陳麗婷，吳劍峰，趙玉兵，嚴(yán) 欣，肖 俊，羅永巨，項(xiàng)桂德，梁軍能

（1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021；2.廣西諾亞生物科技發(fā)展有限公司，廣西 柳州 545000）

【研究意義】我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)正朝集約化方向發(fā)展［1］，但高密度養(yǎng)殖帶來的水質(zhì)惡化、養(yǎng)殖動(dòng)物免疫力下降、病害頻發(fā)等問題，是制約我國(guó)集約化養(yǎng)殖高速發(fā)展的重要原因［2］。目前精養(yǎng)系統(tǒng)改善水質(zhì)的辦法通常是直接換水，但這會(huì)增加養(yǎng)殖動(dòng)物的應(yīng)激，同時(shí)給養(yǎng)殖尾水處理及水域環(huán)境造成較大壓力。國(guó)務(wù)院在黨的十八大后提出“全面加強(qiáng)生態(tài)環(huán)境保護(hù)，堅(jiān)決打好污染防治攻堅(jiān)戰(zhàn)”的意見，明確提出了建設(shè)生態(tài)文明的重要舉措。當(dāng)前，世界各地水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)正蓬勃發(fā)展，發(fā)展水資源節(jié)約型、環(huán)境友好型的生態(tài)健康養(yǎng)殖，將成為未來養(yǎng)殖業(yè)的焦點(diǎn)［3］。因此，開展水資源節(jié)約型、生態(tài)健康養(yǎng)殖研究，對(duì)指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前益生菌在畜牧業(yè)和人類健康中的應(yīng)用已較為廣泛，因其無耐藥性、環(huán)保、安全等優(yōu)點(diǎn)而受到關(guān)注，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用起步較晚。水質(zhì)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中起到至關(guān)重要的作用，在水體中直接添加益生菌，不僅可改善養(yǎng)殖水質(zhì)，還能改善養(yǎng)殖動(dòng)物的腸道健康。在養(yǎng)殖水體中添加益生菌用以改善水質(zhì)、促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的健康和生長(zhǎng)的方法是目前較推崇的生態(tài)養(yǎng)殖方式之一［4-8］。Iribarren 等［9］在水體中添加益生菌后，有效抑制了水體中病原微生物的生長(zhǎng)繁殖，改善了水質(zhì)；李詠梅等［10］在凡納繽對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中添加益生菌后改善了水質(zhì)并提高了對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能；徐晨等［11］在生物絮團(tuán)養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖水體中添加益生菌能夠促進(jìn)異育銀鯽的生長(zhǎng)；Giatsis 等［12］在羅非魚養(yǎng)殖水體中添加芽孢桿菌7 d 后，其腸道菌群變化顯著；Xia 等［13］在羅非魚水體中添加乳酸乳球菌也產(chǎn)生同樣效果，并且增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)疾病的抵抗能力。在零換水條件下，學(xué)者們的研究多集中在添加不同碳源［14-15］，或不同碳氮比所構(gòu)建的生物絮團(tuán)系統(tǒng)，對(duì)水質(zhì)［16］及養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)、體成分、消化酶［17］以及抗氧化和免疫［18］等的影響，或者在零換水構(gòu)建的生物絮團(tuán)條件下，研究不同營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)的貢獻(xiàn)［19-21］，以及研究在零換水條件下添加生物藻土［22］、碳水化合物［23］對(duì)養(yǎng)殖池中微生物菌落結(jié)構(gòu)的影響。