李若同, 胡繼業(yè)

(北京科技大學 化學與生物工程學院，北京 100083)

番茄Lycopersicum esculentumMill. 在生產(chǎn)過程中易受到病蟲危害，導致產(chǎn)量和品質(zhì)下降，常見病害有灰霉病Botrytis cinerea和白粉病Uncicula necator[1]。吡噻菌胺 (penthiopyrad，結(jié)構(gòu)式見圖式1-a) 是一種新型的吡唑酰胺類殺菌劑，可有效防治番茄灰霉病和白粉病[2]。其作用機理是通過抑制琥珀酸脫氫酶來影響靶標菌的線粒體呼吸鏈電子傳遞，從而破環(huán)其活性[3]。研究表明，吡噻菌胺在早期對斑馬魚有急性毒性，并會在其發(fā)育過程中誘發(fā)一系列畸形[4]。吡噻菌胺在田間施用后的主要代謝物1-甲基-3- (三氟甲基) -1H-吡唑-4-甲酰胺 (PAM，結(jié)構(gòu)式見圖式1-b) ，其毒性比母體高[5]。GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定吡噻菌胺監(jiān)測定義為吡噻菌胺[6]，而農(nóng)藥殘留聯(lián)席會議JMPR (2012) 規(guī)定吡噻菌胺的評估定義為吡噻菌胺及其代謝物PAM 之和，以吡噻菌胺表示[5]。肟菌酯 (trifloxystrobin，結(jié)構(gòu)式見圖式1-c) 屬甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其作用機理是通過阻止線粒體的電子傳遞鏈來抑制線粒體的呼吸作用[7]，具有殺菌譜廣和耐雨水沖刷等特點，被廣泛用于防治馬鈴薯、黃瓜、番茄和蘋果等作物上的病害[8-9]。研究表明，肟菌酯對部分水生非靶標生物具高毒或劇毒[8]。肟菌酯在被植物吸收后，會產(chǎn)生代謝物肟菌酸 (trifloxystrobin acid，結(jié)構(gòu)式見圖式1-d)[10]。有研究表明，酸性代謝物具有更高的水溶性，有可能對生態(tài)環(huán)境中的有益的動植物群體造成傷害[9]。GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定，肟菌酯監(jiān)測定義為肟菌酯[6]，而JMPR (2017)規(guī)定肟菌酯的評估定義為肟菌酯及其代謝物肟菌酸之和，以肟菌酯表示[10]。鑒于此，檢測農(nóng)作物中吡噻菌胺及其代謝物PAM 和肟菌酯及其代謝物肟菌酸的殘留對維護膳食安全和環(huán)境安全至關(guān)重要。

圖式1 吡噻菌胺 (a)、PAM (b)、肟菌酯 (c) 和肟菌酸 (d)的化學結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of penthiopyrad (a),PAM (b), trifloxystrobin (c) and trifloxystrobin acid (d)

目前，關(guān)于吡噻菌胺殘留的檢測方法主要有固相萃取技術(shù)或QuEChERS 結(jié)合高效液相色譜法(HPLC) 、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC-MS/MS) 以及氣相色譜法 (GC)[3,11-14]，但大部分的研究僅限于對吡噻菌胺母體的檢測，僅有一篇文獻報道了吡噻菌胺和代謝物PAM 在紫蘇葉上的同時檢測[12]。關(guān)于肟菌酯及其代謝物肟菌酸的檢測方法有HPLC-MS/MS、GC 和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS) ，涉及番茄[8]、小麥[15]、西瓜[16]、咖啡[17]、水稻[18-19]和黃瓜[20]等作物。已有學者運用GC 建立了吡噻菌胺和肟菌酯在蜂蜜、蘋果花和蜜蜂體內(nèi)以及人血清中的檢測方法[21-22]，但這些研究僅檢測了吡噻菌胺和肟菌酯母體的殘留量。綜上所述，目前尚未見吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄中殘留同時檢測的報道，且未見通過多地殘留試驗結(jié)果對吡噻菌胺和肟菌酯在番茄中的膳食風險進行評估的相關(guān)研究。

