饒德安，劉潘洋，鄒路易，滕 躍，郁紅艷*，尹光庭

（1.江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450018）

烤煙（Nicotiana tabacumL.）作為重要的經(jīng)濟作物，是卷煙工業(yè)的主要原料，其質(zhì)量和產(chǎn)量在煙草生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用［1-2］。受耕地資源、經(jīng)濟利益和栽培習(xí)慣等因素影響，宜煙地區(qū)連作現(xiàn)象普遍［3］，導(dǎo)致植株發(fā)育不良，煙葉產(chǎn)、質(zhì)量下降，吸食安全性降低［3］，造成每年經(jīng)濟損失高達40億元［4］，嚴(yán)重影響了煙草產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

根際微生態(tài)失衡可能是連作障礙發(fā)生的主要原因［5-6］。土壤微生物群落的改變可以改變?nèi)郝涞墓δ?，進而反應(yīng)在植物的生長和發(fā)育方面。此外，由于微生物群落與土壤條件和土地管理的密切關(guān)系，其可作為土壤健康的生物指標(biāo)［7］。許自成等［8］研究發(fā)現(xiàn)，長期連作導(dǎo)致烤煙根際土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致病菌增多。She等［9］研究連作12年的烤煙根際土壤時發(fā)現(xiàn)微生物OTU、Shannon、Pielou evenness和Chao1等指數(shù)與對照相比顯著下降。Wang等［10］報道了烤煙連作顯著降低了根際土壤有益細菌和真菌的相對豐度。作為土壤微生物區(qū)系的重要成員，土壤真菌與其他微生物一起參與土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動，包括碳、氮、磷和硫的循環(huán)，以及為植物提供營養(yǎng)等［11-12］。相反，真菌也可引起烤煙作物的土傳病害［13-14］，導(dǎo)致烤煙根、莖和葉的生長發(fā)育受阻［15］。

強還原土壤滅菌法（RSD）是一種在作物種植前的土壤處理方法，采用淹水+悶棚+有機物料的方式，阻隔土壤與大氣氣體交換，創(chuàng)造土壤強烈還原條件，短期內(nèi)殺滅土傳病原菌［16］。目前，強還原土壤滅菌方法是防治土傳病害和消除連作障礙廣泛應(yīng)用的新方法。周開勝［17］在西瓜連作土壤中發(fā)現(xiàn)RSD處理可明顯抑制致病尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf. sp. niveum）生長，西瓜的發(fā)病率和死亡率顯著低于對照組。朱同彬等［18］在研究連作黃瓜地時，發(fā)現(xiàn)RSD處理與未處理對比，顯著改善了土壤理化性質(zhì)并且提高了黃瓜的產(chǎn)量。Butler等［19］報道了RSD對多種土傳病原菌有殺菌效果，如番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporumSchlechtend）、白娟病菌（Sclerotium rolfsiiSacc）等。RSD對連作土壤具有良好的修復(fù)效果，但在烤煙土壤中的應(yīng)用與效果卻少有報道。

受限于技術(shù)手段，對煙草根際真菌群落的研究目前主要集中在群落組成、多樣性以及接種內(nèi)生菌上［20］。FUNGuild是一個進行真菌功能比對的數(shù)據(jù)庫，對真菌進行具體的功能分類。本研究聯(lián)合使用Illumina高通量測序技術(shù)［21］和FUNGuild，研究不同連作年限及RSD處理下對烤煙根際土壤真菌群落的影響，旨在為烤煙根際真菌群落的變化和緩解烤煙連作障礙提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況與試驗設(shè)計

