虞 淼, 姚 芳, 張 寒, 王 嬌, 齊沛沛, 王新全*,

(1. 浙江省植保檢疫與農(nóng)藥管理總站，杭州 310004；2. 紹興市上虞區(qū)質(zhì)檢計量測試所，浙江 紹興 312300；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室，杭州 310021)

中草藥在我國有著悠久的歷史，延胡索(Rhizoma Corydalis)、白芍 (Radix Paeoniae Alba)、白術(shù) (Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)、杭白菊 (Dendranthema Morifolium)、麥冬 (Radix Ophiopogonis)、玄參 (Radix Scrophulariae)、郁金(Radix Curcumae) 和浙貝母 (Bulbus Fritillariae Thunbergii) 是浙江省最負盛名的八味道地中藥材，稱“浙八味”。近年來，浙八味在傳統(tǒng)醫(yī)藥乃至現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、食品、保健品、化妝品行業(yè)展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。隨著需求量增大，人工種植面積也不斷擴張。在種植過程中，使用殺蟲劑以防止植株被害蟲啃食而影響品質(zhì)和產(chǎn)量[4]，然而，在浙八味上登記的農(nóng)藥品種極其有限，目前僅菊花和白術(shù)上分別有乙酰甲胺磷和二嗪磷登記[5]，這使得植株發(fā)生蟲害時可用藥物少或無，不規(guī)范使用農(nóng)藥情況時有出現(xiàn)[6]，其中有機磷農(nóng)藥毒死蜱和甲胺磷等已被違規(guī)應(yīng)用于浙八味作物上[7]。農(nóng)藥殘留問題不僅關(guān)系到患者的健康，而且關(guān)系到我國名貴藥材出口。因此，為了更有效監(jiān)測浙八味中該類農(nóng)藥殘留情況，建立一種同時適用于浙八味中有機磷農(nóng)藥殘留快速、精準(zhǔn)的檢測方法至關(guān)重要。

浙八味中農(nóng)藥殘留分析的前處理方法主要有固相萃取[8]、中空纖維液相微萃取[9]、基質(zhì)固相分散萃取[10]等。近年來，QuEChERS 方法因其簡單、快速的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)中[11-12]，但目前尚無可以同時檢測8 種基質(zhì)中有機磷農(nóng)藥殘留前處理方法，因此本研究擬針對浙八味基質(zhì)的復(fù)雜性，通過改進QuEChERS 建立一種普適性的前處理方法。由于浙八味中都含有大量的復(fù)雜成分，在萃取過程中往往伴隨著目標(biāo)化合物一同被萃取，使用傳統(tǒng)的QuEChERS 方法不能有效降低這些復(fù)雜成分的干擾，同時也影響目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確分析。因此，如何改進傳統(tǒng)的Qu-EChERS 方法應(yīng)用于浙八味，分散固相萃取 (d-SPE)凈化過程中凈化吸附劑的選擇就變得尤為關(guān)鍵。浙八味中均含有揮發(fā)油成分，他們的有效成分有生物堿[13]、黃酮[14-15]、甾醇[16]、萜類[17]以及有機酸[18]和多糖 (甘露糖和半乳糖)[19]等。針對這些復(fù)雜成分，選取nano-ZrO2對萃取溶液進行凈化。根據(jù)文獻報道，nano-ZrO2可以在高油基質(zhì)中吸附脂肪酸、羧酸、甾醇等雜質(zhì)[20]。ZrO2是兩性氧化物，同時具有酸性和堿性位點，因此可吸附酸性及堿性雜質(zhì)[21]。而nano-ZrO2又具有納米材料比表面積大、吸附容量大等特點。將其應(yīng)用于浙八味中可有效針對不同基質(zhì)中的化學(xué)成分對其酸性或堿性雜質(zhì)進行吸附，達到滿意的除雜效果。此外，由于8 種中藥材中延胡索、玄參、菊花、郁金中均含有明顯的色素成分，查閱文獻得知，介孔分子篩MCM-41 對酸性[22]和堿性[23]染料都有吸附作用，因此本研究嘗試使用MCM-41 結(jié)合nano-ZrO2對基質(zhì)的色素進行去除，探索其對雜質(zhì)的凈化效果。

本研究選取30 種有機磷農(nóng)藥為研究對象，以延胡索為浙八味的代表基質(zhì)，采用檢測速度快而靈敏的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 進行分析，建立了可同時測定30 種有機磷農(nóng)藥 (OPPs)的檢測方法。通過nano-ZrO2和MCM-41 作為凈化吸附劑對樣品凈化，并將建立的方法應(yīng)用于8 種基質(zhì)上驗證其在浙八味中的適用性。

