陳家磊，熊 霞，劉思洋，朱師良，楊 禮，胡陳明，彭 涵*

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066）

車前草是我國一味傳統(tǒng)中草藥，具有利尿、消炎、清熱解毒的功效。Dong等[1]研究發(fā)現(xiàn)，車前草的提取物可上調(diào)抗氧化相關(guān)基因改善過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降，具有抗氧化作用。車前草多糖（PLP）為車前草中經(jīng)過一定方法提取純化得到的可溶性多糖。PLP具有清除體內(nèi)自由基以及增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬、分泌等功能[2-4]，可調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞自噬等多種生物學(xué)活性[5]；車前草粗多糖可部分逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用[6]。Yang等[7]報(bào)道，車前草籽提取物可顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂代謝。Li等[8]采用車前籽多糖灌胃小鼠后注射LPS造成肝臟炎癥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，車前籽多糖可抑制一氧化氮，誘導(dǎo)一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2的表達(dá)，并增加小鼠肝臟金屬硫蛋白的生成，保護(hù)炎癥性肝損傷。目前，對車前草多糖的研究多集中于其體內(nèi)調(diào)控機(jī)制和細(xì)胞水平，在畜禽生產(chǎn)上的應(yīng)用研究較少。本試驗(yàn)以PLP為研究對象，旨在探討PLP對肉雞免疫功能的影響，為其在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用1日齡健康大恒優(yōu)質(zhì)肉仔雞公雞400只，個(gè)體體重差異不超過5 g，隨機(jī)分為4組，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。試驗(yàn)期為4 w。

對照組（A組）肉仔雞飼喂基礎(chǔ)日糧，B組、C組和D組分別在基礎(chǔ)日糧中添加2、4和6 g/kg的車前草多糖。7日齡和9日齡時(shí)，各組分別免疫新城疫和禽流感疫苗，分組及免疫程序見表1?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗(yàn)分組及新城疫和禽流感疫苗免疫程序Tab.1 Grouping and immunization procedures for Newcastle disease and avian influenza vaccines

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.2 Composition and nutrition level of basal diet

1.2 試驗(yàn)材料

車前草多糖（批號：SN191230，斯諾特生物技術(shù)有限公司）。雞新城疫、禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原（批號分別為20201229、2019009，均購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司）；禽流感病毒滅活疫苗、雞新城疫疫苗（批號分別為210545400、200920712，均購自青島易邦生物工程有限公司）。

1.3 試劑與設(shè)備

主要試劑：雞γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒、雞腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒和雞白細(xì)胞介素2（IL-2）ELISA試劑盒（批號均為20218030，購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）。

蘇木素染液、伊紅染液（批號分別為CR2102133、CR2101094，均購自武漢塞維爾生物科技有限公司）。

主要儀器：轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（徠卡-2016）、JT-12S自動(dòng)組織脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）、RS36型全自動(dòng)染色機(jī)（常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司）、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）、數(shù)字切片掃描儀[Pannoramic 250，3DHISTECH（Hungary）]等。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 免疫器官指數(shù)

從1周齡開始，每周測量各組試驗(yàn)雞體重、法氏囊重、胸腺重和脾臟重，每組測量5只，連續(xù)測量至4周齡，計(jì)算免疫器官指數(shù)。

1.4.2 新城疫疫苗和禽流感疫苗抗體效價(jià)

3周齡末和4周齡末采集各組試驗(yàn)雞外周血5份，分離血清，-20℃保存。新城疫和禽流感疫苗抗體效價(jià)采用血凝（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）測定。

1.4.3 雞血清中γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素2（IL-2）濃度

在第4周齡末，每組采集外周血5份，分離血清。采用ELISA試劑盒檢測血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2的濃度，具體操作方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLP對肉雞免疫器官指數(shù)的影響（見表3～表5、圖1～圖3）

由表3可知，與對照組（A組）相比，在3周齡時(shí)，添加6 g/kg PLP的D組肉雞法氏囊指數(shù)極顯著提高（P＜0.01）；4周齡時(shí)，添加4 g/kg PLP的C組肉雞法氏囊指數(shù)顯著提高（P＜0.05），添加6 g/kg PLP的D組肉雞法氏囊指數(shù)極顯著提高（P＜0.01）。

表3 PLP對肉雞法氏囊指數(shù)的影響Tab.3 Effect of PLP on bursa of fabricius of broilers

由表4可知，與對照組（A組）相比，2周齡時(shí)，添加2、4 g/kg PLP的B、C組脾臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），其余周齡各組脾臟指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

表4 PLP對肉雞脾臟指數(shù)的影響Tab.4 Effect of PLP on spleen index of broilers

由表5可知，日糧添加PLP對肉雞胸腺指數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。

表5 PLP對肉雞胸腺指數(shù)的影響Tab.5 Effect of PLP on thymus index of broilers

由圖1～圖3可知，各組法氏囊組織黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜層形成大的皺襞突入腔內(nèi)，被覆假復(fù)層柱狀上皮細(xì)胞，固有層內(nèi)髓質(zhì)和皮質(zhì)間較多的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，未見細(xì)胞數(shù)量明顯減少或增加，黏膜下層、肌層和外膜未見明顯炎性細(xì)胞浸潤和增生；胸腺組織被膜結(jié)締組織完整，皮質(zhì)與髓質(zhì)區(qū)分界較清晰；胸腺無明顯萎縮，小葉結(jié)構(gòu)正常；脾臟組織被膜完整，被膜及脾小梁纖維結(jié)締組織未見增生，白髓與紅髓分界清晰，白髓脾小結(jié)無反應(yīng)性增生，亦無萎縮。表明連續(xù)飼喂車前草多糖對雞免疫器官無組織損傷，無毒性反應(yīng)。