試驗于2019年9～11月在河南省襄城縣汾陳鄉(xiāng)（113°31′ E， 33°58′ N）進行。該地區(qū)主要氣候類型為大陸季風(fēng)氣候，年平均氣溫約為14.7℃，年降水量約為453.13 mm，土壤類型為黃褐土。選取連續(xù)種植3年“中煙100”的煙田，采用淹水添加可溶性糖溶液覆膜法創(chuàng)造強還原環(huán)境，修復(fù)烤煙連作土壤，共設(shè)置2個處理：連作未處理（3年）和強還原處理（RSD），每個處理3組平行，共6個小區(qū)，小區(qū)面積為2.4 m×3 m，各個小區(qū)之間設(shè)置保護行，間距3 m。具體處理方法為：每個小區(qū)淹水至飽和，均勻投加糖溶液（0.5%添加量，糖溶液/土壤），覆蓋6絲地膜，60 d后揭膜，自然晾曬7 d。于2019年11月對上述小區(qū)土壤進行取樣，同時在試驗區(qū)采集烤煙連作3、5、7年根際的土壤。所有土樣于冰盒中保存，運回實驗室，分為兩部分，一部分置于室內(nèi)自然風(fēng)干用于測定土壤理化性質(zhì)，一部分置于-80℃冰箱保存用于提取DNA。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)按如下方法測定。土壤pH（水土質(zhì)量比為2.5∶1）使用pH計（Starter 3100，上海奧豪斯儀器有限公司）測定。土壤總碳（TOC）和總氮（TN）由C/N元素分析儀（Vario-micro，德 國Elementar公 司）測 定［22］?？?磷（TP）由硫酸-鹽酸消解，鉬藍比色法測定?？傗洠═K）由HF-HClO4消解，ICP-OES（Optima8300，美國PerkinElmer有限公司）測定［23］。所有結(jié)果均按

105 ℃烘干土重量計算。

1.3 土壤DNA提取及PCR擴增

土壤總DNA使用DNeasy PowerSoil試劑盒（QIAGEN GmbH， Germany），根 據(jù) 試 劑 盒 說 明提取。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，NanoDrop 2000（賽默飛世爾科技有限公司）檢測DNA純度和濃度，真菌18S⒚SSU0817F（5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’）和1196R（5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）引物對V5～V7可變區(qū)進行PCR擴增，采用GeneAmp? 9700型（美國ABI公司）PCR儀，使用反式Gen AP221-02（反式啟動FastPfu DNA聚合酶），反應(yīng)體積為20 μL，包括4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mol/L dNTPs、0.8 μL正向和反向引物（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu聚合酶、0.2 μL BSA，模板DNA 10 ng，適量ddH2O，27次循環(huán)周期的PCR程序如下：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃45 s，最后在72 ℃下延伸10 min，10 ℃直到儀器停止。2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。Axy-PrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）提取PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫產(chǎn)物。純化后的產(chǎn)物經(jīng)QuantiFluorTM-St-blue熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）定量，然后根據(jù)測序量的要求進行混合，最后由上海美吉生物制藥技術(shù)公司（中國上海）完成測序。

1.4 Illumina測序及序列處理

使用Illumina MiSeq PE250測序平臺對擴增產(chǎn)物進行雙端測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過Flash和Trimmomati進行拼接和質(zhì)控后，使用微生物生態(tài)學(xué)定量研究平臺QIIME（Quantitative Insights into Microbial Ecology）進行處理。使用UCLUS對各序列在97%的相似性水平下聚類操作分類單位（OTUs），各個OTU的代表序列使用UNITE數(shù)據(jù)庫（https：//unite.ut.ee/）進行物種信息比對。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

