曹雪蓮，辜運(yùn)富，陳 影，劉天海，周 潔，王 迪，彭衛(wèi)紅，唐 杰

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 成都 611130；2.四川省食用菌研究所，四川 成都 610066）

毛頭鬼傘[Coprinus comatus（O.F.Müll.）Pers]，又名雞腿菇，隸屬于真菌界（Fungi）擔(dān)子菌門（Basidiomycota）蘑菇綱（Agaricomycetes）蘑菇目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）鬼傘屬（Coprinus）[1]，野生種質(zhì)資源分布于我國四川、云南、河北、山東、黑龍江、山西、新疆、吉林和內(nèi)蒙古等省、市（自治區(qū)）[2]。毛頭鬼傘是一種食藥兼用的真菌，營養(yǎng)豐富，具有清神寧智、增進(jìn)食欲、降血脂、降血糖等保健功效[3-5]，被譽(yù)為“菌中新秀”[6]。我國毛頭鬼傘的人工栽培始于80年代初期，其生物轉(zhuǎn)化率較高、生長周期短且易于栽培，近年來在我國大宗栽培的食用菌中已經(jīng)占有突出地位。目前對(duì)于毛頭鬼傘的研究主要集中在資源分類、栽培技術(shù)和生理活性等方面?，F(xiàn)有的栽培品種（菌株）較少，尚不能滿足市場對(duì)優(yōu)良品種的需求，野生種質(zhì)的采集和馴化可為優(yōu)良菌株的選育提供物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，在成都市錦江區(qū)沙河公園采集到野生子實(shí)體后，立即對(duì)野生子實(shí)體進(jìn)行組織分離純化，以形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS序列進(jìn)行分析，鑒定其為毛頭鬼傘。并進(jìn)行制種和栽培試驗(yàn)，通過對(duì)子實(shí)體農(nóng)藝性狀觀測、營養(yǎng)成分分析和氨基酸營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)，篩選出營養(yǎng)成分豐富、營養(yǎng)價(jià)值高的毛頭鬼傘菌株，為野生毛頭鬼傘優(yōu)良種質(zhì)資源的進(jìn)一步利用提供有力的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

2019年5月19日在成都市錦江區(qū)沙河公園采集到野生子實(shí)體，見圖1；川毛頭鬼傘1號(hào)，由四川省食用菌研究所提供。

圖1 野生子實(shí)體Fig.1 Fruit body collected from the wild

1.1.2 主要試劑與儀器

Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；通用引物ITS4/ITS5（5′-TCTCCGCTTATTGATATGC-3′/5′-GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGG-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；1.1×T3 Super PCR Mix，北京擎科生物科技有限公司提供；Biometra PCR儀，美國伯樂儀器公司；Thermo超微量分光光度計(jì)，美國賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、瓊脂2%。用于子實(shí)體組織分離、菌絲體純化和提取DNA的樣品培養(yǎng)。

母種培養(yǎng)基：蛋白胨0.2%、酵母浸粉0.2%、葡萄糖2%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、瓊脂2%。

原種培養(yǎng)料：棉籽殼80%、麩皮10%、玉米粉7%、石膏1%、石灰2%，含水量60%～62%。

栽培種培養(yǎng)料：菌糠40%、麥麩30%、稻草20%、麥秸8%、石灰1%、石膏1%，含水量60%～62%。

1.2 分離純化

對(duì)野生子實(shí)體進(jìn)行組織分離、純化培養(yǎng)，獲得菌株編號(hào)為C42。

1.3 鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定和細(xì)胞學(xué)觀察

參照《中國食用菌百科》[7]和《中國大型真菌原色圖鑒》[8]對(duì)野生子實(shí)體進(jìn)行比對(duì)；光學(xué)顯微鏡對(duì)子實(shí)體孢子和菌絲體進(jìn)行觀察、形態(tài)學(xué)鑒定并描述[9-10]。

1.3.2 ITS分析鑒定

菌絲DNA提?。菏占z體，放入-20℃冰箱過夜，液氮研磨，利用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA基因組的提取，超微量分光光度計(jì)檢測DNA濃度，DNA溶液置入-20℃冰箱備用。

ITS-PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：ITS4/ITS5引物各1 μL，DNA 模板 1 μL，PCR Mix 22 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性 2 min；98℃變性 10 s，55℃退火 10 s，72℃延伸10 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min；4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物雙向測序由北京擎科生物科技有限公司完成。