本研究依據(jù)NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[23]在中國12 地開展了30%吡噻菌胺 ? 肟菌酯懸浮劑 (吡噻菌胺10%，肟菌酯20%，單位g/100 g) 在番茄上施用的田間規(guī)范殘留試驗，利用QuEChERS-HPLC-MS/MS 法對吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄上的殘留量進行分析，并結(jié)合田間殘留試驗結(jié)果、膳食結(jié)構(gòu)和毒理學數(shù)據(jù)進行了吡噻菌胺和肟菌酯的膳食風險評估，旨在為30%吡噻菌胺 ? 肟菌酯懸浮劑在番茄生產(chǎn)中的科學使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260HPLC-6460 MS/MS 液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 (美國Agilent 公司)；FA2504型電子天平 (0.0001 g) 和MP2002 型電子天平 (0.01 g)(上海恒平科學儀器有限公司)；QL-861 型渦旋振蕩器 (其林貝爾儀器制造有限公司)；TG16B 型離心機 (湖南凱達科學儀器有限公司)。

100%肟菌酯 (trifloxystrobin) 和99.6%肟菌酸(trifloxystrobin acid) 標準品，購于北京勤誠亦信科技開發(fā)有限公司，99.9%吡噻菌胺 (penthiopyrad)和100%PAM 標準品，以及30%吡噻菌胺 ? 肟菌酯懸浮劑 (30% suspension concentrate of penthiopyrad and trifloxystrobin，吡噻菌胺10%，肟菌酯20%) ，均由江蘇龍燈化學有限公司提供；N-丙基乙二胺(PSA) ，購于天津博納艾杰爾科技有限公司；石墨化碳黑 (GCB) ，購于南京先豐納米有限公司；氯化鈉和無水硫酸鎂，購于國藥集團化學試劑有限公司；色譜純乙腈，購自邁瑞達科技有限公司；色譜純甲酸，購自北京迪馬科技有限公司；分析純乙腈和乙酸，購自北京市通廣精細化工公司。

1.2 田間試驗

依據(jù)NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[23]，30%吡噻菌胺 ? 肟菌酯懸浮劑在番茄中的殘留試驗于2020 年在北京、寧夏銀川、山東濟南、貴州貴陽、河南永城、江蘇南京、內(nèi)蒙古呼和浩特、山西太原、上海松江、湖南長沙、廣西南寧和福建福安12 地開展。試驗設(shè)處理和對照小區(qū)，每小區(qū)面積50 m2，兩個小區(qū)間設(shè)隔離區(qū)。30%吡噻菌胺 ? 肟菌酯懸浮劑施藥劑量為有效成分270 g/hm2，于番茄灰霉病發(fā)生初期噴霧施藥2 次，施藥間隔7 d (推薦的安全間隔期為5 d) 。分別于末次施藥后5 和7 d 采用隨機取樣法采集番茄樣本。每次在試驗小區(qū)內(nèi)至少12 株番茄植株的上、下、左、右采集24 個番茄果實2 份，每份不少于2 kg，除去果梗后用干毛刷除去表面塵土，用不銹鋼刀沿縱向均勻地切成4 瓣，取不相鄰的兩瓣混勻，分取250 g 樣本兩份，于 ?20 ℃保存，備用。除此之外，在北京、寧夏銀川、山東濟南和貴州貴陽4 個試驗點于末次施藥后間隔0 (2 h)及1、3 和10 d 也依照上述方法采集番茄樣本。

1.3 殘留分析方法

1.3.1 樣品前處理 稱取5 g (精確至0.01 g) 勻漿的番茄樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈和0.1 mL 乙酸，渦旋1 min，加入1 g 氯化鈉和4 g 硫酸鎂，渦旋30 s，于3000 r/min 下離心3 min；取1.5 mL 上清液，轉(zhuǎn)移至預先加有PSA 20 mg、GCB 15 mg 和硫酸鎂150 mg 的2 mL 離心管中，渦旋30 s，于10000 r/min 下離心3 min；取上清液，過0.22 μm 濾膜，待HPLC-MS/MS 檢測。

1.3.2 HPLC-MS/MS 檢測條件

色譜條件：Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱 (3.0 mm × 50 mm，2.7 μm) ，柱溫為25 ℃；流動相為V(乙腈) :V(體積分數(shù)為0.2%的甲酸水溶液) =80 : 20，等度洗脫，分析時間為2 min；流速0.45 mL/min；進樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描 (ESI+) ，多反應監(jiān)測模式 (MRM) ，干燥氣溫度350 ℃，流速12 L/min，霧化氣壓力275.8 MPa，毛細管電壓4000 V。其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸質(zhì)譜檢測條件Table 1 Mass spectrometry parameters for penthiopyrad, PAM, trifloxystrobin and trifloxystrobin acid