真菌的功能分組使用FUNGuild 1.0進行比對，F(xiàn)UNGuild是一款通過微生態(tài)Guild對真菌群落進行分類分析的工具，其基于目前已發(fā)表的文獻或權(quán)威網(wǎng)站數(shù)據(jù)，對真菌進行功能分類，主要步驟為：（1）將QIIME輸出的OTU表和物種信息表合并，將物種信息附加在OTU表的最后一列并命名為“taxonomy”；（2）將第（1）步得到的表格上傳到FUNGuild 網(wǎng)站，開始比對；（3）比對完成后下載輸出結(jié)果到本地。輸出結(jié)果包含原始的OTU表，并依據(jù)序列數(shù)量進行排序。運用R 3.5.1分析土壤理化性質(zhì)與真菌群落的相關(guān)性，繪制相關(guān)性熱圖。相關(guān)性熱圖可根據(jù)顏色梯度的變化直觀看出各指標(biāo)與菌種之間的相關(guān)性，顏色梯度由紅色到綠色表示相關(guān)性由近到遠。樣本的描述性分析、組間差異的顯著性分析使用SPSS 19.0中的獨立t檢驗完成。圖片由Origin 9.1制作。顯著性檢驗水準(zhǔn)均為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 長期連作及RSD處理對烤煙根際土壤理化性質(zhì)的影響

對不同連作年限及RSD處理的烤煙根際土壤理化性質(zhì)分析（表1）可知，隨著連作年限的增加，pH呈顯著下降趨勢，其中連作5和7年處理顯著低于其他處理；連作處理TOC呈下降趨勢，未達到顯著水平，RSD處理較未處理（3年）顯著提升TOC含量；連作7年處理總氮含量呈顯著下降，RSD處理較未處理（3年）顯著提升總氮含量；總鉀、總磷含量在各處理間無顯著變化。表明長期連作導(dǎo)致土壤質(zhì)量退化，養(yǎng)分比例失衡。

表1 連作及RSD處理對烤煙根際土壤理化性質(zhì)的影響

2.2 長期連作及RSD處理對真菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)的影響

對各樣品中測序得到的OTU進行分類表明，所有樣品共得到478個OTU，整體上隨連作年限呈明顯上升趨勢。與未處理（3年）相比，RSD處理降低了OTU數(shù)量（圖1）。4個處理中共有的OTU為65個，其中3年、5年、7年、RSD處理中特異的OTU分別為9、13、27、6個；連作處理樣品中特異的OTU隨著連作年限呈上升趨勢，其中RSD處理降低特異OTU 數(shù)量（圖2）。

圖1 不同處理真菌OTU數(shù)量

圖2 不同處理特異OTU數(shù)量韋恩圖

本試驗中，各處理的覆蓋率都在99.98%以上，表明本次測序結(jié)果接近樣本中微生物的實際情況，可進行Alpha多樣性分析。ACE、Jack指數(shù)代表真菌群落豐富度，Shannon、Invsimpson指數(shù)代表真菌群落多樣性。由圖3可知，其豐富度指數(shù)，連作7年處理顯著高于其他處理，連作3、5年處理間無顯著差別，RSD處理較未處理（3年）顯著降低群落豐富度指數(shù)；連作3和7年處理Shannon指數(shù)無顯著差異，顯著高于連作5年處理，RSD處理顯著低于未處理（3年）；Invsimpson指數(shù)在連作處理下呈升高趨勢，但未達到顯著水平，RSD處理顯著低于未處理組（3年）。

圖3 不同處理真菌Alpha多樣性指數(shù)變化

對測序結(jié)果主坐標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)（圖4），前兩個主坐標(biāo)的方差貢獻率分別為43.14%和33.47%。在第1主坐標(biāo)排序中，所有處理可分為連作7年處理、連作3和5年處理、RSD處理3組，在第2主坐標(biāo)排序中，RSD處理與連作3和5年處理顯著分離。表明連作達7年后根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化；RSD處理較未處理（3年）顯著改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)。由聚類分析（圖5）可知，在距離0.025處，可將RSD處理聚為一類，連作處理聚為一類。進一步表明RSD處理較未處理（3年）顯著改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)。