測序結(jié)果在GenBank進(jìn)行序列Blast比對(duì)。采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，MEGA 6.1軟件計(jì)算遺傳距離、Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 栽培方法

1.4.1 母種、原種和栽培種的制備

母種制備：將分離得到的純培養(yǎng)物接種到PDA試管上（20 mm×200 mm），在25℃避光恒溫培養(yǎng)，待菌絲體長滿斜面，備用。

原種制備：將制備好的母種接種到原種瓶中，25℃避光培養(yǎng)至滿瓶，備用。

栽培種制備：栽培袋為聚乙烯袋（規(guī)格200 mm×480 mm×0.028 mm），每袋干料重0.9 kg～1.0 kg，濕料重2.4 kg～2.5 kg，袋子兩端接種，共制備50袋，20℃～25℃避光培養(yǎng)至菌絲體滿袋。

1.4.2 出菇管理

栽培種滿袋后進(jìn)行覆土栽培。畦面寬1 m，畦高15 cm～20 cm，畦面均勻撒一層石灰，將栽培種菌袋放在畦面，菌袋兩端劃口，覆土3 cm～5 cm，加蓋黑色遮陽網(wǎng)小拱棚。每天定時(shí)將小拱棚打開通風(fēng)換氣，每天定時(shí)噴灑水保持畦面濕潤。畦面出現(xiàn)原基后再次覆土，待子實(shí)體長滿畦面，對(duì)第一潮菇進(jìn)行觀測和采收。采收標(biāo)準(zhǔn)為子實(shí)體菌蓋緊實(shí)，菌蓋與菌柄貼合。

1.5 農(nóng)藝性狀測定

子實(shí)體農(nóng)藝性狀分為觀測性狀和測量性狀。觀測性狀包括菌蓋形狀、菌蓋顏色、菌蓋鱗片有無、菌柄顏色和菌柄基部是否膨大；測量性狀為菌蓋長度、菌蓋直徑、菌柄長度、菌柄直徑和菌柄基部直徑，具體測量位置見圖2。

圖2 子實(shí)體縱切面Fig.2 Vertical section of an Coprinus comatus fruit body

1.6 營養(yǎng)成分測定和氨基酸營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

1.6.1 營養(yǎng)成分測定

委托四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所測定毛頭鬼傘新鮮子實(shí)體樣品，主要測定的營養(yǎng)成分有水分、灰分、粗纖維、粗多糖、粗蛋白和氨基酸[11-16]。

1.6.2 氨基酸營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

利用FAO/WHO的必需氨基酸模式[17]，計(jì)算、比較分析蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值[18]。必需氨基酸比值（RAA）的計(jì)算公式為：

式中：Ax為必需氨基酸的含量（%）；As為（FAO/WHO）模式中相應(yīng)的氨基酸含量（%）。

必需氨基酸比值系數(shù)（RC）的計(jì)算公式為：

式中：RAA為必需氨基酸比值；AR為必需氨基酸RAA比值均數(shù)。

必需氨基酸比值系數(shù)分（SRC）的計(jì)算公式為：

式中：RSD為RC的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定結(jié)果

2.1.1 顯微形態(tài)觀察

菌株C42的擔(dān)孢子、菌絲體及菌落形態(tài)特征見圖3。

圖3 形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics

如圖3所示，菌株C42的擔(dān)孢子呈橢圓形，大小為9.84 μm×6.96 μm，表面光滑，顏色呈黑色。顯微鏡下菌株C42的菌絲半透明，有鎖狀聯(lián)合。菌株C42在25℃平板培養(yǎng)10 d～14 d，菌落的氣生菌絲密度密，菌落邊緣整齊。

2.1.2 ITS序列

菌株C42的ITS序列共658個(gè)堿基，GenBank登錄號(hào)為MW850417，以珠雞斑白鬼傘（Leucocoprinus meieagris）MH861816.1為外群，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree

如圖4所示，菌株C42與Coprinus comatus（Gen－Bank登錄號(hào)：MK169229）的相似性高達(dá)100%，并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，鑒定其為毛頭鬼傘（Coprinus comatus）。

2.2 農(nóng)藝性狀

菌株C42和菌株C20的子實(shí)體形態(tài)見圖5，觀測性狀和測量性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

圖5 菌株C20（A）和菌株C42（B）的子實(shí)體Fig.5 fruit bodies of strain C20（A）and strain C42（B）

