王新光 田磊 王恩澤 鐘成 田春杰

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，長春 130102）

我國是世界農(nóng)業(yè)大國，以秸稈為代表的農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)量十分豐富，尤其是玉米秸稈。據(jù)統(tǒng)計，2014-2018年我國秸稈年均產(chǎn)量約為65 386.6萬t，其中玉米秸稈占總秸稈產(chǎn)量的45%左右［1］。玉米秸稈中含有多種營養(yǎng)元素，包括C、N、P、K和微量元素等，是重要的生物質(zhì)資源［2］，如果加以合理高效利用，則會避免出現(xiàn)焚燒而導(dǎo)致的環(huán)境污染問題。早在2017年，黨的十九大報告提出了鄉(xiāng)村建設(shè)的發(fā)展方向，其中最關(guān)鍵的就是農(nóng)業(yè)廢棄物的無害化、資源化利用［3］。因此，研究如何高效利用玉米秸稈是十分必要的。

玉米秸稈是典型的纖維素類物質(zhì)，目前采用物理和化學(xué)的方法處理纖維素類物質(zhì)存在成本高和污染環(huán)境等問題，而生物降解法相對于其它處理手段具有成本低、無污染等優(yōu)點，是降解纖維素物質(zhì)的重要手段［4-5］。近年來，利用微生物降解秸稈成為國內(nèi)外研究的熱點，主要關(guān)注玉米秸稈和水稻秸稈的降解。蘇玉春等［6］從長白山腐殖土樣品中篩選出一株毛頭鬼傘菌（Coprinus comatus），其纖維素酶活為3.57 U/mL，28℃條件下發(fā)酵玉米秸稈，15 d后玉米秸稈失重率達(dá)到23.65%，其中纖維素降解率為17.06%。真菌降解纖維素能力強，但相對于細(xì)菌來說生長緩慢，纖維素酶耐熱性和耐堿性差，實際應(yīng)用中限制因素多［7-8］。Olowomofe等［9］從土壤中分離出一株密歇根克雷伯氏菌（Klebsiella michiganensis），通過條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)其在pH 7條件下培養(yǎng)后，纖維素酶活可達(dá)35.6 U/mL。以往的研究大多是利用分離得到的單菌降解秸稈，獲得的單菌酶活較低，產(chǎn)生的酶系較單一，導(dǎo)致秸稈不能被高效降解［10］。

復(fù)合菌系處理秸稈被認(rèn)為是一種穩(wěn)定高效的降解手段，它主要是依靠不同菌株之間的協(xié)同作用來發(fā)揮更強的秸稈降解能力［11-12］。Sui等［13］將纖維素降解菌N05、N13和N21組合成復(fù)合菌群，在30℃的條件下培養(yǎng)5 d后酶活達(dá)到最大值為6.07 U/mL，與單菌相比酶活提高了2倍。崔鴻亮等［14］將蠟狀芽孢桿菌（Baccillus cereus）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）組合構(gòu)建成復(fù)合菌群，在30℃條件下培養(yǎng)8 d后水稻秸稈的降解率達(dá)到73.3%，比蠟狀芽孢桿菌單菌的降解能力提高了22.4%。顯然，復(fù)合菌系纖維素酶活及對秸稈的降解能力均優(yōu)于單菌，構(gòu)建高效復(fù)合菌系對提高秸稈的降解率具有積極作用。

目前復(fù)合菌劑因其高效的降解能力備受關(guān)注，但對于細(xì)菌組合構(gòu)建的復(fù)合菌系的研究報道比較少［15-17］。尤其對于細(xì)菌和放線菌組合構(gòu)建的復(fù)合菌系發(fā)酵體系優(yōu)化研究相對不足。鏈霉菌作為一種最高等的放線菌，常被用于制備抗生素，但鏈霉菌也具有較強的降解秸稈的能力。有研究報道，通過高通量測序的方法對降解秸稈細(xì)菌群落中主要降解菌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌是降解秸稈的主要降解菌［18］。因此，本研究將芽孢桿菌屬與鏈霉菌屬組合構(gòu)建玉米秸稈高效降解復(fù)合菌系，為秸稈資源化利用提供菌種資源，并對其進(jìn)行發(fā)酵條件及培養(yǎng)基的優(yōu)化，對高效發(fā)揮微生物功能及玉米秸稈降解復(fù)合菌劑的開發(fā)制備具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米秸稈及降解菌株 玉米秸稈來自中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所玉米試驗田，切割粉碎至2-5 cm的小段；秸稈降解菌株為：枯草芽孢桿菌WF-8（Bacillus subtilis WF-8）、地衣芽孢桿菌 WF-11（B.lincheniformis WF-11）、蠟 狀 芽 孢 桿菌WS-1（B.cereus WS-1）、和黑胡桃鏈霉菌WF-10（Streptomyces nogalater WF-10）由中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所土壤與微生物養(yǎng)分循環(huán)學(xué)科組提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB（Luria-bertani）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)節(jié)至7.0。