而在零換水條件下添加益生菌的研究報(bào)道較少。唐匯娟等［24］在飼料中添加糖蜜，并在養(yǎng)殖水體中潑灑芽孢桿菌，養(yǎng)殖周期55 d，全程不更換水體，結(jié)果表明這種方式在一定程度上改善了羅非魚的生長(zhǎng)成活率和生長(zhǎng)速率；王淼等［25］等每周潑灑1 次異養(yǎng)硝化細(xì)菌，維持10周，結(jié)果提高了尼羅羅非魚的抗氧化能力，也維持了池塘水質(zhì)；孫博超等［26］在凡納濱對(duì)蝦發(fā)育到蚤狀幼體時(shí)開始投喂益生菌，直到發(fā)育成仔蝦后5 d 停止，整個(gè)過程中不換水，結(jié)果表明益生菌組合不僅能夠抑制弧菌繁殖還能提高凡納濱對(duì)蝦幼體的成活率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】上述研究結(jié)果表明，添加益生菌能增強(qiáng)魚體的免疫力并且提高生長(zhǎng)性能，而在水體中直接添加益生菌還能改善水質(zhì)，但在零換水條件下添加益生菌的研究鮮有報(bào)道，且主要集中在單一菌種的研究上，而單一菌種往往在生態(tài)作用中不足以應(yīng)對(duì)復(fù)雜多變的養(yǎng)殖水域環(huán)境［27］，因此，探討復(fù)合益生菌對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)的影響，尋找在零換水條件下適合羅非魚養(yǎng)殖的益生菌組合，對(duì)促進(jìn)羅非魚的健康、生態(tài)養(yǎng)殖發(fā)展具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】以羅非魚為養(yǎng)殖對(duì)象，全池潑灑復(fù)合益生菌，以正常更換養(yǎng)殖水的養(yǎng)殖模式為對(duì)照，研究添加復(fù)合益生菌對(duì)羅非魚養(yǎng)殖水質(zhì)、生長(zhǎng)、肌肉品質(zhì)的影響，以期為促進(jìn)零水交換條件下的生態(tài)、健康養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試羅非魚（Oreochromis mossambicus）規(guī)格整齊，體質(zhì)健壯，個(gè)體質(zhì)量為12.1（±0.5）g，由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院國(guó)家級(jí)廣西南寧羅非魚良種場(chǎng)提供，試驗(yàn)開始前馴化2 周。商品飼料來源于南寧通威飼料有限公司，粗蛋白含量為36%。復(fù)合益生菌由廣西諾亞生物科技發(fā)展有限公司提供，該復(fù)合益生菌組合包括細(xì)黃鏈霉菌、莢膜紅假單胞菌、酵母菌、乳酸菌4 個(gè)菌種，活菌含量≥3×109CFU/mL。羅非魚養(yǎng)殖于廣西羅非魚良種場(chǎng)的室內(nèi)水泥池（長(zhǎng)12 m，寬5 m，高1.8 m），水深1.5 m，養(yǎng)殖用水為曝氣自來水。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)處理水體中添加復(fù)合益生菌菌液（活菌含量≥3×109CFU/mL），每90 m3水體添加菌液50 mL，試驗(yàn)開始的首月每隔1 周按相同劑量補(bǔ)充添加1 次菌液，試驗(yàn)第2 個(gè)月開始至試驗(yàn)結(jié)束，每隔1 個(gè)月按相同劑量補(bǔ)充添加1 次菌液；以正常更換養(yǎng)殖水的養(yǎng)殖模式為對(duì)照，對(duì)照不添加益生菌，模擬正常的養(yǎng)殖管理，試驗(yàn)開始第1、2 個(gè)月，每隔2 周更換養(yǎng)殖水體的50%，第3 個(gè)月開始到試驗(yàn)結(jié)束，每周更換養(yǎng)殖水體的50%。養(yǎng)殖試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)，一共6 個(gè)池，每個(gè)池作為1 個(gè)處理。