1.3.3 標準溶液配制及標準曲線繪制 稱取0.02 g(精確至0.0001 g) 吡噻菌胺或PAM 標準品，用乙腈溶解并定容至25 mL，配制成質(zhì)量濃度為800 mg/L的標準儲備液；稱取0.01 g 肟菌酯或肟菌酸標準品，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1000 mg/L 的標準儲備液。取適量的吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸標準儲備液，用乙腈稀釋，配制質(zhì)量濃度為100、50、35 和20 mg/L的系列混合標準工作溶液，于4 ℃保存，用于后續(xù)試驗。

分別用番茄空白基質(zhì)溶液和乙腈稀釋20 mg/L的混合標準工作溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.025、0.1、0.25、1 和2 mg/L 的番茄基質(zhì)匹配標準溶液和溶劑匹配標準溶液。按1.3.2 節(jié)的條件測定，分別以4 種化合物的進樣質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標，相應的峰面積 (y) 為縱坐標，繪制4 種化合物基質(zhì)匹配標準曲線和溶劑匹配標準曲線。

1.3.4 添加回收試驗 添加水平的選擇依據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》進行，為滿足添加水平應包括最大殘留限量(MRL)值和檢測方法定量限的要求，分別以吡噻菌胺和肟菌酯對應的MRL 值作為吡噻菌胺和PAM 以及肟菌酯和肟菌酸的最高添加水平，以4 種化合物的LOQ 作為最低添加水平。選擇中等添加水平時，采用相對分子質(zhì)量折合的方式計算母體和代謝物各自對應的添加水平。計算公式見式 (1) 。

式中：MRL 為母體的MRL 值。C1和C2分別代表母體和代謝物的添加水平，M1和M2分別代表母體和代謝物的相對分子質(zhì)量。

在空白番茄樣品中添加3 個水平的吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸混合標準工作溶液，每個水平重復5 次?？瞻追褬悠分羞拎缇泛蚉AM的添加水平為0.05、0.7 和2 mg/kg，肟菌酯的添加水平為0.05、0.3 和0.7 mg/kg，肟菌酸的添加水平為0.05、0.4 和0.7 mg/kg，按1.3.1 節(jié)的方法進行樣品前處理和和1.3.2 節(jié)的條件測定，計算添加回收率及相對標準偏差 (RSD) (n= 5) 。定義最低添加水平為方法的定量限 (LOQ，mg/kg) 。以3 倍信噪比對應的基質(zhì)匹配標準溶液濃度定為儀器的檢出限 (LOD，μg/kg) 。

1.3.5 基質(zhì)效應 基質(zhì)效應 (Me) 會導致試驗的準確度下降。本研究中按公式 (2) 計算Me，當Me>0 時為基質(zhì)增強效應，反之為基質(zhì)減弱效應[24]。

式中：Sm為基質(zhì)匹配標準溶液曲線斜率；Ss為溶劑標準溶液曲線斜率。

1.3.6 樣品檢測 按照本研究建立的方法對田間試驗樣品進行檢測分析，明確吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄上的殘留量情況。按公式(3) 計算吡噻菌胺 (吡噻菌胺和PAM 之和) 和肟菌酯 (肟菌酯和肟菌酸之和) 的殘留量。每批檢測樣本均設(shè)置2 個質(zhì)控樣本。番茄樣本中吡噻菌胺和PAM 的添加水平均為0.7 mg/kg，肟菌酯的添加水平為0.3 mg/kg，肟菌酸的添加水平為0.4 mg/kg。質(zhì)控樣品在每批實際樣品之前進行檢測。

式中：X為吡噻菌胺 (吡噻菌胺和PAM 之和)或肟菌酯 (肟菌酯和肟菌酸之和) 的殘留量。X1和X2分別代表吡噻菌胺 (或肟菌酯) 殘留量和PAM(或肟菌酸) 殘留量。M1和M2分別代表吡噻菌胺(或肟菌酯) 的相對分子質(zhì)量和PAM (或肟菌酸) 的相對分子質(zhì)量。當任意一個成分的殘留量小于LOQ 時，采用LOQ數(shù)值計算，若都小于LOQ，則表達為 < 2 × LOQ。

1.4 膳食風險評估

吡噻菌胺和肟菌酯的國家估算每日攝入量(NEDI) 按公式 (4) 計算。

式中：STMRi為目標化合物在番茄和中國已登記其他作物中的規(guī)范殘留試驗中值，mg/kg；對于若沒有殘留試驗中值的登記作物，殘留試驗中值取相應的MRL 值，若中國沒有相應的MRL 值，則取美國或歐盟等制定的MRL 值；Fi為中國一般人群的人均食品消費量，kg。