ISP2（International Streptoyces Project 2） 液 體培養(yǎng)基：酵母粉4 g，麥芽浸出物10 g，碳酸鈣2 g，葡萄糖4 g，蒸餾水1 000 mL。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基/發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米秸稈粉 15 g，NaCl 0.1 g，KH2PO41.0 g，NaNO32.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.1 g，F(xiàn)eCl30.01 g，蒸餾水1 000 mL。

無 機 鹽 培 養(yǎng) 基：KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，CaCl20.1 g，F(xiàn)eCl30.01 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 單菌纖維素酶活的測定 將4株活化后的菌株分別接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于28℃ 200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取一次樣，8 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液。

CMCase酶活（羧甲基纖維素酶活性）和FPA酶活（濾紙酶活性）采用DNS法［19］測定。

酶活力定義：在50℃的反應(yīng)條件下，1 mL粗酶液1 min內(nèi)反應(yīng)生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1 U/mL。

1.2.2 復(fù)合菌系的構(gòu)建及確定最佳組合 將4種單菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基和ISP2液體培養(yǎng)基，28℃ 200 r/min條件下恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24 h，4株菌通過等比例組合進(jìn)行復(fù)配試驗，并將復(fù)合菌OD600調(diào)至約108CFU/mL。構(gòu)建的復(fù)合菌系如表1所示。

表1 不同菌種組合的復(fù)合菌系Table 1 Microbial consortiums formed by the combination of different strains

將4組復(fù)合菌系以4%比例分別接種至發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于28℃ 200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取一次樣，8 000 r/min條件下離心5 min，然后取上清測定CMCase酶活和FPA酶活（方法同1.2.1）。

1.2.3 單因素及正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基 在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以CMCase酶活為優(yōu)化指標(biāo)，對不同碳源（CMC-Na、秸稈粉、微晶纖維素、蔗糖、淀粉）、碳源添加量（5、7.5、10、12.5、15 g/L）、氮源（蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉、尿素）和氮源添加量（1、2、3、4、5 g/L）進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗。將復(fù)合菌系按4%的接種量接入不同因素水平下的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，28℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，實驗設(shè)置3個重復(fù)。以單因素試驗優(yōu)化結(jié)果設(shè)置4因素4水平的正交試驗L16（45）（表2），以CMCase酶活為優(yōu)化指標(biāo)，最終確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

表2 碳氮源正交試驗表Table 2 Orthogonal test table for carbon and nitrogen sources

1.2.4 單因素及響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件 以CMCase酶活為優(yōu)化指標(biāo)，對不同培養(yǎng)時間（1、2、3、4、5、6、7、8 d）、培養(yǎng)溫度（25、30、35、4℃、45℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）和初始pH（4、5、6、7、8、9、10）進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化試驗。實驗設(shè)置3個重復(fù)。

以單因素試驗優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件為中心點，利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Benhnken模型，以CMCase酶活為響應(yīng)值，對發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量及初始pH四個影響因素進(jìn)一步優(yōu)化，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗（表3）。

表3 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 3 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 復(fù)合降解菌系發(fā)酵試驗及秸稈降解效果評價 為了驗證構(gòu)建的復(fù)合菌系的高效性和實際應(yīng)用性，對構(gòu)建的復(fù)合菌系進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵試驗［20］。

液態(tài)發(fā)酵試驗：取5 mL復(fù)合菌液接種到優(yōu)化后的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不接菌液的培養(yǎng)基作為對照，在最優(yōu)發(fā)酵條件下培養(yǎng)10 d后，離心棄上清，加稀酸溶液反復(fù)沖洗秸稈，然后再用蒸餾水沖洗，離心后采用失重法測定秸稈的相對降解率。

