劉曉瑜 馬 璐 楊 馳 肖冬來 江曉凌 應(yīng)正河 林衍銓

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350014）

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia）又名繡球菌，含有豐富的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤[1]、提高造血功能[2]和調(diào)節(jié)免疫[3]等作用，在保健品、功能食品和化妝品等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景[4]。繡球菌近年來已實現(xiàn)工廠化栽培，以瓶裝木屑菌種為主，液體菌種培養(yǎng)是其重要生產(chǎn)環(huán)節(jié)。

研究表明，許多外源添加物如脂肪酸、有機溶劑、表面活性劑、植物油等能夠提高多種食用菌在液體培養(yǎng)中的菌絲生長速度，同時增加活性代謝物的產(chǎn)量。表面活性劑分子通過改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、增大細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物分泌[5]，如在發(fā)酵第5天向虎奶菇（Pleurotus tuber-regium）培養(yǎng)液中添加3.0 g/L吐溫（Tween 80），可使菌絲體生物量和多糖產(chǎn)量分別提高51.3%和41.8%[6]；樺褐孔菌（Inonotus obliquus）液體培養(yǎng)中添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween 80、TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚，一種表面活性劑），對樺褐孔菌多糖的促進(jìn)效果顯著[7]。脂肪酸或油脂類物質(zhì)廣泛應(yīng)用于食用菌液體培養(yǎng)研究，能夠促進(jìn)靈芝（Ganoderma lucidum）、灰樹花（Grifola frondosa）等菌絲生長及真菌多糖的產(chǎn)生[8，9]；添加0.5%的橄欖油和大豆油能夠提高灰樹花胞外多糖的含量[10]。

目前繡球菌液體培養(yǎng)研究多以培養(yǎng)工藝條件優(yōu)化及提高次生代謝產(chǎn)物為主[11-15]，前期研究已獲得適宜的培養(yǎng)基配方，并優(yōu)化了培養(yǎng)條件[16，17]，但關(guān)于脂肪酸、有機溶劑、表面活性劑和植物油等外源添加物對繡球菌液體培養(yǎng)效果評價的研究較少。本試驗探究外源添加物對繡球菌液體培養(yǎng)的作用，以為其液體菌種工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

廣葉繡球菌‘閩繡1號’由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基（PDPA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，魚粉蛋白胨2 g/L，瓊脂粉16 g/L。

液體菌種培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，魚粉蛋白胨3 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，KH2PO41.5 g/L，pH自然。

脂肪酸、有機溶劑、表面活性劑試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖70 g/L，魚粉蛋白胨2 g/L，KH2PO43 g/L，pH 自然。

消泡劑試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，魚粉蛋白胨2 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然。

Tween 80添加量試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，玉米粉10 g/L，糯米粉30 g/L，KH2PO43 g/L，pH自然。

Tween 80添加時間試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，玉米粉10 g/L，糯米粉30 g/L，KH2PO43 g/L，Tween 80 4 g/L，pH自然。

1.3 試驗方法

（1）菌種活化及液體菌種培養(yǎng)。制備PDPA斜面培養(yǎng)基，接種后避光、24±1 ℃培養(yǎng)20天備用。制備液體菌種培養(yǎng)基，采用250 mL三角瓶，裝液量100 mL，滅菌后接種活化菌種6～8塊，于24±1 ℃、150 r/min下震蕩培養(yǎng)10天，備用。

（2）外源添加物對液體培養(yǎng)的影響。選取4大類14種外源添加物加入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行液體培養(yǎng)，以不添加為對照。

脂肪酸4種，分別為亞油酸、油酸、軟脂酸、硬脂酸，添加量為2 g/L。

有機溶劑4種，分別為甲醇、乙醇、正己烷、氯仿，添加量為體積分?jǐn)?shù)0.2%。

表面活性劑4種，分別為Tween 20、Tween 80、CHAPS、Triton X-100，添加量為2 g/L。

消泡劑2種，分別為橄欖油（Olive oil）：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L；花生油（Peanut oil）：0.1、0.2 、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L。

（3）Tween 80添加量及添加時間對液體培養(yǎng)的影響。Tween 80添加量分別為2、4、6、8、10、12、14、16 g/L，以不添加為對照。Tween 80（4 g/L）分別在接種后0（CK）、3、5、7、11、15 天加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

