吳壽遠(yuǎn), 周戚, 陳子明*, 黃國(guó)玲

(1. 嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 湛江 524000; 2. 臺(tái)州學(xué)院高等研究院，天然藥物與健康產(chǎn)品研究所，浙江 臺(tái)州 318000)

毛山小橘(Glycosmis craibii)是蕓香科(Rutaceae)山小橘屬植物，常見(jiàn)于云南南部(元江等地)，在泰國(guó)東北部也有分布[1]。本屬藥用植物在民間用于治療多種疾病，如印度民間G. arborea用作降體溫、肝部不適及其他疾病[2]，G. citrifolia用作治療皮膚瘙癢、疥瘡和皮膚潰瘍[2]。山小橘(G. pentaphylla)醇提取物展示出顯著的殺蚊蟲(chóng)和護(hù)肝作用[3], 但是關(guān)于毛山小橘植物化學(xué)成分研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組一直從事熱帶藥用植物活性成分研究[4],前期從毛山小橘中分離得到一個(gè)抗腫瘤活性顯著的新穎吲哚生物堿和四個(gè)具有抗炎活性的肟類(lèi)化合物[5-6]。為了進(jìn)一步從該植物中尋找活性成分, 闡明其藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組對(duì)毛山小橘枝葉的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究。本文報(bào)道從毛山小橘枝葉95%乙醇提取物中分離得到的9 個(gè)生物堿類(lèi)化合物。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

瑞士布魯克公司生產(chǎn)的Bruker AV-400 MHz 超導(dǎo)核磁共振儀；德國(guó)Finnigan 公司生產(chǎn)的Finnigan-MAT-95-MS 質(zhì)譜儀；日本東京理化公司生產(chǎn)的N-1100D-W 直立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的YOKO-ZX 紫外分析暗箱；上海青浦滬西儀器有限公司生產(chǎn)的BSZ-100自動(dòng)部分收集器；美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)Agilent 1260 分析型高效液相色譜儀、Agilent 1260 制備型高效液相色譜儀；美國(guó)Amersham Biosciences 公司生產(chǎn)Sephadex LH-20 凝膠；美國(guó)Merck 公司生產(chǎn)的ODS 柱色譜材料(C18, 10~40μm); 青島海洋化工廠生產(chǎn)的柱層析硅膠(200~300 和300~400 目)，所用試劑均為分析純，購(gòu)買(mǎi)于西隴化工股份有限公司。

試驗(yàn)材料于2018 年8 月采自中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，由浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究院王軍峰副研究員鑒定為蕓香科山小橘屬植物毛山小橘(Glycosmis craibii)的干燥枝葉，憑證標(biāo)本(No.W180801)保存于臺(tái)州學(xué)院高等研究院天然藥物與健康產(chǎn)品研究所標(biāo)本室。

1.2 提取和分離

取10.0 kg 毛山小橘新鮮枝葉晾干，粉碎成粗粉, 用95%乙醇浸泡3 次，溶劑體積依次為20.0、15.0 和15.0 L，每次浸泡1 周，合并浸泡液，減壓濃縮至無(wú)醇味得總浸膏。將總浸膏分散于溫水混懸后依次分別用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，減壓回收溶劑后得石油醚萃取部位(69.0 g)和乙酸乙酯萃取部位(90.0 g)。將石油醚部位經(jīng)硅膠柱色譜分離,以石油醚-丙酮為洗脫劑[80∶20→50∶50,V/V]梯度洗脫，收集洗脫流份，每份1 L，減壓濃縮至干,TLC 檢測(cè)合并主點(diǎn)相同的流份，得組分Fr.1~Fr.5。組分Fr.3 (10.3 g)經(jīng)ODS 柱色譜進(jìn)行分離，以甲醇-水為洗脫劑[20∶80→100∶0,V/V]進(jìn)行梯度洗脫,得到8 個(gè)亞組分Fr.3A~Fr.3H。Fr.3B 經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜(氯仿-甲醇, 1∶1)分離，經(jīng)制備型HPLC 純化, 以乙腈-水(55∶45)為流動(dòng)相，流速20 mL/min，制得化合物4 (tR=14.8 min, 2.8 mg)、6 (tR=22.3 min,17.4 mg)、7 (tR=25.6 min, 13.8 mg)和8 (8.8 mg)。Fr.3D 經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮為洗脫劑[25∶75→50∶50,V/V]進(jìn)行梯度洗脫，洗脫組分經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜(石油醚-氯仿-甲醇，40∶20∶20)分離純化, 經(jīng)制備HPLC 純化，以乙腈-水(45∶55)為流動(dòng)相，流速20 mL/min，制備獲得化合物1 (tR=11.2 min, 55.7 mg)和3 (tR=13.2 min, 89.7 mg)。Fr.3F經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(20∶80→0∶100,V/V)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫組分經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜(氯仿-甲醇, 50∶50)純化, 以甲醇-水(80∶20)為流動(dòng)相，經(jīng)制備型HPLC 進(jìn)行制備得到化合物2 (tR=21.3 min, 19.0 mg)、5 (tR=16.5 min, 32.4 mg)和9 (tR=23.5 min, 4.8 mg)(圖1)。