吡噻菌胺和肟菌酯的膳食攝入風險用NEDI占ADI 的百分率表示，即風險商 (RQ) 表示，按公式 (5) 計算。當RQ < 100%，表明膳食風險處于可接受范圍，反之則表示風險不可接受，且數(shù)值越大風險越高[25]。

式中：ADI 為每日允許攝入量，mg/(kg bw)；bw 為中國消費者的平均體重 (63 kg) 。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法驗證

由于4 種目標化合物較穩(wěn)定，母體和代謝物之間很少甚至不發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，因此在空白番茄樣品中添加3 個水平的吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸混合標準工作溶液，按上述條件分析檢測，添加回收試驗結(jié)果 (表2) 表明：吡噻菌胺在番茄中的平均回收率在89%～97%之間，RSD ≤ 3.7%；PAM 在番茄中的平均回收率在88%～95%之間，RSD ≤ 3.5%；肟菌酯在番茄中的平均回收率在90%～95%之間，RSD ≤ 3.9%；肟菌酸在番茄中的平均回收率在89%～94%之間，RSD ≤ 3.6%。

表2 吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄中的平均添加回收率和相對標準偏差Table 2 The average recoveries and RSDs of penthiopyrad, PAM, trifloxystrobin and trifloxystrobin acid in tomato

基質(zhì)匹配標準曲線的結(jié)果 (表3) 表明：吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在0.005～2 mg/L范圍內(nèi)，番茄基質(zhì)匹配標準溶液的質(zhì)量濃度與其響應值間均呈良好的線性關(guān)系，R2> 0.9992。在上述儀器條件下，吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄基質(zhì)中的定量限均為0.05 mg/kg，檢出限均低于0.105 μg/kg。所建立的檢測方法可滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》的要求，適合用于吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄中殘留的分析研究。

吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄中均表現(xiàn)為基質(zhì)減弱效應 (表3)，為減少基質(zhì)效應對方法準確度的影響，采用基質(zhì)匹配標準曲線定量來消除基質(zhì)效應造成的影響。

表3 吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄中的線性方程、定量限、檢出限及基質(zhì)效應Table 3 Linear equations, LOQ, LOD and matrix effects of penthiopyrad, PAM, trifloxystrobin and trifloxystrobin acid in tomato

每批檢測樣本均設(shè)置兩個質(zhì)控樣本。在0.7 mg/kg 添加水平下，吡噻菌胺在質(zhì)控樣本中的回收率在87%～93%之間， PAM 在質(zhì)控樣本中的回收率在86%～91%之間；在0.3 mg/kg 添加水平下，肟菌酯在質(zhì)控樣本的回收率在84%～94%之間；在0.4 mg/kg 添加水平下，肟菌酸在質(zhì)控樣本中的回收率在88%～94%之間，均可滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》的要求[23]，說明該檢測方法穩(wěn)定可靠，田間試驗樣品檢測的結(jié)果可靠。

2.2 最終殘留量

番茄屬于茄果類蔬菜，中國制定的吡噻菌胺在茄果類蔬菜中的MRL 值為2 mg/kg，肟菌酯在番茄中的MRL 值為0.7 mg/kg[24]。由表4可知：12 個試驗點中，吡噻菌胺和肟菌酯的殘留量均小于中國制定的MRL 值。此外，從表中還可以看出，兩種農(nóng)藥在采收間隔期為7 d 時的最高殘留量均大于采收間隔期為5 d 時的值，這是由于貴州采收間隔期為7 d 的兩份樣品中有1 份樣品的殘留量經(jīng)多次檢測均較高所致。推斷可能是田間試驗人為因素引起的偶然偏差。

表4 吡噻菌胺、肟菌酯、吡噻菌胺 (總量) 和肟菌酯 (總量) 在12 個試驗點番茄樣品中的最終殘留量 (n = 2)Table 4 Terminal residues of penthiopyrad, total penthiopyrad (sum of penthiopyrad and PAM), trifloxystrobin and total trifloxystrobin (sum of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid) in tomato samples from 12 test sites (n = 2)