試驗(yàn)處理和對(duì)照的養(yǎng)殖池均使用微孔增氧進(jìn)行24 h 曝氣后放養(yǎng)羅非魚。試驗(yàn)開始后，將規(guī)格整齊的羅非魚種2 700 尾，隨機(jī)分成6 組，每組450 尾，養(yǎng)殖密度7.5 尾/m2。每天投喂2 次（8：00—9：00，17：00—18：00），投喂量按體重的3%計(jì)，每15 d 測(cè)量魚體質(zhì)量后調(diào)整1 次投喂量。試驗(yàn)魚經(jīng)分組后馴養(yǎng)適應(yīng)1 周，養(yǎng)殖試驗(yàn)于2020 年6 月18 日開始，至10 月28 日結(jié)束，共133 d。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束后，羅非魚停食24 h，統(tǒng)計(jì)成活率及餌料系數(shù)；每處理隨機(jī)挑選6尾，測(cè)量質(zhì)量、體長(zhǎng)，計(jì)算增重率、特定生長(zhǎng)率。

1.3.2 品質(zhì)測(cè)定 取肌肉測(cè)量水分、粗灰分、粗脂肪以及氨基酸。每個(gè)處理選取3 尾魚，取每尾魚體一側(cè)第3～8 肋骨之間的腹肌約7 g，測(cè)定肌肉氨基酸；取魚體另一側(cè)第3～8 肋骨背鰭間的肌肉約10 g，測(cè)定常規(guī)成分。常規(guī)成分的水分測(cè)定參照GB 5009.3-2010，采用105℃烘箱恒重法；粗脂肪測(cè)定參照GB/T 5009.6-2003，采用索氏抽提法；灰分測(cè)定參照GB 5009.4-2010，550℃馬弗爐灼燒法；粗蛋白測(cè)定參照GB 5009.5-2010，采用凱氏定氮法。氨基酸測(cè)定釆用Hetach L-8800 氨基酸自動(dòng)分析儀，由四川威爾檢測(cè)中心測(cè)定。

1.3.3 水質(zhì)分析 試驗(yàn)第1 天開始采集水樣進(jìn)行水質(zhì)檢測(cè)，之后每周于9：00 采集1 次直到試驗(yàn)結(jié)束。采樣用對(duì)角線方式選擇等距的3 個(gè)點(diǎn)，采集上層水，3 個(gè)點(diǎn)的水樣混合后現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。溫度和溶解氧使用雷磁便攜式溶氧測(cè)定儀（JPB-607A型）檢測(cè)，pH、氨氮、亞硝酸鹽采用奧克丹水質(zhì)分析儀（OCT-B 型）檢測(cè)。

1.3.4 生物菌落結(jié)構(gòu)分析 將試驗(yàn)結(jié)束前最后1次采集的水體3 L，利用真空抽濾，水體全部經(jīng)過0.22 μm 濾膜，將濾膜含菌一面向內(nèi)折疊后置于無菌EP 管中，在液氮中速凍后，置于5 kg 干冰中包埋后送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行16S rRNA 高通量測(cè)序。

用 CTAB 法提取濾膜中的DNA，PCR 擴(kuò)增使用Phusion?混合液和保真酶，引物區(qū)域?yàn)?6S V4 區(qū)，擴(kuò)增區(qū)域包括16S V3～V4 區(qū)。PCR 產(chǎn)物目的條帶利用Qiagen 公司的膠回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物回收產(chǎn)物。

使 用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 和Q-PCR 定量，檢測(cè)合格后使用Novaseq PE250 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

利用Qiime 分析工具對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，將一致性為97%的序列進(jìn)行OTUs 聚類，對(duì)出現(xiàn)頻率高的代表序列的物種進(jìn)行注釋。根據(jù)注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣品在門水平最大豐度排名前10 的物種生成物種相對(duì)豐度累加的柱形圖；在屬水平上，篩選相對(duì)豐度排名前35 的物種繪制成熱圖。用Qiime（Version 1.7.0）計(jì)算觀測(cè)條數(shù)（Observed-species）及α 多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson、Chao1、ACE、Goods-coverage），采用R 軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線（Rarefaction curve）、等級(jí)聚類曲線（Rank abundance）、維恩（Venn）圖。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS 15.0，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan氏法進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)組間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加益生菌對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，添加益生菌的試驗(yàn)處理羅非魚均重為485.32（±0.12）g，對(duì)照個(gè)體均重為455.93（±31.46）g，試驗(yàn)處理略高，但差異不顯著；成活率方面，試驗(yàn)處理的成活率顯著高于對(duì)照，而餌料系數(shù)顯著低于對(duì)照。此外，試驗(yàn)處理的增重率和特定生長(zhǎng)率均高于對(duì)照，但差異不顯著（表1）。

表1 添加益生菌對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響Table 1 Effects of adding probiotics on growth performance of tilapia

2.2 添加益生菌對(duì)羅非魚肌肉品質(zhì)的影響

由表2 可知，試驗(yàn)處理羅非魚的粗蛋白、粗脂肪水平均顯著高于對(duì)照，但差異不顯著；水分和粗灰分與對(duì)照相比差異不顯著。由表3 可知，試驗(yàn)處理羅非魚的肌肉氨基酸總量、必需氨基酸和鮮味氨基酸含量均高于對(duì)照，但差異不顯著。

表2 添加益生菌對(duì)羅非魚體成分的影響Table 2 Effects of adding probiotics on body composition of tilapia

