場暴發(fā)由 PRRSV 1-4-4 Lineage 1C 新型變異株引起的疫情，該毒株具有更強的傳播能力和致病性，且現(xiàn)有疫苗對其保護效果不佳［20］。美國PRRSV 1-4-4 Lineage1C 變異株與我國PRRSV NADC34-like 屬于同一譜系分支（Lineage 1），其Nsp2 區(qū)域存在100 aa 連續(xù)缺失。鑒于NADC34-like 已成為美國主要流行株，有可能成為我國PRRSV 潛在流行株［21］。為了有效防控PRRS，需要對PRRSV 流行株分子變異進行持續(xù)監(jiān)測，以期為臨床診斷、新型疫苗的研發(fā)提供參考。

4 結(jié)論

為了監(jiān)測廣東省2021 年PRRSV 的分子流行動態(tài)，從省內(nèi)生豬主產(chǎn)區(qū)采集37 個規(guī)模豬場521份疑似PRRS 患病豬的組織樣本進行PRRSV 檢測。對陽性樣品進行ORF5基因的RT-PCR 擴增和測序，獲得17 株來自不同地區(qū)規(guī)模豬場的PRRSVORF5基因序列并進行遺傳進化分析，結(jié)果表明，所有毒株均屬于PRRSV 2，在遺傳進化樹上分別屬于3 個譜系即Lineage 1（NADC30-like和NADC34-like）譜系、Lineage 8（JXA1-like 和CH-1a-like）譜系和 Lineage 3（QYYZ-like）譜系，所占比例分別為52.94%、29.41%和17.65%，沒有檢測到Lineage 5（VR2332-like）譜系的毒株。與前幾年的檢測數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，2021 年廣東地區(qū)Lineage 1 （NADC30-like）譜系的PRRSV 占比快速上升，而Lineage 3（QYYZ-like）譜系占比下降。17 株PRRSV 毒株ORF5基因之間核苷酸序列同源性為81.3%～99.5%，推導的GP5 氨基酸序列同源性為80.0%～98.3%，GP5 高變區(qū)的糖基化位點存在不同程度變異。