圖4 不同處理真菌主坐標(biāo)分析

圖5 不同處理真菌層級聚類分析

2.3 長期連作及RSD處理對真菌群落相對豐度的影響

由圖6統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，Sordariomycetes相對豐度隨連作年限呈先下降后上升的趨勢，但5、7年處理與3年處理相比都顯著下降，與未處理（3年）相比，RSD處理使其相對豐度升高；連作處理Dothideomycetes、Eurotiomycetes、Leotiomycetes和Intramacronucleata相對豐度逐年升高，連作年限時間愈長，升高幅度愈大，與未處理（3年）相比，RSD處理使其相對豐度顯著下降；連作處理下Mucoromycetes、Agaricomycetes呈先升后降的趨勢，與未處理（3年）相比，RSD處理使其相對豐度顯著升高；Tremellomycetes相對豐度在各處理下無顯著變化。結(jié)果顯示，各處理土壤樣品中真菌綱水平相對豐度發(fā)生顯著變化，表明長期連作及RSD處理顯著影響真菌群落結(jié)構(gòu)。

圖6 不同處理真菌綱水平相對豐度變化

進一步對相對豐度排名前20的真菌屬分析發(fā)現(xiàn)，連作處理導(dǎo)致Chaetomium、Solicoccozyma、Plectosphaerella相對豐度先降低后上升，RSD處理與未處理（3年）相比顯著降低Solicoccozyma、Plectosphaerella相對豐度；連作處理顯著提高Fusarium、Cladosporium、unclassified-Pleosporales、norank-Leotiomycetes、Aspergillus、Colpoda、unclassified-Onygenales的相對豐度，與未處理（3年）相比，RSD處理降低其相對豐度，其中Fusarium相對豐度下降達顯著水平（P＜0.05）；連作導(dǎo)致norank-Mucoromycota、norank-Pyronemataceae、Sistotrema先增加后降低，RSD處理較未處理（3年）顯著增加其相對豐度；連作處理顯著降低unclassified-Microascaceae、Phymatotrichopsis相對豐度，除unclassified-Microascaceae、norank-Aphelidea外，RSD處理較未處理（3年）顯著降低其相對豐度；norank-Aphelidea、norank-Helotiales、Hypocrealla、norank-Pezizaceae、norank-Sordariomycetes相對豐度在各處理下無顯著變化。

表2 不同處理真菌屬水平相對豐度變化 （%）

2.4 長期連作及RSD處理對不同功能真菌相對豐度的影響

將測序結(jié)果與FUNGuild真菌數(shù)據(jù)庫進行比對，在測定的所有土壤樣本中主要發(fā)現(xiàn)4種功能真菌（表3）。統(tǒng)計分析表明，連作處理顯著提高烤煙根際土壤植物病原菌的相對豐度，與未處理（3年）相比，RSD 處理顯著降低連作處理植物病原菌的相對豐度；植物內(nèi)生菌相對豐度隨著連作年限呈先下降后上升的趨勢，連作5年處理其相對豐度明顯低于其他處理，但未達到顯著水平；連作處理下外生菌根相對豐度無顯著變化，與未處理（3年）相比，RSD 處理顯著提高外生菌根相對豐度；各處理下動物病原菌相對豐度無顯著變化。表明連作顯著改變了植物功能菌的相對豐度，RSD處理對其具有良好修復(fù)效果。

表3 不同功能真菌相對豐度變化 （%）

2.5 真菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性熱圖分析

由圖7可知，Solicocozyma相對豐度與根際土壤總氮含量呈顯著負相關(guān)，Cladosporium、unclassified-Pleosporales、norank-Leotiomycetes、Colpoda、Fusarium、Aspergillus、unclassified-Onygenales的相對豐度與根際土壤pH、有機質(zhì)和總氮的含量呈顯著負相關(guān)；Sistotrema和norank-Zoopagomycota相對豐度與根際土壤pH、有機質(zhì)和總氮的含量呈顯著正相關(guān)；Pyronemataceae與根際土壤總鉀含量呈顯著正相關(guān)，norank-Aphelidea與根際土壤總鉀、總磷含量呈顯著正相關(guān)。