表3 添加益生菌對(duì)羅非魚氨基酸的影響Table 3 Effects of adding probiotics on amino acid of tilapia

2.3 添加益生菌對(duì)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響

試驗(yàn)期間，養(yǎng)殖池水溫為26.5～30.5℃，pH為7.0～8.0。試驗(yàn)處理水體的溶解氧為6.50 mg/L，對(duì)照為6.48 mg/L，差異不顯著，而氨氮濃度顯著高于對(duì)照，亞硝酸鹽氮濃度顯著低于對(duì)照（表4）。

表4 添加益生菌對(duì)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響Table 4 Effects of adding probiotics on aquaculture water quality

2.4 添加益生菌對(duì)養(yǎng)殖水體生物菌落的影響

Goods-coverage 指數(shù)表明，本研究測(cè)序深度達(dá)99%，說明測(cè)序基本包含了所有物種。Simpson 指數(shù)評(píng)估優(yōu)勢(shì)種群的集中程度，值越小，說明群落多樣性越高；Shannon 指數(shù)反映群落多樣性，值越大，說明群落多樣性越高［28］，結(jié)合Observed-species、Chao1 和ACE 指數(shù)可知添加益生菌試驗(yàn)處理系統(tǒng)中的微生物物種豐富度較高（表5）。

表5 添加益生菌對(duì)微生物群落豐富度和多樣性指數(shù)的影響Table 5 Effects of adding probiotics on bacterial community richness and diversity index

稀釋曲線主要反映樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，如果曲線已趨向平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量已漸進(jìn)合理，后續(xù)沒有必要進(jìn)行更多數(shù)據(jù)量的測(cè)序。圖1 顯示試驗(yàn)處理與對(duì)照的稀釋曲線均已趨于平坦，證明所得測(cè)序數(shù)據(jù)量已飽和且測(cè)序數(shù)據(jù)合理，具有代表性，可進(jìn)一步作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve

等級(jí)聚類曲線可反映測(cè)序物種的豐度和均勻度。從水平方向上看，曲線的寬度反映物種的豐富度，曲線在橫坐標(biāo)軸上跨度越大，代表越高的物種豐度；從垂直方向上看，物種的均勻度由曲線的平滑度反映，物種分布越均勻，則曲線越平緩［29］。由圖2 可見，添加益生菌試驗(yàn)處理養(yǎng)殖水體的物種豐度大于對(duì)照。維恩圖可比較直觀地顯示對(duì)照和試驗(yàn)處理之間共有、特有的OTUs，本研究從試驗(yàn)處理和對(duì)照分別檢出OTUs 數(shù)目869、717 個(gè)，其中共有的OTUs 數(shù)目為557 個(gè)，試驗(yàn)處理特有的OTUs 數(shù)目為312 個(gè)，對(duì)照中特有的OTUs 數(shù)目為160 個(gè)（圖3）。

圖2 等級(jí)聚類曲線Fig.2 Rank abundance curve

圖3 細(xì)菌數(shù)目的維恩分析Fig.3 Venn analysis of the number of bacteria

由圖4 可知，在細(xì)菌門水平上，試驗(yàn)處理和對(duì)照中豐度較高的前10 個(gè)門分別為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、梭桿菌門（Fusobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、未分類（Candidatedivision-SRI）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）。其中，試驗(yàn)處理的優(yōu)勢(shì)菌門（平均相對(duì)豐度＞1%）［30］是變形菌門（41.41%）、放線菌門（35.99%）、擬桿菌門（8.28%）、梭桿菌門（5.8%）、疣微菌門（3.4%）；對(duì)照的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（53.69%）、擬桿菌門（18.40%）、放線菌門（8.05%）、梭桿菌門（5.7%）、疣微菌門（4.9%）、未分類（2.36%）、綠彎菌門（1.39%）。

圖4 生物菌落在門水平上的相對(duì)豐度分析Fig.4 Analysis of relative abundance of biological colonies at phylum level