1 材料與方法

1.1 藥劑、試劑、材料與儀器

30 種有機磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購于上海農(nóng)藥研究所或農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；Nexera X2 LC-30AD 超高效液相色譜儀及8050 三重四極桿質(zhì)譜儀購自日本島津公司；Vortex 渦旋儀購自德國IKA 公司；Biofuge primo R 高速離心機購于德國Thermo 公司；Filter Unit 濾膜 (0.22 μm) 購于天津博納艾杰爾科技有限公司。乙腈和甲醇 (色譜級)購于德國Merck 公司；色譜級甲酸銨購于美國Tedia 公司；納米材料二氧化鋯 (nano-ZrO2) 和介孔分子篩 (MCM-41) 購于江蘇先豐納米材料科技有限公司；無水硫酸鎂 (MgSO4) 及氯化鈉 (NaCl)購于天津博納艾杰爾科技有限公司；試驗用水為Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備的超純水 (美國Millipore公司) 。

玄參、延胡索和麥冬粉末購于百姓中藥材市場；白芍、浙貝母、郁金、白術(shù)的根莖樣品購于杭州中藥材市場；杭白菊樣品采自于浙江省桐鄉(xiāng)市。供實際樣品檢測的中藥材均購于杭州中藥材市場；樣品經(jīng)粉碎機高速研磨成粉末狀，避光保存至干燥器中備用。

1.2 檢測條件

色譜條件：ACE Excel C18色譜柱 (100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫35 ℃；流動相為5 mmol/L甲酸銨水溶液 (A) 和甲醇 (B)，梯度洗脫程序：0 min，20% B，12 min 時升至90% B，維持到14 min 后，4 min 內(nèi)降至20 % B，總時間為18 min；流速0.3 mL/min；進樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源正離子 (ESI+)模式；多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)；離子化電壓4000 V；加熱塊溫度400 ℃；有機磷農(nóng)藥的定性定量離子對等信息見表1。

表1 30 種有機磷農(nóng)藥多反應(yīng)監(jiān)測分析參數(shù)Table 1 MRM parameters for residue analysis of 30 OPPs

續(xù)表1Table 1 (Continued)

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取 準(zhǔn)確稱取樣品2 g (±0.05 g)于50 mL 離心管中，加入8 mL 水，渦旋1 min，再加入4 mL 乙腈，渦旋1 min；加入1.5 g NaCl和4.0 g 無水MgSO4，渦旋1 min，于7000 r/min下離心5 min；收集上清液，待凈化。

1.3.2 樣品凈化 準(zhǔn)確移取待凈化液1 mL 于含有30 mg nano-ZrO2、50 mg MCM-41 和150 mg 無水MgSO4的2 mL 離心管中，劇烈振蕩1 min 后，于7000 r/min 下離心5 min；取上清液，過0.22 μm濾膜并定容至2 mL，待測定。

1.4 方法確證

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別稱取一定量的30 種有機磷標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，分別配制成各農(nóng)藥一定濃度 (800～1500 mg/L) 的單標(biāo)儲備液。分別準(zhǔn)確移取一定量的各單標(biāo)儲備液于25 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋，配成質(zhì)量濃度為10 mg/L 的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃保存。用乙腈或經(jīng)提取凈化后的空白提取液稀釋混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配成0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.25 mg/L 的系列溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液或基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，以目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (x)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo) (y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 基質(zhì)效應(yīng) 材料優(yōu)化試驗中，計算基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的比值(Ra)，作為評價基質(zhì)效應(yīng)[11,24]的主要指標(biāo)。若Ra=1，則不存在基質(zhì)效應(yīng)，若Ra< 1，則存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，Ra值越小抑制作用越強；若Ra> 1，則存在基質(zhì)增強效應(yīng)，Ra值越大增強作用越強；在方法確證過程中，通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程斜率比來評價基質(zhì)效應(yīng)[25]。斜率比為1，代表沒有基質(zhì)效應(yīng)；斜率比小于1 表示基質(zhì)抑制效應(yīng)；斜率比大于1 表示基質(zhì)增強效應(yīng)。

1.4.3 添加回收試驗 向空白延胡索基質(zhì)樣品中添加30 種有機磷農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)置0.01、0.05 和0.1 mg/kg 3 個添加水平，每個水平3 次重復(fù)，另設(shè)空白對照。其余7 種浙八味空白樣品中添加30 種有機磷農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)置0.05 mg/kg添加水平，重復(fù)3 次，另設(shè)空白對照。添加后混勻靜置30 min 后進行樣品前處理，按1.2 節(jié)的條件測定，計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化材料的選擇

通過預(yù)試驗表明，用乙腈提取樣品中的有機磷農(nóng)藥，可以確保農(nóng)藥完全從樣品中萃取出來，同時也能降低親脂性物質(zhì)對結(jié)果的影響[26]。4 mL乙腈既能保證萃取效率，又能節(jié)約有機溶劑用量，在建立快速前處理方法的同時又降低了方法的定量限。因此，本試驗將4 mL 乙腈作為該方法的萃取溶劑。