（4）液體培養(yǎng)條件。采用250 mL三角瓶，裝液量100 mL，滅菌后按體積分?jǐn)?shù)為8%的接種量接種液體菌種培養(yǎng)基，避光、24±1 ℃、150 r/min下培養(yǎng)15 天后，按以下方法進(jìn)行測定。

1.4 測定指標(biāo)

培養(yǎng)基pH：培養(yǎng)結(jié)束后，用pH計測定培養(yǎng)基終點pH。菌球直徑與菌球密度：采用移液槍隨機吸取一定體積培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液中的菌球排列成直線，測總長度，取平均值，得菌球直徑（mm）；對培養(yǎng)液中的菌球計數(shù)，得菌球密度（個/mL）。菌絲體生物量：用清水充分沖洗經(jīng)紗布過濾的菌球，將菌球于40 ℃下烘干至恒重，用電子天平稱重后即得菌絲體生物量（g/L）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS Statistics 25.0（SPSS， Chicago， Illinois）對上述實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析和Duncan 檢驗（P＜ 0.05）分析試驗組與對照組間的差異顯著性。

2 試驗結(jié)果

2.1 脂肪酸對繡球菌液體培養(yǎng)的作用

在液體培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2 g/L的亞油酸、油酸、軟脂酸和硬脂酸后，繡球菌液體培養(yǎng)效果如表1所示。培養(yǎng)基終點pH，與對照相比，添加亞油酸的試驗組顯著提高，其他3個脂肪酸組也有提高，但差異不顯著。菌球直徑，添加油酸組較對照提高37.67%，差異顯著，其余3種脂肪酸均有提高作用，以油酸效果較明顯，比對照提高33.34%，但未達(dá)到顯著性差異。菌絲體生物量，加入油酸對其有促進(jìn)作用，較對照提高17.65%，而加入亞油酸則顯著降低。

表1 培養(yǎng)基中添加不同脂肪酸的繡球菌液體培養(yǎng)情況

以上表明，添加2 g/L油酸對菌球直徑、菌球密度和菌絲體生物量均有一定促進(jìn)作用，而添加等量的亞油酸、軟脂酸和硬脂酸對繡球菌液體培養(yǎng)生物量的提高無明顯效果。

2.2 有機溶劑對繡球菌液體培養(yǎng)的作用

在液體培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲醇、乙醇、正己烷和氯仿后，繡球菌液體培養(yǎng)效果如表2所示。甲醇和乙醇顯著降低培養(yǎng)基終點pH。四者均可增大菌球直徑，但僅氯仿的效果達(dá)到顯著水平。甲醇對提高菌球密度有一定促進(jìn)作用，并使菌絲體生物量較對照增加24.14%，差異顯著；其余3種有機溶劑均降低菌球密度，而對菌絲體生物量無顯著影響。表明加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲醇對菌球直徑、菌球密度和菌絲體生物量均有一定促進(jìn)作用，而添加等量的乙醇、正己烷和氯仿對繡球菌液體培養(yǎng)生物量的提高無顯著效果。

表2 培養(yǎng)基中添加不同有機溶劑的繡球菌液體培養(yǎng)情況

2.3 表面活性劑對繡球菌液體培養(yǎng)的作用

液體培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2 g/L的Tween 20、Tween 80、CHAPS和Triton X-100后，繡球菌液體培養(yǎng)效果如表3所示。CHAPS和Triton X-100嚴(yán)重抑制菌絲生長，無菌球或僅有少量菌球生長，均不適合用于繡球菌液體培養(yǎng)。Tween 20對提高菌球密度及菌絲體生物量有促進(jìn)作用，分別較對照提高20.00%和10.53%；Tween 80也能在一定程度上提高菌球密度，但效果次于Tween 20。

表3 培養(yǎng)基中添加不同表面活性劑的繡球菌液體培養(yǎng)情況

2.4 植物油對繡球菌液體培養(yǎng)的作用

油脂類用于液體培養(yǎng)不僅可消泡，還可為菌絲生長提供一定營養(yǎng)，已廣泛應(yīng)用于液體培養(yǎng)工業(yè)。在繡球菌液體培養(yǎng)基中添加橄欖油和花生油的試驗結(jié)果見圖1。