圖1 化合物1~9 結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of compounds 1-9

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色油狀物，與改良的碘化鉍鉀反應(yīng)顯色呈陽(yáng)性，ESI-MSm/z: 316.1 [M + Na]+, 分子式為C18H15NO3,1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH14.68 (1H, s, OH-1), 11.16 (1H, s, NH-10), 8.15(1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-8), 7.79 (1H, td,J= 8.0,1.6 Hz, H-6), 7.74 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-5), 7.28(1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz, H-7), 7.10 (1H, d,J= 10.4 Hz,H-1?), 6.04 (1H, s, H-2), 5.72 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-2′),1.43 (3H, s, 4′-CH3), 1.43 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δC180.6 (C-9), 163.8 (C-3),159.2 (C-1), 141.0 (C-10a), 137.9 (C-4a), 133.9 (C-6),125.6 (C-8), 124.9 (C-2′), 121.8 (C-7), 118.9 (C-8a),117.6 (C-1′), 116.1 (C-5), 104.0 (C-4), 98.1 (C-9a),96.2 (C-2), 77.1 (C-3′), 27.5 (4′-CH3), 27.5 (5′-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的一致，故鑒定為de-N-methyl-O-noracronycine。

化合物2黃色不定形粉末，與改良的碘化鉍鉀反應(yīng)顯色呈陽(yáng)性，ESI-MSm/z: 330.1 [M + Na]+,分子式為C19H17NO3,1H NMR (400 MHz, CDCl3):δH14.70 (1H, s, OH-1), 8.37 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz,H-8), 7.71 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz, H-6), 7.43 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-5), 7.30 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz,H-7), 7.55 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-1′), 6.26 (1H, s,H-2), 5.50 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-2′), 4.90 (3H, s, NCH3), 1.53 (3H, s, 4′-CH3), 1.53 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR (100 MHz, CDCl3):δC181.3 (C-9), 165.4 (C-3),161.7 (C-1), 145.1 (C-10a), 144.6 (C-4a), 134.1 (C-6),126.4 (C-8), 123.1 (C-2′), 122.2 (C-7), 122.1 (C-8a),121.7 (C-1′), 116.3 (C-5), 107.1 (C-4), 101.1 (C-9a),98.0 (C-2), 76.5 (C-3′), 43.8 (N-CH3), 27.0 (4′-CH3),27.0 (5′-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的一致，故鑒定為noracronycine。

化合物3黃色不定形粉末，與改良的碘化鉍鉀反應(yīng)顯色呈陽(yáng)性，ESI-MSm/z: 332.1 [M + Na]+,分子式為C19H19NO3,1H NMR (400 MHz, CDCl3):δH14.59 (1H, s, OH-1), 8.34 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz,H-8), 7.69 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz, H-6), 7.39 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-5), 7.26 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz,H-7), 6.38 (1H, s, H-2), 5.41 (1H, t,J= 6.4 Hz, H-2′),3.47 (2H, d,J= 6.4 Hz, H-1'), 3.83 (3H, s, N-CH3),1.81 (3H, s, 4′-CH3), 1.68 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR(100 MHz, CDCl3):δC181.7 (C-9), 163.9 (C-3), 163.5(C-1), 147.7 (C-4a), 146.6 (C-10a), 134.7 (C-6), 130.7(C-3′), 126.2 (C-8), 123.5 (C-2′), 121.8 (C-7), 121.7(C-8a), 116.5 (C-5), 107.5 (C-4), 104.7 (C-9a), 97.9(C-2), 44.3 (N-CH3), 27.3 (C-1′), 25.9 (4′-CH3), 18.3(5′-CH3)。經(jīng)與文獻(xiàn)[7]比較，鑒定化合物 3 為glycocitrine II。