圖7 真菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性熱圖分析

3 討論

3.1 長期連作導(dǎo)致烤煙根際土壤質(zhì)量退化

前人在研究烤煙［24-25］、草莓［26］、黃連［27］和水稻［28］等連作時發(fā)現(xiàn)，土壤pH和養(yǎng)分隨著連作年限顯著下降，且連作年限愈久，土壤質(zhì)量退化愈嚴(yán)重。本研究表明，長期連作導(dǎo)致烤煙根際土壤pH、土壤總碳和總氮顯著下降，說明長期連作烤煙導(dǎo)致土壤質(zhì)量退化。根際土壤pH的降低可能是由于長期連作導(dǎo)致根系釋放的化感物質(zhì)大量累積導(dǎo)致的［29-30］。土壤總碳和總氮含量顯著降低可能是因為烤煙在長期連作的脅迫下，為保證其生長發(fā)育和內(nèi)在品質(zhì)，選擇性吸收大量元素［31］。土壤總碳具有保水保肥、促進土壤團聚體形成、改善土壤物理性質(zhì)等作用［32］，因此，總碳在保持土壤質(zhì)量和作物生產(chǎn)力方面起著關(guān)鍵作用。氮是植物生長發(fā)育必不可少的元素，Lisuma等［31］發(fā)現(xiàn)氮素影響煙葉的顏色、口感、煙氣和香氣，進而影響煙葉的內(nèi)在品質(zhì)。同時氮是蛋白質(zhì)的組成元素，在植物體內(nèi)合成各種結(jié)構(gòu)和酶［33］。缺氮會導(dǎo)致葉綠素含量［34］、同化能力、酶活性和酶含量下降［33，35］，進而導(dǎo)致植物生物量和質(zhì)量的下降。本研究結(jié)果表明，總磷和總鉀長期連作無顯著變化，其歸因于豫中煙區(qū)常年施肥模式，為追求高產(chǎn)量和優(yōu)質(zhì)煙葉，煙農(nóng)忽視養(yǎng)分平衡，大量施用鉀肥和磷肥。

3.2 長期連作導(dǎo)致烤煙根際土壤真菌群落顯著變化

長期連作導(dǎo)致烤煙根際土壤微生態(tài)偏向真菌型［3，36］。張笑宇等［37］研究烤煙輪作與連作時發(fā)現(xiàn)連作煙田真菌數(shù)量顯著高于輪作煙田，進一步分析微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)連作煙田根腐病病菌Pythium相對豐度較高。許自成等［8］研究發(fā)現(xiàn)長期連作烤煙導(dǎo)致土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，腐霉科、盤菌科和鐮刀菌屬等致病菌增多。Liu等［38］在研究其他旱作作物長期連作時發(fā)現(xiàn)了11種潛在病原真菌，大多數(shù)潛在病原真菌的相對豐度顯著增加。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期連作烤煙導(dǎo)致根際土壤真菌群落豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)顯著上升，群落結(jié)構(gòu)顯著變化；Fusarium［14］、Cladosporium［39］、Plectosphaerella［40］等是已知植物病原菌，Pleosporales目中有些真菌易引起嚴(yán)重的植物病蟲害［41-42］，而Aspergillus在果實病害、采后病害［43-44］以及秋葵病蟲害中均有報道［45］，烤煙連作顯著促進上述5種菌種的相對豐度。同時FUNGuild數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期連作導(dǎo)致植物病原菌相對豐度顯著增加，外生菌根真菌相對豐度顯著下降，表明長期連作導(dǎo)致致病菌增多，有益微生物減少。前人研究表明，土壤質(zhì)量能夠直接或間接影響微生物群落，土傳病害是由于連續(xù)單作導(dǎo)致土壤質(zhì)量退化而發(fā)生的，土壤微生物群落對環(huán)境變化反應(yīng)迅速，與土壤條件和土地管理密切相關(guān)［6］。潘義宏等［15］研究云煙105時發(fā)現(xiàn)，土壤營養(yǎng)趨于協(xié)調(diào)、健康，降低了土傳病害的發(fā)病率。馬少蘭等［46］研究連作枸杞地時發(fā)現(xiàn)土壤pH、電導(dǎo)率、硝態(tài)氮和有效磷含量是解釋再植枸杞根際真菌群落變化的主要因素。葉浩等［47］研究貴州煙區(qū)時指出pH與烤煙土傳病發(fā)病率呈負相關(guān)。土壤有機質(zhì)含量與有益細菌呈正相關(guān)［48］，與土壤疾病發(fā)病率呈負相關(guān)［49］，這可能表明土壤有機質(zhì)在疾病抑制中具有潛在作用［50］。本研究也得到類似的 結(jié) 果，F(xiàn)usarium、Cladosporium、Plectosphaerella等已知植物病原菌以及unclassified-Pleosporales和Aspergillus相對豐度與pH、總碳和總氮呈顯著負相關(guān)，表明長期連作導(dǎo)致pH、總碳和總氮含量下降是真菌群落病原菌增多、群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素。在豫中煙區(qū)實際生產(chǎn)中，大量施用磷肥、鉀肥，導(dǎo)致磷、鉀元素過量，碳、氮元素匱乏，長期土壤養(yǎng)分失衡導(dǎo)致烤煙根際微生態(tài)惡化。