固態(tài)發(fā)酵試驗：按照1.2.2中最佳復(fù)合菌系組合進(jìn)行單菌復(fù)配，取5 mL混菌接入優(yōu)化后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不接菌液的培養(yǎng)基作為對照，在35℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，每3 d搖勻一次。30 d后將秸稈取出，加稀酸溶液反復(fù)沖洗秸稈，然后再用蒸餾水沖洗，離心后采用失重法測定秸稈的相對降解率。

1.2.6 實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Origin 2019b繪圖軟件進(jìn)行繪圖，利用SPSS26進(jìn)行正交試驗數(shù)據(jù)分析，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)分析，每組試驗均做3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合菌系的構(gòu)建篩選

將構(gòu)建的復(fù)合菌系以及單菌接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)，每24 h測定一次酶活。以纖維素酶活為指標(biāo)，通過測定比較單菌與復(fù)合菌系的CMCase酶活和FPA酶活來篩選構(gòu)建高效復(fù)合菌系。結(jié)果如圖1和圖2所示，單菌以及復(fù)合菌系的纖維素酶活基本上都是呈先升高后降低的趨勢，4株單菌中WF11表現(xiàn)出較高的纖維素酶活，在第6 天達(dá)到最大，高于其它單菌；4組復(fù)合菌系都在第6天的時候酶活均達(dá)到最大，其中復(fù)合菌系HD產(chǎn)酶活性最高，CMCase酶活達(dá)到86.53 U/mL，F(xiàn)PA酶活達(dá)到22.03 U/mL，均顯著高于單菌酶活。

圖1 單菌和復(fù)合菌系的CMCase酶活Fig.1 CMCase activity of a single bacterial strain and microbial consortiums

圖2 單菌和復(fù)合菌系的濾紙酶活Fig.2 FPA enzyme activity of a single bacterial strain and microbial consortiums

2.2 單因素試驗篩選碳、氮源種類及其添加量

以CMCase酶活值為評價指標(biāo)，通過混菌發(fā)酵對不同碳源、氮源及其添加量進(jìn)行單因素實驗優(yōu)化，結(jié)果如表4和表5所示。復(fù)合菌系HD酶活隨碳源種類及添加量的不同變化較大，以秸稈粉為碳源時，酶活較高，添加量為15 g/L時酶活最高；以蔗糖為碳源時，酶活較低，添加量為5 g/L時酶活最低。氮源種類及其添加量對酶活影響較大，硫酸銨更有利于復(fù)合菌系發(fā)酵產(chǎn)酶，添加量為4 g/L時酶活最高；以尿素為氮源時最不利于復(fù)合菌系發(fā)酵產(chǎn)酶，添加量為5 g/L時酶活最低。

表4 不同碳源及其添加量對復(fù)合菌系HD纖維素酶活的影響Table 4 Effects of different carbon sources and contents on the cellulose produced by microbial consortium HD

表5 不同氮源及其添加量對復(fù)合菌系HD纖維素酶活的影響Table 5 Effects of different nitrogen sources and contents on the cellulose produced by microbial consortium HD

2.3 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基成分

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，綜合考慮后去掉蔗糖、尿素、碳源添加量7.5 g/L和氮源添加量2 g/L，對碳源、氮源、碳源添加量和氮源添加量設(shè)計4因素4水平的正交試驗，優(yōu)化結(jié)果及方差分析結(jié)果如表6和表7所示。4個因素對復(fù)合菌系發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響從高到低為A-碳源＞D-氮源添加量＞B-氮源＞C-碳源添加量，最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A4B3C4D3。綜上所述，復(fù)合菌系HD的最優(yōu)培養(yǎng)基為：秸稈粉15 g，（NH4）2SO44 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.1 g，F(xiàn)eCl30.01 g， 蒸餾水1000 mL。進(jìn)一步對最優(yōu)培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示復(fù)合菌系在最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中發(fā)酵5 d后的纖維素酶活為98.63 U/mL，比未優(yōu)化的培養(yǎng)基提高了1.46倍。