2.2 PLP對肉雞新城疫疫苗和禽流感疫苗抗體效價(jià)的影響（見表6）

由表6可知，3周齡時(shí)，各組間新城疫抗體效價(jià)差異不顯著（P＞0.05）；4周齡時(shí)，B組新城疫抗體效價(jià)極顯著高于其他3組（P＜0.01），A組、C組、D組間新城疫抗體效價(jià)差異不顯著（P＞0.05）。

表6 PLP對肉雞新城疫疫苗和禽流感疫苗抗體效價(jià)的影響Tab.6 Effect of PLP on Newcastle disease vaccine and H5N1 serotype vaccine of broilers

3周齡時(shí)，各組禽流感H5N1疫苗抗體效價(jià)差異不顯著（P＞0.05）；4周齡時(shí)，B組禽流感H5N1疫苗抗體效價(jià)極顯著高于A組（P＜0.01），C組禽流感H5N1疫苗抗體效價(jià)顯著高于A組（P＜0.05）。

2.3 PLP對肉雞血清細(xì)胞因子濃度的影響（見表7）

由表7可知，在4周齡時(shí)，與對照組（A組）相比，C組和D組肉雞血清IFN-γ含量極顯著提高（P＜0.01）。B組肉雞血清IL-2含量顯著高于A組（P＜0.05），C組、D組肉雞血清IL-2含量均極顯著高于A組（P＜0.01）；且D組血清IL-2含量顯著高于B組、C組（P＜0.05）。

表7 PLP對肉雞血清細(xì)胞因子濃度的影響Tab.7 Effect of PLP on cytokine content of broilers 單位：ng/L

3 討論

胸腺、法氏囊為雞的中樞免疫器官，脾臟為雞的外周免疫器官，三者的發(fā)育情況是雞免疫功能強(qiáng)弱的直接體現(xiàn)，而免疫器官指數(shù)則是反映其發(fā)育的一項(xiàng)重要指標(biāo)。研究表明，在日糧中添加中藥多糖可提高肉雞生長性能和免疫功能，如枸杞多糖、大蒜多糖、刺五加多糖等[9-11]。本研究中，免疫組織病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，PLP對肉雞免疫器官無明顯損傷作用；4 g/kg和6 g/kg的PLP可顯著促進(jìn)法氏囊發(fā)育，而PLP對胸腺和脾臟的發(fā)育無顯著促進(jìn)作用，可能與PLP的給藥劑量、給藥時(shí)間和給藥方式有關(guān)。

機(jī)體免疫功能包括固有免疫和獲得性免疫，而體液免疫又是獲得性免疫的重要表現(xiàn)。疫苗的抗體效價(jià)是該疫苗免疫效果的直接體現(xiàn)，抗體效價(jià)越高，動(dòng)物群體抗感染能力和抗病能力越強(qiáng)，對該群體的保護(hù)力越高。有研究報(bào)道，多種多糖對疫苗抗體效價(jià)具有提高作用，如巴楚蘑菇多糖、參芪多糖、甘草多糖等可提高雛雞新城疫抗體水平[12-14]，黃芪提取物可使免疫抑制雞的新城疫和禽流感疫苗抗體效價(jià)升高[15]。PLP作為佐劑同新城疫疫苗共同免疫時(shí)，可提高雛雞新城疫疫苗抗體效價(jià)[16]。

本試驗(yàn)中選用的疫苗均為滅活油乳劑疫苗，進(jìn)行一次免疫效果較差，油乳劑緩慢釋放可持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加2 g/kg的PLP可顯著提高新城疫抗體水平，添加2 g/kg和4 g/kg的PLP可顯著提高禽流感H5N1抗體水平，可能與車前草多糖在機(jī)體內(nèi)激活的信號通路和作用靶標(biāo)有關(guān)。

細(xì)胞因子的分泌功能是細(xì)胞免疫的重要體現(xiàn)之一，細(xì)胞因子具有多種生物學(xué)功能，其在參與細(xì)胞的生長分化，促炎和抗炎以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中扮演重要角色。INF-γ可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化；IL-2能活化T細(xì)胞使其產(chǎn)生細(xì)胞因子，還能夠刺激自然殺傷性T細(xì)胞（NK細(xì)胞）增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性及產(chǎn)生細(xì)胞因子，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體分泌等功能。

張英楠等[17]研究發(fā)現(xiàn)，刺五加多糖對環(huán)磷酰胺致免疫抑制雛雞血液中的IFN-γ、IL-2和TNF-α等8種細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄具有提高作用。陳俊良等[18]報(bào)道，日糧中添加白術(shù)多糖可促進(jìn)海南黃雞細(xì)胞因子分泌。張恒瑞等[19]研究發(fā)現(xiàn)，大棗多糖可顯著提高黃羽肉雞血清中IFN-γ、IL-2和IL-10含量。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 g/kg和6 g/kg的PLP可顯著提高肉雞血清中INF-γ和IL-2含量，且其分泌量隨車前草多糖劑量升高而升高。試驗(yàn)結(jié)果提示，PLP可促進(jìn)肉雞部分細(xì)胞因子分泌進(jìn)而提高細(xì)胞免疫和體液免疫。Jiang等[20]報(bào)道，車前籽多糖可通過激活TOLL4-MAPK-NF-κB途徑誘導(dǎo)樹突細(xì)胞成熟，可能是車前草多糖促進(jìn)肉雞血清細(xì)胞因子分泌的原因，但其具體作用機(jī)制仍待研究。

4 結(jié)論

日糧中添加車前草多糖可以促進(jìn)肉雞法氏囊的早期發(fā)育，提高新城疫和禽流感H5N1疫苗抗體水平，提升肉雞血清部分細(xì)胞因子濃度，增強(qiáng)肉雞免疫功能。