肖 飛，李春來,2，覃銀瑩，陳 靜，關(guān)睿聰，謝玉波,2，鐘 妤

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，南寧 530021；2.廣西消化道腫瘤加速康復(fù)外科基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

谷氨酸是體內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，能夠維持大腦活動的興奮性，與神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、發(fā)育、存活及死亡密切相關(guān)，但其在體內(nèi)濃度過高時可產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性[1]。有研究表明谷氨酸的神經(jīng)毒性與多種腦損傷的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。人白細(xì)胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）38是哺乳動物體內(nèi)最主要的一種二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）核糖基環(huán)化酶，可以催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）向環(huán)腺苷二磷酸核糖（cyclic ADP-ribose，cADPR）轉(zhuǎn)化，cADPR作為第二信使在細(xì)胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[3-4]。p90RSK/CREB/Bcl-2信號通路，具有促進(jìn)細(xì)胞存活和炎癥修復(fù)的作用，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）可以激活p90RSK，后者激活環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）并誘導(dǎo)B 細(xì)胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）的產(chǎn)生[5]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸可能通過抑制p90RSK/Bcl-2信號通路產(chǎn)生神經(jīng)毒性[6]，谷氨酸是否通過p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路產(chǎn)生神經(jīng)毒性，目前尚不清楚。有研究報道丙泊酚可以通過降低興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的濃度從而產(chǎn)生腦保護(hù)作用[7]。丙泊酚減輕谷氨酸神經(jīng)毒性的具體機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過丙泊酚預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，并用其培養(yǎng)基孵育大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞系，進(jìn)一步探討谷氨酸神經(jīng)毒性的作用機(jī)制并尋找有效的抗谷氨酸神經(jīng)毒性的藥物，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 丙泊酚（批號：10KC3900，Corden Pharma 公司，意大利）；兔抗大鼠p90RSK 單克隆抗體、p-CREB 單克隆抗體、Bcl-2 單克隆抗體和β-Tubulin 單克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；山羊抗兔HR-IgG（Santa Cruz 公司，美國）；Annexin V-PI 凋亡檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，中國）；ATP、ROS 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；CD38-siRNA（生工生物工程股份有限公司，中國）；轉(zhuǎn)染試劑（上海徠創(chuàng)生物科技有限公司，中國）；PC12 細(xì)胞系（國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺，中國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 按照隨機(jī)數(shù)字表法將PC12細(xì)胞分為4組：對照組（C組）、谷氨酸組（G組）、丙泊酚預(yù)處理組（PG 組）、CD38 基因沉默組（CPG 組）。C 組即為正常培養(yǎng)的PC12 細(xì)胞；G 組用3.5 mmol/L谷氨酸孵育PC12細(xì)胞6 h；PG組先用100 μmol/L丙泊酚預(yù)處理星型膠質(zhì)細(xì)胞6 h，并將其培養(yǎng)基加入谷氨酸干預(yù)PC12細(xì)胞中；CPG組先用CD38-siRNA沉默星形膠質(zhì)細(xì)胞CD38 基因，再用100 μmol/L 丙泊酚預(yù)處理星型膠質(zhì)細(xì)胞6 h，并將其培養(yǎng)基加入谷氨酸干預(yù)PC12細(xì)胞中（同PG組）。

1.3 分離和提取星形膠質(zhì)細(xì)胞 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性SD 大鼠，1 日齡，體重5～7 g，超凈工作臺中斷頭取腦，取出雙側(cè)大腦皮質(zhì)，除去腦膜和血管，用眼科鑷將其剪成1 mm3大小的組織塊，通過胰蛋白酶和膠原酶消化成為單細(xì)胞懸液，即為星形膠質(zhì)細(xì)胞懸液（所有操作均在冰上進(jìn)行）。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有10%胎牛血清+89%的DMEM-F12+1%青鏈霉素的培養(yǎng)皿中，在37 ℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染CD38并篩選出最適濃度 將序列為5’-CUCAAACCAUACCAUGUAA-3’的siRNA與轉(zhuǎn)染試劑按照說明書混合后，加入細(xì)胞培養(yǎng)皿，并輕輕混勻，24 h 后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h 后檢測CD38mRNA 或CD38 蛋白表達(dá)，并選出CD38-siRNA 的最適轉(zhuǎn)染濃度。轉(zhuǎn)染成功后，取統(tǒng)一轉(zhuǎn)染條件的星形膠質(zhì)細(xì)胞備用。

1.5 ROS試劑盒測定各組ROS的含量 各組PC12細(xì)胞用相應(yīng)的藥物處理后，按照ROS試劑盒操作說明進(jìn)行后，使用熒光酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱（激發(fā)波長設(shè)置為488 nm，發(fā)射波長設(shè)置為525 nm）。