在添加濃度范圍內(nèi)，隨著橄欖油添加量的增大，培養(yǎng)終點pH逐漸降低，但未達(dá)顯著性差異（圖1-A）。菌球直徑，添加量為0.2～0.6 g/L的試驗組與對照組相比均顯著增大，其中以添加量為0.5 g/L的最大（圖1-B）。菌球密度在添加量為0.2 g/L時促進(jìn)效果較好，但在試驗濃度范圍內(nèi)，各組間無顯著性差異（圖1-C）。菌絲體生物量在供試添加量范圍內(nèi)整體呈上升趨勢，各試驗組與對照相比，均達(dá)到顯著性差異，且以添加量為0.5 g/L的最大（圖1-D）。表明在培養(yǎng)基中加入0.5 g/L的橄欖油能顯著提高菌球直徑和菌絲體生物量。

花生油除添加量為0.1 g/L時的培養(yǎng)基終點pH有顯著增大外，其他試驗組的變化差異均不顯著（圖1-A）。菌球直徑隨添加量的增加呈上升趨勢，添加量為0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L和0.6 g/L時，分別較對照組提高23.93%、24.90%、25.29%和27.97%（圖1-B），差異均顯著。在添加量0.1～0.6 g/L范圍內(nèi)，菌球密度的變化差異不顯著（圖1-C）。隨著花生油添加量的增加，各試驗組菌絲體生物量分別較對照提高60.68%、94.87%、79.49%、123.93%、117.09%和100.00%，均顯著高于對照，其中以添加量為0.4 g/L的最高（圖1-D）。表明在培養(yǎng)基中加入0.1～0.6 g/L花生油均能促進(jìn)繡球菌菌絲體生物量的積累，添加量為0.4 g/L時促進(jìn)效果較好。

圖1 橄欖油及花生油添加量對繡球菌液體培養(yǎng)的影響

2.5 Tween 80添加量及添加時間對繡球菌液體培養(yǎng)的作用

Tween 80在食用菌液體培養(yǎng)中的應(yīng)用較廣，前期試驗結(jié)果顯示其可提高繡球菌的菌球密度，本試驗進(jìn)一步探索其適宜的添加量和添加時間。在供試培養(yǎng)基中加入2～16 g/L Tween 80后，培養(yǎng)基終點pH和菌球直徑無顯著變化，但對菌球密度的影響較大（表4）。添加量為2 g/L時，菌球密度顯著降低，之后隨添加量增大，菌球密度逐漸升高，添加量為16 g/L時最大，比對照提高28.63%，達(dá)到顯著水平。在供試范圍內(nèi)，添加Tween 80均可顯著提高菌絲體生物量，添加量為4 g/L時達(dá)到較高水平，為0.107 g/L，之后隨添加量的繼續(xù)增加，增勢趨緩，添加量為14 g/L時達(dá)到最大，為0.109 g/L，較對照提高28.23%。

表4 不同Tween 80添加量的繡球菌液體培養(yǎng)情況

在液體培養(yǎng)不同時間添加4 g/L Tween 80，對培養(yǎng)基終點pH和菌球直徑的影響不大（表5）；而菌球密度有一定提高，以接種后第11天添加Tween 80的菌球密度最大，較對照提高48.89%，但差異不顯著；菌絲體生物量以接種后第3天加入Tween 80的最大（1.41 g/100mL），較對照提高34.29%，差異顯著，其后隨添加時間的延遲而逐漸降低。表明添加4 g/L的Tween 80能在一定程度上促進(jìn)繡球菌液體培養(yǎng)的菌絲生長，且在培養(yǎng)初期（3天）添加可獲得較好的促進(jìn)效果。

表5 Tween 80不同添加時間的繡球菌液體培養(yǎng)情況

3 結(jié)論與討論

食藥用菌液體培養(yǎng)中加入一定量的外源物質(zhì)，可顯著提高菌絲體生物量，這些物質(zhì)通過改變細(xì)胞膜通透性，在培養(yǎng)體系中起緩沖作用，或提供一定的營養(yǎng)成分起到促生作用，以脂肪酸、有機溶劑、表面活性劑、植物油類研究較多，相關(guān)研究在多種食用菌中已有報道。

