景雪梅 王 雷 劉 暉 程調(diào)娟 趙娟龍 劉 亮 袁 斌 陶 軍

（天水眾興菌業(yè)科技股份有限公司，甘肅 天水 741000）

雜交育種是一種經(jīng)典育種方法，可以獲得具有新農(nóng)藝性狀特征的雜交菌株，達(dá)到改變色澤、改善菇形、縮短育種周期等育種目標(biāo)[1]。金針菇（Flammulina velutipes）是一種美味食用菌，是當(dāng)今市場(chǎng)上走俏的天然保健食品之一，有“抗癌益智菇”的佳譽(yù)[2]。

金針菇分黃色和白色兩種，野生菌株為黃色，白色為變異株。黃色金針菇生長(zhǎng)速度快，抗逆性強(qiáng)，菇體呈深黃色，基部褐色，品相較差，但菌香味濃，口感優(yōu)于白色金針菇[3]。白色金針菇出菇整齊，性狀穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高，多為工廠化生產(chǎn)。本試驗(yàn)選擇白色和黃色金針菇作親本進(jìn)行雜交，以期獲得農(nóng)藝性狀優(yōu)良、口感佳，且適合工廠化栽培的淺黃色全新金針菇菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

雜交親本：黃色金針菇菌株Q100，具有柄粗、耐貯藏、生長(zhǎng)周期短、抗病性強(qiáng)的特點(diǎn)；白色金針菇菌株QFC，為工廠化栽培，具有高產(chǎn)、菇形整齊、性狀穩(wěn)定的特點(diǎn)。以上菌種均為眾興菌業(yè)公司保存。

母種培養(yǎng)基：日本寒天培養(yǎng)基，稱(chēng)取培養(yǎng)基39 g，蒸餾水1 000 mL。

搖瓶配方：豆粕2 g，白砂糖12.5 g，KH2PO40.4 g，MgSO40.4 g，水640 mL。

栽培配方：玉米芯34.34%、米糠31.26%、麩皮7.05%、棉籽殼6.27%、大豆皮5.34%、啤酒糟6.63%、甜菜渣3.15%、輕質(zhì)碳酸鈣1%、豆渣3.05%、貝殼粉1.91%，含水量65%～67%，滅菌前pH 6.5～7.0，滅菌后pH 6.3～6.4。

1.2 選育方法

1.2.1 孢子收集與保藏

挑選農(nóng)藝性狀優(yōu)良且未開(kāi)傘的七八分成熟的親本金針菇子實(shí)體，除去表面雜質(zhì)并消毒，取未開(kāi)傘、圓潤(rùn)、肉厚的菇帽，將菇帽子實(shí)層朝下粘在平皿上，以封口膜封口后常溫放置2天左右，去掉菇帽后再封口，置于4 ℃冰箱保存[4]。

1.2.2 多孢雜交

將收集的親本孢子各自制成孢子懸液，兩者混合后稀釋至3×104個(gè)/mL（血球計(jì)數(shù)板法）。取60 μL涂布于PDA平板，在18 ℃下暗培養(yǎng)12～15天，直至平板上肉眼可見(jiàn)大片密集菌落后，用接種針挑選有拮抗現(xiàn)象的小菌絲塊轉(zhuǎn)接于PDA平板上，繼續(xù)培養(yǎng)5～6天。在菌落外緣挑取菌絲制片鏡檢，選有鎖狀聯(lián)合且長(zhǎng)勢(shì)良好的雜交菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)后于4 ℃下保存?zhèn)溆肹5，6]。

1.2.3 出菇篩選試驗(yàn)

（1）初篩。將1.2.2節(jié)得到的雜交菌株進(jìn)行出菇試驗(yàn)，培養(yǎng)料按栽培配方進(jìn)行配制，干拌均勻后加水?dāng)嚢?0 min，含水量控制在65%～67%。采用裝瓶機(jī)裝入1 500 mL的聚丙烯栽培瓶，每瓶濕料重1 060 g。高壓滅菌后，采用液體菌種接種，每菌株接種16瓶。菌絲培養(yǎng)至滿瓶后，移入育菇房進(jìn)行工廠化出菇管理[7，8]，觀察記錄出菇整齊度、子實(shí)體形態(tài)特征等，并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量，篩選出農(nóng)藝性狀較好的菌株進(jìn)入二次栽培試驗(yàn)。

（2）二次篩選。對(duì)初篩得到的優(yōu)勢(shì)雜交菌株進(jìn)行二次栽培篩選，配方、拌料、裝瓶等方法同初篩試驗(yàn)。每菌株接種3筐，每筐16瓶。待菌絲長(zhǎng)滿栽培瓶后，用自動(dòng)搔菌機(jī)搔菌，搔菌后移入育菇房行出菇管理，觀察記錄出菇整齊度、子實(shí)體形態(tài)特征等，并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量，計(jì)算生物學(xué)效率。篩選出優(yōu)良菌株，作為與親本作對(duì)比試驗(yàn)的參試菌株。