表6 正交試驗結(jié)果Table 6 Results of orthogonal experiment

表7 單因素方差分析結(jié)果Table 7 One-way ANOVA results

2.4 單因素試驗考察發(fā)酵條件對復(fù)合菌系產(chǎn)纖維素酶活性的影響

通過單因素試驗考察溫度、接種量、時間和初始pH對復(fù)合菌系HD產(chǎn)纖維素酶活性的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3-a可以看出，發(fā)酵溫度為35℃時復(fù)合菌系產(chǎn)生的CMCase酶活及FPA酶活性最高，分別達(dá)到146.38 U/mL和28.70 U/mL，45℃時所產(chǎn)生的FPA酶活性高于25℃，表現(xiàn)出一定的耐熱性。在最適溫度范圍內(nèi)微生物酶促反應(yīng)速度最大，酶活性最高，高于或低于最適溫度均會抑制微生物代謝活動［21］。

由圖3-b可以看出，F(xiàn)PA酶活隨接種量的增大呈先升高后降低的趨勢，CMCase酶活隨接種量的增大出現(xiàn)兩個峰值，當(dāng)接種量為5%時，F(xiàn)PA酶活與CMCase酶活均達(dá)到最大值，分別為16.36 U/mL和155.23 U/mL。

由圖3-c可以看出，發(fā)酵6 d后纖維素酶活達(dá)到最大值，F(xiàn)PA酶活和CMCase酶活分別為16.97 U/mL和53.29 U/mL，纖維素酶活隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長呈下降趨勢。

由圖3-d可以看出，pH為7時，F(xiàn)PA酶活和CMCase酶活達(dá)到最大值，分別為22.65 U/mL和111.82 U/mL，纖維素酶活隨著pH的增大逐漸降低。pH值的改變會影響酶活性中心的某些基團(tuán)的解離程度，并且還會影響底物的解離程度，從而影響纖維素酶與底物的結(jié)合［22］。

圖3 環(huán)境因素對復(fù)合菌系D產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.3 Effects of environmental factors on the cellulose production of microbial consortium D

2.5 響應(yīng)面試驗優(yōu)化復(fù)合菌系發(fā)酵條件

2.5.1 響應(yīng)面模型的構(gòu)建及方差分析 根據(jù)表3設(shè)計的因素和水平編碼表，以溫度（A）、接種量（B）、時間（C）和初始pH（D）為自變量，以CMCase酶活為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0軟件中的Box-Benhnken中心組合設(shè)計29組實驗，將實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合后得到的二次回歸方程預(yù)測模型如下：

對所得到的回歸方程預(yù)測模型進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗，如表8所示，可以看出模型F=14.64，P＜0.000 1，回歸模型達(dá)到極顯著，并且模型的失擬項P=0.785 9＞0.05，表現(xiàn)為不顯著，模型的決定系數(shù)R2=95.14%，說明此模型擬合度高，能夠很好的分析預(yù)測復(fù)合菌系發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)發(fā)酵條件。另外，根據(jù)表9中各因素的F值和P值的大小可以得出它們對復(fù)合菌系產(chǎn)纖維素酶活性的影響順序為：溫度（A）＞時間（C）＞pH（D）＞接種量（B）。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of the regression equations

2.5.2 變量交互作用的顯著程度 響應(yīng)面曲線圖可以直觀地反映出任意兩個變量的交互作用對響應(yīng)值的影響，根據(jù)表8繪制響應(yīng)面曲線圖（圖4），以進(jìn)一步分析篩選復(fù)合菌系最優(yōu)發(fā)酵條件。由圖4-a-c可知，當(dāng)溫度保持不變時，CMCase酶活值隨著時間的增加而增加，隨著接種比例和pH的增加均表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，而其它因素保持不變時，隨著溫度的升高，纖維素酶活先增加后降低。結(jié)合曲面的傾斜程度以及方差分析結(jié)果可以看出，溫度與時間之間的交互作用對酶活的影響顯著，而溫度與接種比例、溫度與pH之間的交互作用對酶活的影響不顯著。

表8 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 8 Results of response surface experiments