不同脂肪酸對繡球菌液體培養(yǎng)效果的作用存在差異，其中油酸對菌球直徑、菌球密度和菌絲體生物量均有一定促進(jìn)作用；軟脂酸和硬脂酸能增加菌球密度，但菌絲體生物量有所下降；亞油酸顯著降低菌絲體生物量，抑制菌絲生長。這與虎奶菇[6]、樺褐孔菌[7]和蛹蟲草[18]的液體培養(yǎng)研究結(jié)果一致。Kavishree等[19]測定了不同食用菌的脂質(zhì)組成，發(fā)現(xiàn)繡球菌中含有飽和脂肪酸軟脂酸和多不飽和脂肪酸亞油酸，同時亞油酸和油酸比例小于1。不同菌類的菌絲體脂肪酸構(gòu)成不同，可能會影響添加外源脂肪酸的作用效果，菌絲體脂肪酸組成和外源添加脂肪酸之間的相互作用還有待進(jìn)一步研究。

有機溶劑能有效提高細(xì)胞膜的相容性，改變細(xì)胞膜通透性，影響細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，是一種經(jīng)濟易得、可提高次級代謝產(chǎn)物和菌絲體生物量的有效添加劑[6，20]。本試驗研究4種常用有機溶劑甲醇、乙醇、正己烷和氯仿對繡球菌液體培養(yǎng)效果的影響發(fā)現(xiàn)：體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲醇對菌球直徑、菌球密度和菌絲體生物量的提高均有一定促進(jìn)作用，其中菌絲體生物量有顯著提高；氯仿雖能顯著增大菌球直徑，但菌球密度下降，整體生物量與對照差別不大。

表面活性劑廣泛應(yīng)用于菌類液體培養(yǎng)和生物降解，通過改變細(xì)胞膜疏水性或干擾細(xì)胞膜屏障，影響物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運過程[5]。本研究發(fā)現(xiàn)Tween 20和Tween 80對繡球菌菌絲生長有一定促進(jìn)作用，而CHAPS和Triton X-100嚴(yán)重抑制菌絲生長，這與虎奶菇和樺褐孔菌液體培養(yǎng)中添加CHAPS和Triton X-100會產(chǎn)生明顯抑制作用的結(jié)論相一致。但在樺褐孔菌多糖含量和抗氧化活性方面，Triton X-100則表現(xiàn)出較好的促進(jìn)作用[6，7，21]。本研究結(jié)果還顯示，當(dāng)Tween 80添加量為4 g/L時，菌絲體生物量達(dá)到較高水平（1.07 g/100mL），且在培養(yǎng)初期（3天）添加能獲得較好的促進(jìn)效果，這與灰樹花液體培養(yǎng)第3天添加體積分?jǐn)?shù)為0.5%的Tween 80時其生物量達(dá)到最大的結(jié)果相符[10]。在虎奶菇液體培養(yǎng)研究中添加3 g/L Tween 80對菌絲生長和多糖合成的促進(jìn)效果最佳，Tween 80濃度過高會產(chǎn)生較多氣泡，影響菌絲聚集和熱量傳導(dǎo)，不利于維持液體培養(yǎng)的無菌環(huán)境[6]。

植物油可作為液體培養(yǎng)的消泡劑，能夠減少菌絲體表面褶皺，延遲細(xì)胞老化[8]。本試驗結(jié)果顯示，添加0.5 g/L橄欖油和0.4 g/L花生油能顯著提高繡球菌液體培養(yǎng)的菌球直徑和菌絲體生物量，且花生油對菌絲體生物量積累的促進(jìn)效果更好。添加植物油對繡球菌菌絲的促生長作用明顯，這與灰樹花、樺褐孔菌液體培養(yǎng)研究結(jié)果一致[10，22]。研究還顯示，在牛樟芝液體培養(yǎng)初期添加大豆油能夠誘導(dǎo)多酚類物質(zhì)的產(chǎn)生和分泌[23]。

液體菌種具有菌齡一致、制備周期短的優(yōu)點，適合食用菌大規(guī)模工廠化栽培。目前繡球菌栽培采用瓶裝木屑菌種，制種周期長，使用液體菌種進(jìn)行生產(chǎn)能夠縮短制種和栽培周期。本研究選取了多種不同類別的外源添加物對繡球菌液體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，其中油酸、甲醇、橄欖油、花生油和Tween 80對菌絲體生物量積累的效果較好，后續(xù)可進(jìn)一步研究不同外源添加物的協(xié)同作用效果，為繡球菌液體菌種擴大培養(yǎng)提供參考。