化合物4黃色不定形粉末，與改良的碘化鉍鉀反應(yīng)顯色呈陽(yáng)性，ESI-MSm/z: 362.1 [M + Na]+,分子式為C19H17NO5,1H NMR (400 MHz, DMSOd6):δH14.65 (1H, s, OH-1), 9.60 (1H, s, NH), 7.78 (1H,d,J= 8.8 Hz, H-8), 6.91 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-7), 7.03(1H, d,J= 10.4 Hz, H-1?), 6.03 (1H, s, H-2), 5.69 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-2′), 3.93 (3H, s, 5-OCH3), 1.43 (3H, s,4′-CH3), 1.43 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6):δC180.1 (C-9), 163.8 (C-1), 159.0 (C-3),153.9 (C-6), 137.1 (C-4a), 135.9 (C-10a), 133.1 (C-5),125.5 (C-2′), 121.0 (C-8), 116.2 (C-2′), 113.3 (C-7),113.0 (C-8), 103.3 (C-9a), 98.4 (C-4), 96.4 (C-2), 77.1(C-3′), 60.4 (5-OCH3), 27.5 (4′-CH3), 27.5 (5′-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的一致，故鑒定為acrifoline。

化合物5 黃色不定形粉末，與改良的碘化鉍鉀反應(yīng)顯色呈陽(yáng)性，ESI-MSm/z: 308.1 [M + Na]+,分子式為C16H15NO4,1H NMR (400 MHz, DMSOd6):δH8.28 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-8), 7.83 (1H, m,overlap, H-6), 7.83 (1H, m, overlap, H-6, H-5), 7.34(1H, t,J= 8.0 Hz, H-7), 6.62 (1H, s, H-1), 4.00 (3H, s,2-OCH3), 3.90 (3H, s, N-CH3), 3.73 (3H, s, 4-OCH3);13C NMR (100 MHz, CDCl3):δC179.7 (C-9), 159.3(C-2), 154.9 (C-3), 141.8 (C-10a), 140.2 (C-4a), 134.3(C-5), 129.4 (C-4), 125.4 (C-8), 121.5 (C-7), 119.6(C-8a), 116.1 (C-6), 88.2 (C-1), 59.9 (4-OCH3), 56.1(2-OCH3), 34.2 (N-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的一致，故鑒定為3-hydroxy-2,4-dimethoxy-10-methyl-9-acridanone。

化合物6 無(wú)色晶體粉末，與改良的碘化鉍鉀反應(yīng)顯色呈陽(yáng)性，ESI-MSm/z: 266.1 [M + Na]+,分子式為C15H17NO2,1H NMR (400 MHz, DMSOd6):δH7.68 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.47 (1H,td,J= 8.0, 2.0 Hz, H-7), 7.32 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz,H-8), 7.19 (1H, td,J= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 5.16 (1H, td,J= 6.8, 3.2 Hz, H-2′), 3.86 (3H, s, 4-OCH3), 3.22 (2H,d,J= 6.8 Hz, H-1′), 1.73 (3H, s, 5′-CH3), 1.63 (3H, s,4′-CH3);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6):δC163.3(C-2), 160.6 (C-4), 137.7 (C-8a), 131.3 (C-3′), 130.0(C-7), 122.5 (C-5), 122.0 (C-3), 121.8 (C-6), 121.7(C-2′), 116.0 (C-4a), 115.2 (C-8), 61.5 (4-OCH3), 25.5(C-1′), 23.0 (5′-CH3), 17.8 (4′-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的一致，故鑒定為阿塔寧。

