葉彬 向秋 金文杰

肺癌分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，NSCLC占肺惡性腫瘤的80%左右[1-2]。NSCLC預(yù)后依然較差[3]。叉頭框蛋白Q1(forkhead box Q1，F(xiàn)OXQ1)是一個具有高度保守的叉頭框(FOX)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[4]。細胞周期蛋白D1(CyclinDl)是腫瘤細胞增殖周期G1、S期限制點的調(diào)控因子，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]。本研究探討FOXQ1和CyclinDl兩種因子在NSCLC組織中的表達與臨床病理特點、預(yù)后的相關(guān)性，以及二者是否存在相關(guān)性、二者聯(lián)合檢測對NSCLC預(yù)后分析的意義。

對象與方法

一、對象

2014年12月～2017年10月我院胸心外科確診并接受根治性手術(shù)的NSCLC病人196例，選取NSCLC組織作為觀察組，同時選取癌旁組織(距腫瘤邊緣>5cm)作為對照組。納入標準：(1)均符合原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2018年版)中肺癌手術(shù)適應(yīng)證和禁忌證，且經(jīng)術(shù)后病理診斷為NSCLC；(2)均行肺癌根治性切除術(shù)；(3)有完整詳細的臨床隨訪資料和病理診斷資料；(4)術(shù)前未接受免疫治療、放化療或靶向治療；(5)死亡原因均為肺癌；(6)病人或家屬簽署知情同意書。排除標準：術(shù)前接受新輔助治療；合并有其他原發(fā)性腫瘤；行姑息性手術(shù)；隨訪資料缺失。196例病人中男147例，女49例；年齡33～76歲，平均年齡(54.97±9.76)歲；中高分化125例，低分化71例；鱗癌72例，腺癌90例，其他類型34例；已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移112例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移84例；Ⅰ期50例，Ⅱ期75例，Ⅲ期63例，Ⅳ期8例。

二、方法

1.檢測方法：采用EnVisio法檢測組織中FOXQ1和CyclinDl蛋白的表達。石蠟切片，經(jīng)抗原修復(fù)、清除內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉后，滴加FOXQ1、CyclinDl抗體進行一抗孵育，后加入生物素標記進行二抗孵育，通過DAB顯色及復(fù)染后完成免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果判斷：兩種蛋白陽性顯色為淺黃色至棕黃色顆粒。根據(jù)染色強度與染色陽性細胞百分比對結(jié)果進行評定。隨機觀察5個高倍鏡(×400)視野進行計數(shù)，每個視野計數(shù)≥1000個細胞。染色細胞百分率評分：陽性細胞率≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度評分：淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。表達結(jié)果為2項乘積，0～3分為低或無表達，4～12分為高表達。

2.隨訪：采用來院就診或電話隨訪。隨訪截至2020年8月31日，隨訪時間1～60個月。隨訪內(nèi)容為病人無進展生存期(progression-free survival, PFS)和總體生存時間(overall survival, OS)。PFS為手術(shù)開始至第1次腫瘤出現(xiàn)繼發(fā)性生長的時間；OS為手術(shù)開始至末次隨訪或死亡的時間。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman秩相關(guān)分析FOXQ1與CyclinD1在NSCLC組織中表達的相關(guān)性。采用Cox比例風險模型進行單因素和和多因素分析，生存率分析采用Kaplan-Meier法，比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.FOXQ1、CyclinDl蛋白在NSCLC和癌旁組織中表達比較見表1和圖1。NSCLC組織中FOXQ1、CyclinDl蛋白高表達率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 FOXQ1、CyclinDl蛋白在NSCLC和癌旁組織中表達(例，%)

A:FOXQ1蛋白在NSCLC組織中高表達；B:FOXQ1蛋白在NSCLC組織中低表達;C:CyclinDl蛋白在NSCLC組織中高表達；D:CyclinDl蛋白在NSCLC組織中低表達

2.NSCLC病人FOXQ1、CyclinDl蛋白表達情況與臨床病理特征的關(guān)系：NSCLC組織中FOXQ1、CyclinDl高表達與年齡、性別、吸煙、病理類型、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，與病理分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 FOXQ1、CyclinDl蛋白表達與NSCLC病人臨床病理特征的關(guān)系

3.NSCLC組織中FOXQ1和CyclinDl蛋白的相關(guān)性分析：在NSCLC組織中，F(xiàn)OXQ1和CyclinDl蛋白均為高表達的有89例，F(xiàn)OXQ1和CyclinDl蛋白均為無或低表達的有30例，F(xiàn)OXQ1高表達和CyclinDl蛋白無或低表達的有41例 ，F(xiàn)OXQ1無或低表達和CyclinDl高表達的有36例。Spearman等級相關(guān)性分析顯示，在NSCLC組織中，F(xiàn)OXQ1和CyclinDl蛋白的表達情況呈正相關(guān)(r=-0.639,P<0.001)。