3 討論

3.1 添加益生菌對(duì)羅非魚生長(zhǎng)的影響

魚類終生生活在水中，水質(zhì)的好壞對(duì)其健康及生長(zhǎng)至關(guān)重要，保持充足的溶解氧和適宜的pH值是維持水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物正常生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)過程中，添加益生菌的試驗(yàn)處理和對(duì)照養(yǎng)殖水體的溶解氧和pH 值均保持相對(duì)穩(wěn)定，且符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)［31］，為羅非魚的生長(zhǎng)提供了有利條件。水體中的亞硝酸鹽氮是主要污染源之一，亞硝酸鹽氮通過影響?zhàn)B殖動(dòng)物的耗氧、氨氮排泄以及滲透壓等影響機(jī)體健康。周鮮嬌等［32］用不同濃度的亞硝酸鹽氮脅迫健康的凡納濱對(duì)蝦，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽氮濃度升高，對(duì)蝦死亡率隨之增加；黃翔鵠等［33］、吳中華等［34］在研究亞硝酸鹽氮對(duì)凡納冰對(duì)蝦的毒性實(shí)驗(yàn)中也同樣發(fā)現(xiàn)高濃度的亞硝酸鹽氮導(dǎo)致對(duì)蝦免疫力下降，由此可見，維持水體中較低濃度的亞硝酸鹽氮水平是保障養(yǎng)殖動(dòng)物健康的條件之一。本研究中，添加益生菌試驗(yàn)處理的養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮顯著低于對(duì)照，說明復(fù)合益生菌對(duì)降低亞硝酸鹽氮方面起積極作用，從而提高羅非魚的成活率，該研究結(jié)果與王夢(mèng)亮等［35］、沈錦玉等［36］的報(bào)道相似。養(yǎng)殖水體中添加益生菌后，通過改變水體菌群結(jié)構(gòu)，抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)，從而增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物機(jī)體的免疫力［37］，吸附霉菌毒素等［38-39］。本試驗(yàn)中，添加益生菌試驗(yàn)處理的羅非魚成活率顯著高于對(duì)照，認(rèn)為與添加益生菌的作用效果有關(guān)。一般認(rèn)為，在水體中添加益生菌后，可通過影響腸道功能等促進(jìn)生長(zhǎng)、降低餌料系數(shù)［24,40］，光合細(xì)菌能夠分泌消化酶如蛋白酶、脂肪酶等幫助消化和吸收，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收［41-42］，還能夠合成多種維生素和促生長(zhǎng)因子［43］，從而提高飼料利用率。本試驗(yàn)中添加的莢膜紅單胞菌屬于光合細(xì)菌，具有類似功能，試驗(yàn)處理添加該復(fù)合益生菌后，羅非魚生長(zhǎng)在一定程度上有所提高。細(xì)黃鏈霉菌能夠產(chǎn)生木聚糖酶，而木聚糖酶在提高飼料利用率和防止動(dòng)物結(jié)腸炎方面有利［44］。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)處理的餌料系數(shù)顯著低于對(duì)照，可能是添加益生菌起到了節(jié)約飼料的作用。

3.2 添加益生菌對(duì)羅非魚肌肉品質(zhì)的影響

腸道作為魚體與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的主要場(chǎng)所之一，腸道微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)與養(yǎng)殖的水體環(huán)境息息相關(guān)。王淼等［25］在養(yǎng)殖水體中潑灑復(fù)合益生菌改變了羅非魚的腸道菌群結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌進(jìn)入腸道之后，通過抑制有害菌繁殖，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)，特別是改變厚壁菌門和擬桿菌門的比例，從而影響脂肪沉積，進(jìn)而改善肌肉風(fēng)味［45-46］。此外，益生菌還能夠?qū)⒅狙趸蔀樾》肿游镔|(zhì)，而腸道菌群中發(fā)生代謝反應(yīng)產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)能夠轉(zhuǎn)移到肌肉中，增加肌肉中肌苷酸、脯氨酸、苯丙氨酸等滋味物質(zhì)［47］，從而提高風(fēng)味。夏雨等［48］在飼料中添加乳酸菌飼喂凡納濱對(duì)蝦，增加了幼蝦肌肉的彈性和咀嚼性。張?zhí)礻枺?9］用150 mL 乳酸菌液飼喂育肥豬時(shí)，顯著提高了最長(zhǎng)肌的粗蛋白含量，鄔理洋［50］研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)或混合飼喂微生態(tài)制劑、牛膝多糖均可提高育肥豬背最長(zhǎng)肌的粗蛋白含量和粗脂肪含量。本試驗(yàn)中，添加益生菌試驗(yàn)處理羅非魚的粗蛋白含量顯著高于對(duì)照，粗脂肪含量、氨基酸總量、必需氨基酸和鮮味氨基酸含量也高于對(duì)照，與上述報(bào)道相類似?？梢?，添加益生菌可改變水體的菌群結(jié)構(gòu)，提高水體中有益菌的占比，也能通過影響羅非魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的方式，改善羅非魚的肌肉品質(zhì)。