由圖5和表1可知，菌株C42與菌株C20子實(shí)體形態(tài)相似，2個(gè)菌株的菌蓋形狀、菌蓋顏色、菌蓋鱗片、菌柄顏色和菌柄基部形態(tài)無差異。測量性狀中，菌株C42的菌蓋長度、菌柄長度和菌蓋直徑均比菌株C20的測量值大，但菌柄直徑和菌柄基部直徑均比菌株C20的測量值小。

表1 子實(shí)體的農(nóng)藝性狀Tab.1 Agronomic characters of fruit bodies

2.3 營養(yǎng)成分和氨基酸營養(yǎng)價(jià)值分析

2.3.1 營養(yǎng)成分分析

菌株C42和菌株C20的營養(yǎng)成分分析結(jié)果見表2。

由表2可知，菌株C42的水分含量低于菌株C20，差異不顯著；菌株C42的灰分和粗纖維含量高于菌株C20，差異不顯著；菌株C42的粗多糖和粗蛋白含量高于菌株C20，差異顯著。

表2 2個(gè)毛頭鬼傘菌株的營養(yǎng)成分Tab.2 Nutrient composition of two strains of Coprinus comatus

2.3.2 氨基酸含量分析

對(duì)2株毛頭鬼傘的氨基酸進(jìn)行檢測及計(jì)算，結(jié)果見表3。

由表3可知，C42的總氨基酸含量（TAA）、總必需氨基酸含量（TIAA）和總藥用氨基酸含量（TMAA）都高于C20。

表3 2株毛頭鬼傘氨基酸Tab.3 Amino acids of two strains of Coprinus comatus

2.3.3 氨基酸營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

2個(gè)毛頭鬼傘菌株的必需氨基酸含量與FAO/WHO模式譜的必需氨基酸進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。

由表4可知，菌株C42的蛋氨酸+半胱氨酸和賴氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于菌株C20，但其他必需氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于菌株C20。2個(gè)菌株的7種必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于FAO/WHO模式譜，由此說明菌株C42和菌株C20的營養(yǎng)均衡合理，具有一定的營養(yǎng)價(jià)值。

表4 2個(gè)毛頭鬼傘菌株與FAO/WHO模式譜必需氨基酸的比較Tab.4 Comparison of indispensable amino acids between two strains of Coprinus comatu and FAO/WHO pattern spectra

計(jì)算2個(gè)毛頭鬼傘菌株的RAA、RC及SRC值，結(jié)果見表5。

由表5可知，菌株C42和菌株C20中蛋氨酸+半胱氨酸、亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸的RC＜1，表明這些氨基酸在蛋白質(zhì)中相對(duì)不足；蘇氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸和賴氨酸的RC＞1，表明這些氨基酸在蛋白質(zhì)中相對(duì)過剩[19]。菌株C42的SRC大于菌株C20，說明菌株C42的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值高于菌株C20。

表5 2株毛頭鬼傘的RAA、RC及SRC值Tab.5 RAA,RC and SRC of two trains of Coprinus comatu

3 討論

由于毛頭鬼傘的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值較高，早在20世紀(jì)90年代就開始在全國各地大面積栽培；2020年末其產(chǎn)量占全國食用菌產(chǎn)量的0.31%，且呈現(xiàn)繼續(xù)增長趨勢；因此亟需選育優(yōu)良菌株。

通過對(duì)野生子實(shí)體進(jìn)行分離純化，將獲得的毛頭鬼傘菌株C42進(jìn)行覆土栽培，馴化出菇。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生子實(shí)體馴化后的菌株C42菌蓋鱗片不明顯，菌柄基部膨大，與對(duì)照菌株C20的農(nóng)藝性狀相比觀測性狀無明顯差異；測量性狀中菌株C42的菌蓋長度、菌柄長度和菌蓋直徑比菌株C20的測量值高，菌柄直徑和菌柄基部直徑比菌株C20的測量值低，綜合農(nóng)藝性狀較好。子實(shí)體鮮樣的營養(yǎng)成分測定結(jié)果表明，菌株C42的營養(yǎng)成分比菌株C20高，粗多糖和粗蛋白的含量有顯著差異；2個(gè)菌株的必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于FAO/WHO模式譜，且第一限制氨基酸均為蛋氨酸和半胱氨酸，與曹晉良[20]研究的結(jié)果一致；比較2個(gè)菌株的SRC值，發(fā)現(xiàn)菌株C42的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值高于菌株C20。該野生毛頭鬼傘菌株?duì)I養(yǎng)成分豐富，營養(yǎng)價(jià)值高，具有進(jìn)一步發(fā)掘利用的價(jià)值。