1.2.4 雜交菌株與親本的對(duì)比試驗(yàn)

（1）拮抗試驗(yàn)。將篩選得到的雜交菌株菌絲體及親本的菌絲體按“品”字形接入日本寒天平板培養(yǎng)基[9]。觀察并記錄雜交菌株與親本交界處的菌絲生長(zhǎng)情況。

（2）菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定。用接種針?lè)謩e將雜交菌株和親本的菌絲體劃分為4 mm×4 mm×3 mm大小的菌種塊，接種到日本寒天培養(yǎng)基上，放入18 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第6天測(cè)量菌落半徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度[10]。每個(gè)菌株設(shè)3次重復(fù)。

（3）出菇試驗(yàn)。按栽培配方制料，滅菌后待料溫冷卻到19 ℃以下時(shí)，采用自動(dòng)接種機(jī)在無(wú)菌條件下接種，每菌株接種10筐，每筐16瓶。接種后置于恒溫恒濕培養(yǎng)室內(nèi)，14～17.5 ℃暗培養(yǎng)22天。待菌絲長(zhǎng)滿栽培瓶后，采用自動(dòng)搔菌機(jī)搔菌，之后移入育菇房進(jìn)行出菇管理。每筐隨機(jī)抽取2瓶，測(cè)定產(chǎn)量、生物學(xué)效率和子實(shí)體性狀等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交菌株的出菇篩選試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)多孢雜交獲得的78個(gè)雜交菌株進(jìn)行鏡檢，選取具有鎖狀聯(lián)合且長(zhǎng)勢(shì)良好的雜交菌株24個(gè)，進(jìn)入初次出菇篩選試驗(yàn)。

2.1.1 初篩結(jié)果

由表1可知，各雜交菌株之間的產(chǎn)量、生物學(xué)性狀差異顯著，經(jīng)過(guò)初篩，選出菇帽顏色淡黃、菇柄硬挺、產(chǎn)量超過(guò)360 g的優(yōu)勢(shì)菌株8個(gè)，產(chǎn)量從高到低依次為：ZX105 ＞ ZX112 ＞ ZX108 ＞ ZX111 ＞ZX124 ＞ ZX107 ＞ZX117 ＞ ZX119。其中，除ZX108和ZX111，ZX117和ZX119之間的產(chǎn)量差異不顯著外，其余6個(gè)雜交菌株之間均有顯著性差異。

表1 雜交菌株第一次栽培出菇的子實(shí)體產(chǎn)量和生長(zhǎng)表現(xiàn)

ZX101、ZX103、ZX104、ZX106、ZX110、ZX118、ZX122、ZX123等8個(gè)菌株因出芽少或未出芽，ZX113因出芽過(guò)多過(guò)粗，均予以淘汰，未對(duì)其子實(shí)體生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。

2.1.2 二次篩選結(jié)果

對(duì)初篩選出的8個(gè)優(yōu)勢(shì)雜交菌株進(jìn)行二次栽培出菇試驗(yàn)，獲得優(yōu)良菌株ZX112，作為后續(xù)參試菌株。從表2可知，8個(gè)優(yōu)勢(shì)雜交菌株的產(chǎn)量以ZX105為高，但其有脫蕾現(xiàn)象；菌株ZX112產(chǎn)量居次，為443.13 g，與其余7個(gè)菌株均有顯著性差異。ZX112表現(xiàn)出芽量適中，生物學(xué)效率124%～133%；子實(shí)體生長(zhǎng)表現(xiàn)較好，菇體緊實(shí)，較硬挺，邊菇少，菇帽呈淡黃色偏白，肉厚，有質(zhì)感，直徑0.3～0.8 cm；菇柄基部呈淡黃色，上部為淡黃偏白，高15～17. 5 cm，直徑0.3～0.4 cm。

表2 8個(gè)優(yōu)勢(shì)雜交菌株的出菇產(chǎn)量及子實(shí)體的生長(zhǎng)表現(xiàn)

2.2 雜交菌株與親本對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

拮抗試驗(yàn)是一種快速檢測(cè)菌株間親緣關(guān)系的方法。對(duì)雜交菌株ZX112和兩親本Q100、QFC進(jìn)行拮抗試驗(yàn)的結(jié)果顯示，3個(gè)菌株之間菌絲尖端互不融合，均能形成明顯的溝狀拮抗線（圖1）。表明雜交菌株ZX112是不同于兩親本的菌株。

圖1 雜交菌株ZX112與兩親本的拮抗比較

2.2.2 雜交菌株和親本的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)

從表3可以看出，雜交菌株ZX112的菌絲平均生長(zhǎng)速度介于兩個(gè)親本之間，與兩親本均有顯著差異；菌絲長(zhǎng)勢(shì)略弱于白色親本，與黃色親本相近，表現(xiàn)為氣生菌絲較少。3個(gè)菌株均無(wú)粉孢子。