3.3 添加益生菌對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)及菌群結(jié)構(gòu)的影響

本研究添加的復(fù)合益生菌組合包括細(xì)黃鏈球菌、莢膜紅假單胞菌和酵母菌和乳酸菌。乳酸菌能改善養(yǎng)殖水質(zhì)［51］，在水體中通過發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性抑制的作用，防止有害菌大量繁殖［52］；而且乳酸菌能夠?qū)⑺w中的大顆粒物質(zhì)如殘餌、糞便和死藻等通過氧化、氨化、固氮、硝化和反硝化等作用轉(zhuǎn)化為磷酸鹽、硝酸鹽等物質(zhì)［53］。莢膜紅假單胞菌是光合細(xì)菌的一種，光合細(xì)菌被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，具有繁殖速度快、生命力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)要求低的特點(diǎn)，并且莢膜紅假單胞菌含有天然胡蘿卜素，可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［54］。本研究中，添加復(fù)合益生菌后，在試驗(yàn)過程零換水的情況下，開展養(yǎng)殖試驗(yàn)133 d，與正常換水的對(duì)照相比，試驗(yàn)處理養(yǎng)殖水體的亞硝酸鹽水平顯著低于對(duì)照，說明使用益生菌組合能夠有效降解水體中的亞硝酸鹽含量。但在氨氮去除方面，試驗(yàn)處理養(yǎng)殖水體總的氨氮含量為0.141 mg/L，對(duì)照為0.076 mg/L。養(yǎng)殖水體中的氨氮分為離子氨（NH4+）和非離子氨（NH3），非離子氨對(duì)魚鰓造成損害，而離子氨則被認(rèn)為不易造成傷害，兩者的相互轉(zhuǎn)化受水體中pH 和溫度的影響。漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求非離子氨≤0.04 mg/L［31］。本試驗(yàn)過程中，養(yǎng)殖水體水溫26.5～30.5℃，pH7.0～8.0，溶解氧6.50 mg/L，均在羅非魚生長(zhǎng)適宜范圍內(nèi)，使得氨氮主要以離子氨的形式存在，并未對(duì)養(yǎng)殖魚造成嚴(yán)重影響［55］。添加益生菌試驗(yàn)處理在零換水條件下開展養(yǎng)殖，能夠使養(yǎng)殖水質(zhì)持續(xù)穩(wěn)定，保持適宜的溫度、pH和溶解氧，并且亞硝酸鹽含量均持續(xù)低于更換水質(zhì)的對(duì)照，說明該益生菌組合能夠有效改善養(yǎng)殖水體環(huán)境，維持良好且持續(xù)穩(wěn)定的水域生態(tài)環(huán)境，這可能得益于該益生菌組合能夠有效建立一套完整的生態(tài)系統(tǒng)。但試驗(yàn)過程中，對(duì)養(yǎng)殖水體氨氮的去除效果仍不夠理想，后續(xù)考慮補(bǔ)充芽孢桿菌等菌株作進(jìn)一步試驗(yàn)。