越來越多的研究表明，連作過程中，根際分泌物不會累積到直接毒害作物的濃度，往往通過影響病原菌萌發(fā)、繁殖等造成連作障礙［51］。病原菌的相對豐度逐年增加，可能的原因是根際分泌物為其提供了基質(zhì)，導(dǎo)致連作系統(tǒng)中大量病原菌富集。桑正林等［52］研究發(fā)現(xiàn)，烤煙在生長發(fā)育前期通過根系分泌較多的單糖到根際土中，為土壤中黑脛病菌的生長發(fā)育提供了物質(zhì)和能源，促進了煙草黑脛病菌的生長；Morris等［53］發(fā)現(xiàn)大豆根系分泌異黃酮可以吸引一種病原菌；Hao等［54］還發(fā)現(xiàn)西瓜的根系分泌物促進了病原菌的生長。

3.3 RSD處理修復(fù)烤煙根際土壤

強還原土壤滅菌法（RSD）已被廣泛應(yīng)用于作物連作系統(tǒng)中。朱同彬等［55］研究表明RSD應(yīng)用于設(shè)施蔬菜系統(tǒng)中，可有效消除硝酸鹽和硫酸根，顯著提高土壤pH。周開勝［17］研究發(fā)現(xiàn)強還原滅菌法應(yīng)用于西瓜連作土壤中能有效殺死病原菌。本研究發(fā)現(xiàn)，RSD處理顯著提高土壤總碳和總氮含量，改善土壤質(zhì)量。RSD通常選取易降解的有機物料作為碳源添加，大部分有機物料都取得了較好的滅菌效果，但是呈現(xiàn)差異性，這與有機物料本身理化性質(zhì)有很大關(guān)系，如易降解碳和難降解碳的比重、碳氮比等。有研究指出，雖然RSD處理選用易降解的有機物料，但由于施用量大、純度高，處理后仍有相當(dāng)數(shù)量的有機物質(zhì)殘留在土壤中，成為土壤有機質(zhì)的一部分，可提高土壤有機質(zhì)含量、改善土壤結(jié)構(gòu)［56］。有學(xué)者指出，經(jīng)RSD處理后蔬菜地土壤氮的轉(zhuǎn)化過程發(fā)生顯著變化，加快無機氮周轉(zhuǎn)速率，提高氮的有效性［16］。本研究中選用的有機物料為蔗糖和玉米粉混合糖溶液，含有大量碳、氮元素，增加根際土壤總碳和總氮含量。本研究中RSD處理對pH無顯著影響，蔡祖聰?shù)龋?6］研究表明，對于酸化土壤經(jīng)過強烈還原處理后，pH均大幅度提高，隨有機物料施用量的增加而升高。但是，對于并未酸化的土壤，RSD處理對pH的影響很小，在處理過程中由于有機酸的生成甚至可能使土壤pH有所下降。