PAM 和肟菌酸在不同采收間隔期的番茄中的殘留量均小于LOQ (0.05 mg/kg) ，吡噻菌胺、肟菌酯和吡噻菌胺 (總量) 和肟菌酯 (總量) 在番茄中的殘留消解動態(tài)檢測結(jié)果如表5 所示?？梢钥闯?，吡噻菌胺 (總量) 的初始殘留量在0.13～1.1 mg/kg，肟菌酯 (總量) 的初始殘留量在0.12～0.31 mg/kg。番茄中吡噻菌胺 (總量) 和肟菌酯 (總量) 的殘留量基本上隨采收時間的延長而減小，除貴州試驗點外，其余3 個試驗點的殘留量均在采收間隔期為10 d 時下降至小于LOQ。

表5 吡噻菌胺、肟菌酯、吡噻菌胺 (總量) 和肟菌酯(總量)在4 個試驗點番茄樣品中的殘留消解動態(tài) (n = 2)Table 5 Dissipation of penthiopyrad, total penthiopyrad (sum of penthiopyrad and PAM), trifloxystrobin and total trifloxystrobin (sum of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid) in tomato (n = 2)

農(nóng)藥殘留的減少主要受物理或化學因素的影響，也可能與生長稀釋因子、土壤特性、基質(zhì)類型以及其他人為因素引起的偶然偏差有關(guān)。Noh 等對紫蘇葉上吡噻菌胺殘留量的研究表明，末次施藥后7 d 的吡噻菌胺殘留量是0 d 殘留量的44.2%[12]；Wang 等的研究表明，肟菌酯在番茄中的半衰期為2.9 ～ 5.4 d[8]，本研究所得結(jié)果與之相符。

2.3 膳食風險評估

GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定吡噻菌胺的ADI 值為0.1 mg/(kg bw)，肟菌酯的ADI 值為0.04 mg/(kg bw)。目前，吡噻菌胺在中國的登記作物有番茄、黃瓜、葡萄，肟菌酯在水稻、小麥、番茄和辣椒等10 類28 種作物上進行了登記。對于沒有殘留試驗中值的登記作物，按風險最大化的原則取相應的MRL 值代替殘留試驗中值，確保風險評估的可靠性。各類登記作物的膳食量和參考限量見表6。番茄所在的深色蔬菜類作物的STMR 采用推薦的采收間隔期為5 d 的番茄樣品中吡噻菌胺 (總量)和肟菌酯 (總量) 的殘留試驗中值0.10 mg/kg。利用公式 (4) 將NEDI 與每日允許攝入量 (ADI) 進行比較。

表6 吡噻菌胺和肟菌酯的膳食風險評估Table 6 Dietary risk assessment of penthiopyrad and trifloxystrobin

結(jié)果 (表6) 表明：普通人群吡噻菌胺的NEDI為0.1382 mg，風險商RQ 為2.2%；普通人群肟菌酯的NEDI 為0.2645 mg，風險商RQ 為10.5%，其結(jié)果均遠低于100%，說明在推薦的GAP條件下施用30%吡噻菌胺?肟菌酯懸浮劑，對一般人群健康不會產(chǎn)生不可接受的風險。該結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[12,15,18]。

3 結(jié)論

本研究建立了運用QuEChES-HPLC-MS/MS同時檢測番茄中吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸殘留量的方法。該方法在線性度、準確度、精密度和靈敏度上都能滿足(NY/T 788—2018) 《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》 的要求，適用于檢測番茄中吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸的殘留。通過在全國12 個番茄主產(chǎn)區(qū)進行田間規(guī)范殘留試驗，在末次施藥后5 和7 d 采集的番茄樣品中，吡噻菌胺的殘留量均低于0.26 mg/kg，吡噻菌胺和PAM 之和的殘留量均低于0.31 mg/kg，肟菌酯的殘留量均低于0.33 mg/kg，肟菌酯和肟菌酸之和的殘留量均低于0.38 mg/kg。膳食風險評估結(jié)果顯示，吡噻菌胺和肟菌酯在番茄中的膳食風險商分別為2.2%和10.5%，說明對一般人群健康不會產(chǎn)生不可接受的風險。參照以上數(shù)據(jù)，結(jié)合番茄的生長特點和消費習慣，推薦在使用30% 吡噻菌胺 ? 肟菌酯懸浮劑防治番茄灰霉病時，施藥劑量為有效成分270 g/hm2，于番茄灰霉病發(fā)生初期噴霧施藥2 次，施藥間隔7 d，安全間隔期5 d。

本研究建立的吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸殘留同時檢測的方法，豐富了吡噻菌胺和肟菌酯在番茄中的最終殘留量數(shù)據(jù)和膳食風險評估數(shù)據(jù)，為30%吡噻菌胺 ? 肟菌酯懸浮劑在番茄田間的安全使用提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。