同理，由圖4-d-f可知，CMCase酶活值隨著接種比例的增加呈先增加后小幅度降低的趨勢，隨時間的增加而增加。當(dāng)pH保持不變時，酶活隨接種比例的增加先增加后降低，隨時間的增加呈小幅度的增加后緩慢降低，當(dāng)接種比例與時間保持不變時，酶活隨pH的增加均表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。相對于圖4-e和圖4-f，圖4-d傾斜度較高，同時結(jié)合方差分析結(jié)果可以看出，接種比例與時間之間的交互作用對酶活的影響顯著，而pH與接種比例、時間與pH之間的交互作用對酶活的影響不顯著。

圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of the interactions among various factors

2.6 復(fù)合菌系最佳發(fā)酵條件的確定及模型驗證試驗

由各因素交互作用的響應(yīng)面曲線圖可以看出此響應(yīng)面存在最大值，通過Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行分析，得到復(fù)合菌系HD最優(yōu)發(fā)酵條件為：溫度33.98℃、接種量4.93%、時間6.37 d和pH 7.17，在此條件下培養(yǎng)復(fù)合菌系，可以得到最大纖維素酶活的預(yù)測值為167.31 U/mL?？紤]到實際操作的條件，將最優(yōu)發(fā)酵條件調(diào)整為：溫度34℃、接種量5%、時間6 d和pH7.2。在此條件下進(jìn)行驗證實驗，測得纖維素酶活實際值為164.21 U/mL，與優(yōu)化前（圖1）相比，提高到原來的1.90倍。實際值和預(yù)測值相差很小，說明該模型擬合度高，并且準(zhǔn)確可靠。

2.7 復(fù)合菌系降解玉米秸稈的效果評價

為了明確構(gòu)建的復(fù)合菌系HD對玉米秸稈降解的有效性，進(jìn)行了為期7 d的液態(tài)發(fā)酵實驗，并且考慮到實際應(yīng)用，同時也進(jìn)行為期15 d的固態(tài)發(fā)酵實驗，采用失重法考察復(fù)合菌劑HD對玉米秸稈的降解效率，結(jié)果如圖5所示。復(fù)合菌劑HD處理過的秸稈降解率顯著高于單菌處理過的秸稈。液態(tài)發(fā)酵實驗中，混菌HD處理過的秸稈降解率為47%，相對于對照組提高了35%，相較于單菌W1、W8、W10和W11分別提高了21.67%、18.33%、7.33%和12.67%；固體發(fā)酵實驗中，混菌HD處理過的秸稈降解率為63.6%，相對于對照提高了56.6%，相較于單菌W1、W8、W10和W11分別提高了44.1%、35.5%、9.3%和6.6%。以上結(jié)果表明，復(fù)合菌劑HD對秸稈有明顯的降解效果。

圖5 玉米秸稈液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Results of liquid and solid fermentation of corn straw

3 討論

當(dāng)前，全球環(huán)境治理面臨挑戰(zhàn)，我國作為農(nóng)業(yè)大國，秸稈資源化利用勢在必行［23-24］。其中生物法處理秸稈是一項重要的舉措。由于單一菌株酶活性較弱、降解效率低等問題，高效降解纖維素復(fù)合菌系的構(gòu)建在秸稈資源化利用中就顯得尤為重要。

復(fù)合菌系的構(gòu)建是一個復(fù)雜的過程，培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵條件的優(yōu)化是構(gòu)建復(fù)合菌系發(fā)酵體系不可或缺的一部分［25-26］。目前微生物產(chǎn)酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化大多數(shù)采用單因素實驗結(jié)合正交試驗或響應(yīng)面實驗，可以快速準(zhǔn)確地得到優(yōu)化條件。馮紅梅等［27］從堆肥中篩選出6株纖維素降解菌，通過復(fù)配制成復(fù)合菌系M-1，發(fā)酵條件優(yōu)化后纖維素酶活最高可達(dá)135.9 U/mL，產(chǎn)酶能力提高了1.8倍。菌種來源的選擇對于復(fù)合菌系的構(gòu)建也是一個重要的條件。Li等［28］從腐爛的玉米秸稈中篩選出纖維素降解菌并構(gòu)建復(fù)合菌ADS3應(yīng)用于秸稈還田，7 d后纖維素酶活高達(dá)252.8 U/mL，對秸稈降解作用明顯。崔宗均等［29］從堆肥中篩選出4組混菌，經(jīng)過混合培養(yǎng)成1組高效纖維素降解菌群，培養(yǎng)1 d后纖維素酶活最大，達(dá)到122.3 U/mL，對纖維素類物質(zhì)具有較強的分解能力。本試驗將來源于長期秸稈還田的土壤及堆肥中的4株菌組合構(gòu)建出高效復(fù)合菌系HD，對其培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，纖維素酶活高達(dá)164.21 U/mL，顯著高于優(yōu)化前酶活，在以上研究中處于中等水平。顯然，培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件的優(yōu)化對于微生物酶活性的提高依舊是一種有效的手段。