本試驗中，RSD處理顯著降低真菌群落OTU數(shù)量、多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)，改變真菌群落結(jié)構(gòu)，降低Fusarium、Cladosporium、Plectosphaerella等已知植物病原菌以及unclassified-Pleosporales和Aspergillus等可能引起植株、果實病害菌種的相對豐度，表明RSD處理對烤煙連作土壤真菌群落具有一定的修復(fù)效果。其原因可能如下［16，56-59］：首先，烤煙致病菌大多數(shù)為好氧菌，RSD處理創(chuàng)造強烈的厭氧環(huán)境使得這些病原菌無法生存；其次，有機物料厭氧發(fā)酵產(chǎn)生對土傳病原菌有毒有害的物質(zhì)，如有機酸、氨氣、硫化氫和生物活性物質(zhì)等，殺滅土傳病原菌。當(dāng)RSD處理結(jié)束時，這些有毒有害物質(zhì)可以快速分解或快速再氧化，一般其濃度已經(jīng)下降至對作物無害的程度。

本試驗結(jié)果表明，RSD處理較未處理（3年）顯著提高總碳和總氮含量。主坐標(biāo)軸分析和聚類分析表明，RSD處理較未處理（3年）顯著改變真菌群落結(jié)構(gòu)。FUNGuild數(shù)據(jù)庫比對分析表明，RSD處理較未處理（3年）顯著降低植物病原菌相對豐度（降低46.08%）。整體來講，RSD處理對連作3年烤煙根際土壤質(zhì)量具有良好的修復(fù)效果，對真菌群落具有一定的修復(fù)效果。溫度對強還原滅菌處理效果顯著影響，且溫度越高修復(fù)效果越好［18］。前人的研究通常在作物休耕一年或種植休閑期，選取夏季高溫時間（5～8月）進行試驗［17-18］。本試驗中考慮到當(dāng)?shù)責(zé)熮r(nóng)經(jīng)濟收入，并未休耕，RSD處理時間選為烤煙作物收獲之后（9～11月）進行。溫度較前人試驗較低。再者，對不同連作年限根際土壤分析發(fā)現(xiàn)，連作年限時間愈長，土壤質(zhì)量和真菌群落惡化程度愈嚴(yán)重。本試驗選取連作3年煙田（考慮到豫中煙區(qū)實際生產(chǎn)中，以連作3年最為普遍）進行RSD處理，其對真菌群落修復(fù)效果一般。由圖3～5分析可知，RSD處理與5、7年處理差異程度很大，RSD處理對連作年限超過3年的煙田可能具有良好的潛在修復(fù)效應(yīng)。

4 結(jié)論

烤煙長期連作導(dǎo)致根際土壤質(zhì)量顯著退化；測序結(jié)果表明，連作促進根際土壤真菌群落Alpha多樣性水平升高，真菌群落結(jié)構(gòu)變化，病原菌豐度增加，當(dāng)連作年限達5年時，其變化達到顯著水平；土壤質(zhì)量退化導(dǎo)致根際土壤病原菌增多可能是豫中煙區(qū)連作障礙的主要原因之一。RSD處理對烤煙連作土壤的質(zhì)量具有良好的效果，對真菌群落具有一定的修復(fù)效果。如果烤煙作物休耕1年，選取夏季高溫天氣作為RSD修復(fù)時間，將取得更好的修復(fù)效果。同時，選取連作年限較長（＞3年）的煙田作為RSD處理樣地，可能具有更好的修復(fù)效果。