化合物7無(wú)色晶體粉末，與改良的碘化鉍鉀反應(yīng)顯色呈陽(yáng)性，ESI-MSm/z: 296.1 [M + Na]+, 分子式為C16H19NO3。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH7.23 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.08 (1H, td,J=8.0, 2.0 Hz, H-6), 7.04 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-7),5.15 (1H, td,J= 6.8, 3.2 Hz, H-2′), 3.86 (3H, s, 4-OCH3), 3.81 (3H, s, N-CH3), 3.24 (2H, d,J= 6.8 Hz,H-1′), 1.73 (3H, s, 5′-CH3), 1.63 (3H, s, 4′-CH3);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6):δC163.5 (C-2), 159.6(C-4), 146.1 (C-8), 131.3 (C-3′), 128.5 (C-8a), 122.7(C-3), 121.8 (C-6), 121.2 (C-2′), 119.5 (C-4a), 117.3(C-5), 113.8 (C-7), 61.5 (4-OCH3), 34.7 (N-CH3), 25.5(C-1′), 23.8 (5′-CH3), 17.8 (4′-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的一致，故鑒定為glycosolone。

化合物8黃色油狀物，與改良的碘化鉍鉀反應(yīng)顯色呈陽(yáng)性，ESI-MSm/z: 310.1 [M + Na]+, 分子式為C17H21NO3,1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH7.44 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.16 (1H, td,J=8.0, 2.0 Hz, H-6), 7.04 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-7),5.25 (1H, td,J= 6.8, 3.2 Hz, H-2′), 3.96 (3H, s, NCH3), 3.89 (3H, s, 8-OCH3), 3.88 (3H, s, 4-OCH3),3.40 (2H, d,J= 6.8 Hz, H-1′), 1.80 (3H, s, 5′-CH3),1.60 (3H, s, 4′-CH3);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6):δC165.2 (C-2), 160.2 (C-4), 148.9 (C-8), 132.6 (C-3′),130.7 (C-8a), 122.8 (C-3), 122.6 (C-6), 121.6 (C-2′),120.4 (C-4a), 116.1 (C-5), 113.6 (C-7), 61.8 (8-OCH3),56.8 (4-OCH3), 35.7 (N-CH3), 24.5 (C-1′), 25.8 (5′-CH3), 18.1 (4′-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的一致，故鑒定為3-(3?,3?-dimethylallyl)-4,8-dimethoxy-N-methyl-quinolin-2-one。

化合物9無(wú)色晶體粉末，與改良的碘化鉍鉀反應(yīng)顯色呈陽(yáng)性，ESI-MSm/z: 212.1 [M + Na]+, 分子式為C11H11NO2。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH7.88 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.65 (1H, td,J=8.0, 2.0 Hz, H-7), 7.51 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-8),7.26 (1H, td,J= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.04 (1H, s, H-3),3.95 (3H, s, 4-OCH3), 3.56 (3H, s, N-CH3);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δC162.3 (C-2), 161.8 (C-4),139.4 (C-8a), 131.4 (C-7), 122.6 (C-5), 121.5 (C-6),115.5 (C-4a), 114.7 (C-8), 96.3 (C-3), 56.1 (4-OCH3),28.6 (N-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的一致，故鑒定為4-methoxy-N-methyl-2-quinolone。

2 結(jié)果和討論

本研究從毛山小橘枝葉的95%工業(yè)乙醇提取物分離鑒定了9 個(gè)生物堿類(lèi)化合物，包括5 個(gè)吖啶酮類(lèi)生物堿和4 個(gè)喹諾酮類(lèi)生物堿，其中化合物2、3、5、6 和9 均為從山小橘屬植物中首次發(fā)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，化合物1、2、3 和4 具有抗血小板聚集活性，帶有吡喃環(huán)的acridone 母核是其活性的主要因素[15];此外，這些吖啶酮化合物可作為HL-60 細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑，預(yù)示它們具有潛在的癌癥預(yù)防作用[16]。在過(guò)敏反應(yīng)評(píng)價(jià)中，化合物5 對(duì)肥大細(xì)胞脫粒顯示出較強(qiáng)的抑制作用[10]。本研究結(jié)果在一定程度上闡明了毛山小橘的生物堿類(lèi)，可為山小橘屬植物資源的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。