1.6 ATP 試劑盒測定各組ATP 的含量 各組PC12細(xì)胞用相應(yīng)的藥物處理后，按照ATP試劑盒操作說明進(jìn)行后，使用化學(xué)發(fā)光儀檢測各組相對光子強(qiáng)度（relative light unit，RLU）。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）法測定PC12 細(xì)胞p90RSK、p-CREB 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)各組PC12 細(xì)胞用相應(yīng)的藥物處理后，加入適量細(xì)胞裂解液（RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=98∶1∶1）提取總蛋白，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，并與上樣緩沖液混勻、煮沸。各組取適量蛋白加入SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。TBST 漂洗3 次，每次5 min，分別加入兔抗大鼠p90RSK 單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗大鼠p-CREB單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體（1∶1 000）或β-Tubulin（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過夜。TBST漂洗3次，每次5 min，加入羊抗兔HR-IgG 抗體（1∶5 000），常溫?fù)u床孵育1 h。使用Odyssey（LI-COR 公司，美國）掃膜儀掃膜，應(yīng)用Image Lab軟件進(jìn)行分析灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與或β-Tubulin 條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達(dá)水平。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組PC12細(xì)胞凋亡情況 按照Annexin V-PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明進(jìn)行：加入適量Binding Buffer、重懸細(xì)胞、FITC Annexin V與PI 混勻、室溫下避光反應(yīng)5～15 min 后待上機(jī)檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞ROS含量的變化 與C組比較，G組細(xì)胞ROS 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與G組比較，PG組細(xì)胞ROS含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PG 組比較，CPG 組細(xì)胞ROS含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組ROS含量的變化

2.2 各組細(xì)胞ATP含量的變化 與C組比較，G組細(xì)胞ATP 含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與G 組比較，PG 組細(xì)胞ATP 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PG組比較，CPG組細(xì)胞ATP含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組ATP含量的變化

2.3 各組p90RSK 蛋白、p-CREB 蛋白和Bcl-2 蛋白表達(dá)的變化 與C 組比較，G 組p90RSK 蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與G 組比較，PG 組p90RSK 蛋白、p-CREB 蛋白和Bcl-2 蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與PG 組比較，CPG 組p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖3。

圖3 Western blotting檢測各組p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白水平比較

2.4 各組PC12 細(xì)胞凋亡情況 與C 組比較，G 組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與G 組比較，PG 組細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PG 組比較，CPG 組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組PC12細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

谷氨酸是體內(nèi)一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[1]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[8]。當(dāng)體內(nèi)谷氨酸大量釋放和堆積時，可產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，造成神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡[9]。丙泊酚是一種起效快，持續(xù)輸注無蓄積的靜脈麻醉藥。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可降低興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，減輕谷氨酸的神經(jīng)毒性，產(chǎn)生腦保護(hù)作用[6]。本研究通過應(yīng)用丙泊酚及沉默CD38基因，發(fā)現(xiàn)丙泊酚減輕谷氨酸的神經(jīng)毒性可能與CD38和p90RSK/CREB/Bcl-2信號通路有關(guān)。

p90RSK/CREB/Bcl2 信號通路在神經(jīng)元的分化、發(fā)育、生存和凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)給予谷氨酸時，PC12細(xì)胞的ATP含量、p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)降低，ROS含量及細(xì)胞凋亡率上升。當(dāng)加入丙泊酚預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基時，ATP含量、p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)上升，ROS 含量和細(xì)胞凋亡率降低。提示谷氨酸可能通過抑制p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路產(chǎn)生神經(jīng)毒性，丙泊酚可能通過激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路，減輕谷氨酸的神經(jīng)毒性。

CD38 是一種ADP 核糖基環(huán)化酶，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜，可以催化胞外氧化NAD+向細(xì)胞內(nèi)cADPR 轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細(xì)胞質(zhì)，觸發(fā)F-肌動蛋白的構(gòu)象改變，細(xì)胞骨架重塑，促進(jìn)質(zhì)膜的內(nèi)陷及外凸作用[10-12]，而細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)陷及外凸作用與細(xì)胞的胞吞胞吐有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)沉默CD38基因后，再將丙泊酚處理星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基加入谷氨酸干預(yù)PC12細(xì)胞中，ATP含量、p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，ROS 含量及凋亡率升高。說明CD38蛋白在丙泊酚預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞減輕谷氨酸的神經(jīng)毒性中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期研究表明丙泊酚可以激活星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的CD38蛋白，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)星型膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放功能性線粒體至神經(jīng)元，從而修復(fù)受損的神經(jīng)元[13]，而星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放線粒體由Ca2+依賴的CD38/cADPR信號通路介導(dǎo)[14-15]。由此推測：丙泊酚預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞減輕谷氨酸的神經(jīng)毒性可能是通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的CD38 蛋白，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的鈣大量釋放到細(xì)胞質(zhì)，觸發(fā)F-肌動蛋白的構(gòu)象改變，細(xì)胞骨架重塑，促進(jìn)質(zhì)膜的外凸作用，從而釋放功能性線粒體至神經(jīng)元，激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路，修復(fù)受損的神經(jīng)元，減輕谷氨酸的神經(jīng)毒性。

綜上所述，谷氨酸的神經(jīng)毒性可能和p90RSK/CREB/Bcl-2信號通路有關(guān)，而丙泊酚可能通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的CD38 蛋白，激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路，修復(fù)受損的神經(jīng)元，從而減輕谷氨酸的神經(jīng)毒性。而星形膠質(zhì)細(xì)胞是否通過釋放功能性線粒體來激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。