◎ 種 婷

（遼寧省檢驗檢測認(rèn)證中心，遼寧 沈陽 110032）

1 蠟樣芽孢桿菌的危害

蠟樣芽孢桿菌是一種普遍存在于自然環(huán)境中的細(xì)菌，如存在于土壤、空氣、水中等，是芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生內(nèi)孢子。蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒占全球所有食物中毒事件的1.4%～12.0%，2018年歐盟有98起由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件，蠟樣芽孢桿菌毒素繼沙門氏菌、彎曲桿菌、諾如病毒和金黃色葡萄球菌之后排在第5位[1-2]。2018年中國疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生應(yīng)急中心發(fā)布的我國食物中毒事件數(shù)據(jù)顯示，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件占細(xì)菌性食物中毒事件總數(shù)和中毒總?cè)藬?shù)的5.61%和6.80%，僅次于沙門氏菌、副溶血性弧菌、致泄大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及其腸毒素，位列第5位[3]。關(guān)于蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素Cereulide引起的食物中毒報告越來越多，由于嘔吐毒素Cereulide是原料中的蠟樣芽孢桿菌在生長過程中預(yù)先形成的，因此在某些中毒事件中只檢測到Cereulide，沒有分離出蠟樣芽孢桿菌[4]。

2 嘔吐毒素Cereulide的特性

Cereulide最初由AGATA等[5]發(fā)現(xiàn)，是一種環(huán)狀十二肽，由6個α-氨基酸和6個α-羥基酸組成，基本的氨基酸序列為[D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-DVal]3。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是肽和酯鍵交替鍵合（圖1），具有高度親脂性和極強(qiáng)的耐熱性，在pH值為2～11范圍穩(wěn)定，在121 ℃下持續(xù)2 h后也不會失去活性，它對胃蛋白酶和胰蛋白酶具有抵抗力，不會在通過宿主胃時失活。由于其分子量為1.2 kDa，不能通過食品加工中的常規(guī)滅菌方式（如真空除菌或過濾）去除，也不會通過熱處理使其失活，所以Cereulide幾乎不能被去除或滅活[6]。因此，防止其在食品生產(chǎn)和加工中合成至關(guān)重要。

3 嘔吐毒素Cereulide的合成及影響因素

Cereulide由一種非核糖體肽合成酶（Non-ribosomal Peptide Synthetase，NRPS）合成，稱為Ces-NRPS[7]。NRPS是大型模塊化多酶復(fù)合物，編碼Cereulide合成酶的基因位點(diǎn)顯示了NRPS基因團(tuán)的典型結(jié)構(gòu)。ces基因在pCER270巨型質(zhì)粒上編碼，該質(zhì)粒與來自炭疽桿菌的pXO1毒素質(zhì)粒類似[8]。24 kb ces基因團(tuán)總共包含7個編碼序列。cesA和cesB是結(jié)構(gòu)性合成酶基因，除了結(jié)構(gòu)合成酶基因外，相應(yīng)的基因位點(diǎn)通常包含參與激活NRPS的基因，在ces基因的5'端有cesH一種功能未知的水解酶；cesP一種磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶（Phosphopantetheinyl Transferase，PPtase），參與合成酶的活化；cesT是一種II型硫酯酶，被認(rèn)為與去除錯誤引發(fā)的單體有關(guān)。在ces基因的3'端，有兩個編碼序列，稱為cesC和cesD，編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。轉(zhuǎn)運(yùn)子ABC不僅負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)毒素，并且將cesA、cesB合成酶固定在細(xì)胞膜上，在Cereulide生物合成中發(fā)揮重要作用[9]。

有研究發(fā)現(xiàn)，染色體上的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子cesP、cesT、cesA、cesB、cesC和cesD在合成Cereulide上起著關(guān)鍵作用。LüCKING等[10]對蠟樣芽孢桿菌F4810/72的缺失突變體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ces基因不受PlcR的控制，ces基因受Spo0A-AbrB控制。spo0A的sigma（A）驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄對Cereulide合成至關(guān)重要，而spo0A的sigma（H）驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄不影響Cereulide的合成。AbrB被證明可以有效地與ces操縱子的主要啟動子區(qū)域結(jié)合，這表明AbrB通過對ces轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負(fù)面影響而充當(dāng)Cereulide合成的阻遏物。相比之下，CodY作為全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在Cereulide合成中起關(guān)鍵作用，CodY的缺失導(dǎo)致PlcR的毒力基因下調(diào)，同時ces基因上調(diào)，CodY被發(fā)現(xiàn)是ces操縱子的阻遏子，CodY與免疫抑制劑金屬蛋白酶InhA1的啟動子結(jié)合，將蠟樣芽孢桿菌的代謝與毒力聯(lián)系起來[11]。

不僅內(nèi)在因素對Cereulide的產(chǎn)生有影響，外在環(huán)境因素對Cereulide的產(chǎn)生亦有重大影響[4]。研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌生長速率和Cereulide產(chǎn)量是不相關(guān)的，這表明僅用細(xì)菌數(shù)量或生長速率預(yù)測Cereulide產(chǎn)生風(fēng)險是不合適的。MARXEN等[12]用質(zhì)譜法對Cereulide進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Cereulide至少有18種異構(gòu)體，并且首次發(fā)現(xiàn)isocereulides A～G異構(gòu)體。KRANZLER等[13]研究發(fā)現(xiàn)，溫度不僅影響Cereulide的總量，還影響Cereulide異構(gòu)體的形成，并且異構(gòu)體的毒性顯著不同，isocereulide A的毒性比Cereulide高8～10倍，而其他亞型幾乎無毒，因此預(yù)測Cereulide產(chǎn)生方面應(yīng)考慮溫度的影響。一般來說，在中性pH值、淀粉、碳水化合物、維生素和微量元素含量高的食品中易產(chǎn)生Cereulide，而低氧水平和高NaCl濃度會產(chǎn)生負(fù)面影響[2]。

4 結(jié)語

蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素引起的中毒事件日趨增多，嘔吐毒素的耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性使其難以被消除和破壞。因此，在食品制造過程或儲存過程中及時發(fā)現(xiàn)Cereulide的存在顯得尤為重要。傳統(tǒng)微生物法檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗周期長、效率低，而且不能區(qū)分蠟樣芽孢桿菌是否產(chǎn)嘔吐毒素。以已知非核糖體肽合成酶（NRPS）的高度保守基因序列為靶點(diǎn)的簡并寡核苷酸引物用于擴(kuò)增和鑒定蠟樣芽孢桿菌中假定的NRPS基因片段，設(shè)計了用于檢測產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌的PCR系統(tǒng)[14]和TaqMan探針的實(shí)時PCR系統(tǒng)[15]。近年來，質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步也顯著提高了嘔吐毒素的鑒定診斷水平?；|(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜可以基于某些生物標(biāo)志物直接檢測Cereulide，以區(qū)分產(chǎn)嘔吐毒素和不產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌[16]。研究人員要根據(jù)Cereulide的特點(diǎn)開發(fā)新方法、新技術(shù)，以期快速、準(zhǔn)確、高效地檢測Cereulide，為食品安全提供保障。