4.預(yù)后影響因素分析：采用Cox比例風險回歸模型對影響NSCLC根治術(shù)病人PFS和OS的因素進行分析。影響NSCLC根治術(shù)病人PFS的單因素分析顯示，病理分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FOXQ1高表達、CyclinDl高表達、FOXQ1高表達+CyclinDl高表達均與病人PFS有關(guān)(P<0.05)；為了排除各因素之間的相互影響,將單因素分析中有意義的變量納入多因素分析顯示，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FOXQ1高表達、CyclinDl高表達、FOXQ1高表達+CyclinDl高表達均是影響病人PFS的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。影響NSCLC根治術(shù)病人OS的單因素分析顯示,病理分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FOXQ1高表達、CyclinDl高表達、FOXQ1高表達+CyclinDl高表達均與病人OS有關(guān)(P<0.05)；為了排除各因素之間的相互影響,將單因素分析中有意義的變量納入多因素分析顯示，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FOXQ1高表達、CyclinDl高表達、FOXQ1高表達+CyclinDl高表達均影響病人OS的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

表3 PFS的單因素和多因素分析

表4 OS的單因素和多因素分析

5.生存分析：196例非小細胞肺癌病人中，死亡94例，生存102例。Kaplan-Meier分析顯示，F(xiàn)OXQ1高表達病人PFS、OS短于低或無表達組(χ2=6.328、6.107,P=0.012)；CyclinDl高表達病人PFS、OS短于低或無表達組(χ2=4.983、5.550,P=0.026)； FOXQ1、CyclinDl兩者高表達病人PFS、OS短于其他病人(χ2=145.248、122.599,P=0.006)；FOXQ1、CyclinDl兩者高表達病人PFS、OS短于FOXQ1、CyclinDl單獨高表達病人(χ2=35.269、36.104,P=0.006)。見圖2、3。

圖2 兩者高表達病人和FOXQ1、CyclinDl單獨高表達病人的PFS生存曲線

圖3 兩者高表達病人和FOXQ1、CyclinDl單獨高表達病人的OS生存曲線

討論

FOXQ1是轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在多種組織中廣泛表達，可通過識別并結(jié)合相關(guān)下游靶基因的近端或遠端順式作用元件，實現(xiàn)對眾多下游靶基因表達水平的正向或負向調(diào)控[6-8]。Fan等[9]研究報道，F(xiàn)OXQ1是惡性腫瘤中wnt信號通路的新的激活標志物?；蚬脖磉_分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌[10]、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌及胰腺癌等多種惡性腫瘤中，癌細胞中FOXQ1高表達與wnt信號通路活化相關(guān)[11-14]。FOXQ1在NSCLC中發(fā)揮重要作用，其可通過結(jié)合上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化重要調(diào)控分子上皮型E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的基因啟動子區(qū)E-box來轉(zhuǎn)錄來抑制E-cadherin的表達，從而降低細胞間的黏附力，促進細胞游離及延伸生長，促進腫瘤細胞脫離原發(fā)灶，進而發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移[15]。大量研究表明，在胃癌、肝癌、乳腺癌及結(jié)腸癌組織中FOXQ1蛋白高表達，預(yù)示著病人預(yù)后不良[13,10-11]。

惡性腫瘤是一種細胞周期疾病，在遺傳突變和環(huán)境改變的影響下，基因突變及染色體異常分離導(dǎo)致細胞周期異常調(diào)控以至于細胞惡性增殖形成腫瘤[16]。Cyclins是一個與細胞周期相關(guān)的核蛋白家族，是細胞周期調(diào)節(jié)的核心分子,其在細胞增殖調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[17-18]。Cyclin D1主要通過激活G1期特有的周期蛋白依賴依賴性激酶CDK4并結(jié)合，然后使G1期周期抑制蛋白磷酸化，被磷酸化的周期抑制蛋白會與與其結(jié)合的E2F轉(zhuǎn)錄因子分離，進而就會推動細胞周期由G1期進入到S期[19]。有研究表明，Cyclin D1在腫瘤組織中表達增強，Cyclin D1是細胞周期G1期中衡量表達的癌基因，其過量表達可引發(fā)G1期時間減少、加速細胞分裂，誘發(fā)細胞增殖失控而惡化，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]。有研究表明，Cyclin D1蛋白在鼻咽癌、乳腺癌和胃癌等惡性腫瘤中均呈高表達，在NSCLC細胞中，抑制Cyclin D1的表達后能夠使細胞的增殖發(fā)生阻礙[21-23]。本研究結(jié)果表明，NSCLC組織中CyclinDl蛋白高表達率高于癌旁組織；NSCLC組織中CyclinDl高表達與病理分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；Cox回歸分析顯示，CyclinDl是影響NSCLC病人PFS和OS的獨立危險因素；Kaplan-Meier分析顯示，CyclinDl高表達組病人PFS和OS低于低或無表達組。結(jié)果表明,CyclinD 1高表達與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。

Spearman相關(guān)性分析顯示，在NSCLC組織中，F(xiàn)OXQ1和CyclinDl蛋白的表達情況呈正相關(guān)；Cox回歸分析顯示，F(xiàn)OXQ1和CyclinDl兩者均高表達是影響NSCLC病人PFS和OS的獨立危險因素；Kaplan-Meier分析顯示，F(xiàn)OXQ1、CyclinDl兩者高表達病人PFS和OS低于其他病人；FOXQ1、CyclinDl兩者高表達病人PFS和OS低于FOXQ1、CyclinDl單獨一種高表達病人。結(jié)果表明,FOXQ1可能通過調(diào)控CyclinDl，參與細胞周期調(diào)節(jié)，促進腫瘤細胞增殖，在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起作用。兩者聯(lián)合檢測可應(yīng)用于臨床判斷NSCLC的轉(zhuǎn)移潛能及病人的預(yù)后。