溫度是影響微生物的重要因素［30-31］。Qing等［32］成功構(gòu)建了適應(yīng)低溫的玉米秸稈降解菌群GF-20，在10℃條件下發(fā)酵15 d后玉米秸稈降解率為32%。薩如拉等［33］構(gòu)建了1號和8號兩組復(fù)合菌系，在15℃條件下培養(yǎng)，15 d后玉米秸稈降解率分別達(dá)到30.21%和32.21%。而本研究構(gòu)建的復(fù)合菌系HD在35℃時酶活性最大，具有一定的耐高溫性能，可以用作秸稈堆肥微生物降解菌劑，提高其產(chǎn)品附加值。復(fù)合菌系HD在35℃的條件下，經(jīng)過液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵后，對玉米秸稈的降解率分別為47%和63.6%，相對于上述研究，降解效果較好。在發(fā)酵過程中，纖維素酶不僅是產(chǎn)物，也是纖維素水解的催化劑，除了溫度外，溶氧量和pH對于微生物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶也極為重要。溶氧量的大小取決于接種量的多少，接種量過大時，微生物生長過快，發(fā)酵體系溶氧不足，導(dǎo)致微生物活性和產(chǎn)酶速度降低；接種量過少，微生物生長緩慢，產(chǎn)酶速度同樣會下降［34］。本實驗中復(fù)合菌系在5%接種量的條件下酶活最高，顯著高于1%接種量和6%接種量條件下的酶活。pH是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶過程中一個重要的控制因素，很早就有學(xué)者通過優(yōu)化pH來提高纖維素酶活［35-36］。有研究表明，pH的大小會影響纖維素酶活性部位上相關(guān)基團(tuán)的解離，在最適pH的條件下，活性部位上的解離程度最適合酶與底物結(jié)合發(fā)揮作用，高于會低于最適pH都會降低纖維素酶的分解能力［37］。另外，耿冰等［38］通過研究pH對綠色木霉（Trichoderma viride）發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活的影響發(fā)現(xiàn)，纖維素酶活發(fā)生變化的一個重要原因就是pH改變了纖維素酶的構(gòu)象。本研究中復(fù)合菌系HD最適pH值為7，當(dāng)pH增大或減小時，纖維素酶活明顯降低。并且在不同營養(yǎng)成分條件下纖維素酶最適pH也不同。楊振德等［39］對蒼白桿菌屬進(jìn)行初始pH條件優(yōu)化，以酵母膏為氮源，pH為6時纖維素酶活性最高，而以酒石酸銨為氮源，pH為7時纖維素酶活最高。由此可見，優(yōu)化發(fā)酵條件前先優(yōu)化培養(yǎng)基成分是提高纖維素酶活的一種比較合適的方式。

綜上所述，復(fù)合菌系HD具有較強的玉米秸稈降解能力，這對高效降解秸稈復(fù)合菌劑的研制開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義，但在構(gòu)建的過程中尚未探究微生物之間的協(xié)同機制，下一步將對4株菌之間的相互作用機制進(jìn)行研究，研制和開發(fā)高效玉米秸稈降解復(fù)合菌劑，并加以推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

通過對4株玉米秸稈降解菌之間相互組合構(gòu)建了不同復(fù)合菌系，以纖維素酶活指標(biāo)，確定了最佳復(fù)合菌系HD。優(yōu)化后的復(fù)合菌系產(chǎn)纖維素酶活為164.21 U/mL，是優(yōu)化前的1.9倍。復(fù)合菌系HD處理過的玉米秸稈降解率分別達(dá)到了47%和63.6%，顯著高于對照組和單菌。研究結(jié)果表明復(fù)合菌系HD具有較強的產(chǎn)纖維素酶和降解秸稈能力。