維系養(yǎng)殖水體的動(dòng)態(tài)平衡是生態(tài)健康養(yǎng)殖的必要條件，而水體中微生物在促進(jìn)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起關(guān)鍵作用［56］。在養(yǎng)殖水體中添加益生菌后可改善水體菌群的多樣性，可能與益生菌不僅能抑制有害菌生長(zhǎng)繁殖，還能在物質(zhì)循環(huán)中起積極作用有關(guān)，如分解大分子有機(jī)物等，從而改善了水質(zhì)，促進(jìn)其他水體有益菌生長(zhǎng)繁殖［40］。細(xì)菌群落的豐富度和均勻度多采用Simpson 指數(shù)，而群落中較為常見的物種數(shù)目多樣性則通過Shannon體現(xiàn)，Chaol指數(shù)越大，代表物種數(shù)量越多，群落豐富度越高。本研究中，添加益生菌試驗(yàn)處理的Chaol 指數(shù)顯著高于對(duì)照，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)與對(duì)照無差異，Observed-species、Chao1 和ACE 指數(shù)也很好地驗(yàn)證了這一點(diǎn)，且試驗(yàn)處理中特有的OTUs 數(shù)目遠(yuǎn)高于對(duì)照。這說明在零換水條件下，添加益生菌組合能夠提高水體細(xì)菌菌落的多樣性，為維持有效、穩(wěn)定的養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境提供保障。鄭佳佳等［57］在水體中添加復(fù)合益生菌改變了水體菌群結(jié)構(gòu)，創(chuàng)造了良好的養(yǎng)殖環(huán)境，與本研究結(jié)果相似。

本研究中試驗(yàn)處理和對(duì)照的優(yōu)勢(shì)菌門存在一定差異，試驗(yàn)處理的優(yōu)勢(shì)菌門數(shù)量占比94.88%，以變形菌門、放線菌門為主要菌種；對(duì)照的優(yōu)勢(shì)菌門數(shù)量占比89.84%，以變形菌門、擬桿菌門為主。兩種水體均為養(yǎng)殖水體中較常出現(xiàn)的有益菌種類，未出現(xiàn)弧菌等有害菌群，可能因?yàn)樘砑釉搹?fù)合益生菌后其在養(yǎng)殖水體中更能快速定植，占據(jù)有利地位，抑制有害菌生長(zhǎng)繁殖，該研究結(jié)果與陳景豪等［58］的研究結(jié)論相類似。放線菌門、擬桿菌門和變形菌門等具有重要的脫氮功能［59］，在試驗(yàn)處理養(yǎng)殖水體中占比85.68%，在對(duì)照中占比80.14%，且試驗(yàn)處理中的放線菌數(shù)量占比高于對(duì)照，說明添加益生菌后改變了原有的菌群結(jié)構(gòu)。放線菌門可通過抗生等競(jìng)爭(zhēng)性作用占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位［60］，從而抑制其他有害菌群的生長(zhǎng)；變形菌門大部分屬于異養(yǎng)型細(xì)菌，在COD 降解和脫氮過程起主要作用［61-62］，變形菌門中最主要的綱為β-變形菌綱，研究表明其與反硝化作用密切相關(guān)；擬桿菌門的細(xì)菌與DNA、脂類和蛋白質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，在處理廢水過程中發(fā)揮重要作用［57］。疣微菌門和綠彎菌門對(duì)有機(jī)質(zhì)的降解和硝化發(fā)揮重要作用［63-64］。本研究中試驗(yàn)處理和對(duì)照養(yǎng)殖水體中均含有豐富的變形桿菌門、酸桿菌門和擬桿菌門，但在試驗(yàn)處理養(yǎng)殖水體中優(yōu)勢(shì)更明顯，表明在零換水的條件下添加該益生菌組合，對(duì)有機(jī)物的轉(zhuǎn)化利用以及維持水體穩(wěn)定具有積極作用。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖通過頻繁更換水體的方式緩解養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的水質(zhì)惡化問題，采用添加復(fù)合益生菌的方式進(jìn)行零換水養(yǎng)殖，研究其對(duì)水質(zhì)改善、菌群結(jié)構(gòu)以及羅非魚生長(zhǎng)和肌肉品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示，添加益生菌組合能夠持續(xù)、有效地改善并維持良好、穩(wěn)定的養(yǎng)殖水環(huán)境，養(yǎng)殖全程水溫26.5～30.5℃，pH7.0～8.0，溶解氧6.50 mg/L，亞硝酸鹽0.039 mg/L，均在羅非魚生長(zhǎng)適宜范圍內(nèi)，水體的菌群多樣性提高，節(jié)約了換水產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)成本，同時(shí)減少了魚類應(yīng)激，維持機(jī)體穩(wěn)定的生理健康，提高了成活率和肌肉品質(zhì)，降低了餌料系數(shù)。此外，添加益生菌組合能夠做到零換水，有效控制了養(yǎng)殖尾水的排放，為推進(jìn)節(jié)約型和環(huán)境友好型的水域環(huán)境建設(shè)提供了新思路。