表3 優(yōu)良雜交菌株與兩親本的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)

2.2.3 雜交菌株和親本的子實(shí)體生長(zhǎng)表現(xiàn)

為進(jìn)一步比較雜交菌株ZX112與兩親本之間的子實(shí)體農(nóng)藝性狀差異，進(jìn)行3次重復(fù)瓶栽試驗(yàn)，綜合統(tǒng)計(jì)出芽情況及現(xiàn)蕾時(shí)間（從進(jìn)入育菇房到開(kāi)始現(xiàn)蕾的時(shí)間）、采收時(shí)間（從進(jìn)入育菇房到開(kāi)始采收的時(shí)間）、采收期（從開(kāi)始采收到采收結(jié)束的時(shí)間）等指標(biāo)的結(jié)果如下。

黃色親本Q100的菇蕾少，生長(zhǎng)初期粗壯，呈黃褐色，幼蕾期生長(zhǎng)速度較快。白色親本QFC的幼蕾整齊，呈白色，菇柄較細(xì)，生長(zhǎng)速度較慢。雜交菌株ZX112幼蕾期表現(xiàn)良好，遺傳了雙親的優(yōu)良性狀，幼菇菇柄粗且挺拔，顏色略淺于黃色親本Q100（圖2）。

圖2 雜交菌株ZX112與兩親本出芽情況比較（入育菇房10天時(shí)）

雜交菌株ZX112和黃色親本Q100的現(xiàn)蕾時(shí)間同步，均為4天，比白色親本QFC早1天。從采收時(shí)間看，雜交菌株ZX112最先開(kāi)始采收，分別比黃色親本和白色親本提早1天和3天。雜交菌株ZX112和親本Q100的采收期一致，均為2天，其子實(shí)體瓶間發(fā)育速度的差異比白色親本QFC小，同步性較好。

從子實(shí)體農(nóng)藝性狀看，親本QFC是工廠化主栽品種，其菇體雪白、現(xiàn)蕾整齊，菇柄粗細(xì)均勻、基部無(wú)絨毛、根部不粘連，菇帽呈小球狀內(nèi)卷不易開(kāi)傘，產(chǎn)量高（530 g/瓶）。而親本Q100呈黃褐色，菇柄粗，直徑為2～4 mm，菇帽呈鐘蓋形，易開(kāi)傘，易有水帽，菌絲吃料能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快（菌絲培養(yǎng)期22天、出菇期25天），是傳統(tǒng)袋栽的主要品種，工廠化栽培條件下易吐黃水，產(chǎn)量偏低（430.50 g/瓶）。雜交菌株ZX112遺傳了雙親的優(yōu)良性狀，表現(xiàn)菇形好，菇柄粗、挺拔，基部呈黃色、上部淡黃偏白，菌肉厚實(shí)，菇帽呈淡黃色，略?xún)?nèi)卷，不易開(kāi)傘，單瓶產(chǎn)量達(dá)446.0 g，與兩個(gè)親本的產(chǎn)量均達(dá)顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)黃色金針菇和白色金針菇的多孢雜交，獲得淺黃色雜交菌株。對(duì)雜交所得的菌株進(jìn)行初步篩選的結(jié)果表明，多孢雜交后的菌株大部分菌絲稀薄，活力較弱；而長(zhǎng)勢(shì)較好的雜交菌株菌絲較白、密，生長(zhǎng)速度快于兩親本。復(fù)篩發(fā)現(xiàn)雜交菌株子實(shí)體顏色均為淺黃色，在出芽階段由于濕度不均勻，部分雜交菌株出現(xiàn)吐黃水及輕微脫蕾現(xiàn)象，但脫蕾對(duì)后期的整體菇形影響不大。

經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩試驗(yàn)，選出子實(shí)體農(nóng)藝性狀較好、產(chǎn)量較高的雜交菌株ZX112，其與兩親本的比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在母種培養(yǎng)階段，雜交菌株ZX112的菌絲形態(tài)與黃色親本較為接近，比白色親本氣生菌絲少，但菌絲長(zhǎng)速更快；在栽培階段，雜交菌株生長(zhǎng)快、采收早，優(yōu)于2個(gè)親本菌株。從農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量看，雜交菌株ZX112的產(chǎn)量稍高于黃色親本，低于白色親本，但菇形、菇體緊實(shí)度均優(yōu)于黃色親本，更接近于白色親本；其色澤為淺黃，菇形整齊，菇柄粗壯，生長(zhǎng)周期短，較適合于工廠化栽培及市場(chǎng)推廣。

表4 雜交菌株與親本的子實(shí)體性狀及產(chǎn)量比較

圖3 雜交菌株ZX112與兩親本子實(shí)體農(nóng)藝性狀比較