以延胡索作為代表樣品，在0.04 mg/kg 添加水平下，設(shè)置不同梯度的nano-ZrO2用量 (10、20、30、40 和50 mg) 來探究其最佳用量。1 mL乙腈萃取液經(jīng)過不同量nano-ZrO2和150 mg 無水MgSO4的凈化除水后，通過LC-MS/MS 分析。由圖1 可知，nano-ZrO2用量為10 和20 mg 時，多數(shù)農(nóng)藥的回收率偏高，所有農(nóng)藥的回收率在95%～124% 和95%～129% 之間。當(dāng)用量增加到30 mg 時，回收率降到了較好的范圍 (92%～116%，RSDs ≤ 10%) 。而當(dāng)用量繼續(xù)增加時，回收率又呈現(xiàn)上升的趨勢。因此選擇nano-ZrO2用量為30 mg。

圖1 延胡索中30 種有機磷農(nóng)藥在不同nano-ZrO2 用量條件下的回收率(n = 3)Fig. 1 Recoveries of pesticides in Rhizoma Corydalis using different amount of nano-ZrO2 as sorbents (n = 3)

延胡索樣品中含有大量色素，影響對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確定量，而nano-ZrO2對色素的吸附效果不佳，因此選擇有效吸附色素的材料是很有必要的。本研究選擇介孔分子篩MCM-41，探究其對延胡索中色素的去除效果以及對回收率和基質(zhì)效應(yīng)的影響。1 mL 乙腈萃取液經(jīng)不同用量的MCM-41 (0、10、20、30、40 和50 mg)、30 mg nano-ZrO2和150 mg 無水MgSO4凈化除水后，經(jīng)LCMS/MS 分析。結(jié)果 (圖2) 表明：隨著MCM-41 用量增加，樣品顏色逐漸變淺，證明該材料對延胡索中色素有去除效果；使用不同用量的MCM-41 對應(yīng)的回收率范圍分別為87%～129% (0 mg)，80%～122% (10 mg)，83%～122% (20 mg)，81%～125% (30 mg)，88%～117% (40 mg)，89%～113% (50 mg)，由此可知，隨著MCM-41 用量的增加，回收率范圍逐漸縮小，40 mg 和50 mg 均可滿足要求。

圖2 延胡索樣品經(jīng)不同MCM-41 用量和30 mg nano-ZrO2 凈化后顏色的變化Fig. 2 The color change of the Rhizoma Corydalis samples after cleaned-up with different amount of MCM-41 and 30 mg nano-ZrO2

9 種農(nóng)藥 (噠嗪硫磷、敵瘟磷、甲拌磷、馬拉硫磷、馬拉氧磷、三唑磷、殺蟲畏、殺撲磷、亞胺硫磷) 在不同用量的MCM-41 下基質(zhì)效應(yīng)無明顯改善。其余21 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)見圖3，除氧樂果、敵敵畏、丙溴磷外，其余18 種農(nóng)藥隨著MCM-41 用量增加，基質(zhì)抑制作用逐漸減弱。因此本研究選擇MCM-41 最佳用量為50 mg。

圖3 不同用量MCM-41 對部分農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)的影響 (nano-ZrO2 的用量為30 mg)Fig. 3 The effect of different amount of MCM-41(with 30 mg nano-ZrO2) on matrix effects

2.2 方法確證

2.2.1 線性關(guān)系、靈敏度和基質(zhì)效應(yīng) 結(jié)果 (表2)顯示，30 種有機磷中苯腈磷和敵百蟲在0.002～0.25 mg/L 范圍內(nèi)呈線性，敵敵畏在0.005～0.25 mg/L范圍內(nèi)呈線性，其余27 種農(nóng)藥均在0.001～0.25 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以3 倍信噪比所對應(yīng)的化合物質(zhì)量濃度確定為檢出限 (LOD)，則本研究中30 種有機磷農(nóng)藥在延胡索中的LOD 為0.00013～0.0026 mg/L。

各化合物的基質(zhì)效應(yīng)在0.12～0.81 范圍內(nèi) (表2)，說明各分析化合物在延胡索基質(zhì)中呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)。雖然本試驗在優(yōu)化過程中對基質(zhì)效應(yīng)有一定的改善，但仍然對準(zhǔn)確定量帶來影響，建議用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進行定量分析。

表2 延胡索中30 種有機磷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍及檢出限Table 2 The linearity regression equation, correlation coefficients, matrix effects, linear range,and LODs of the 30 OPPs in Rhizoma Corydalis

2.2.2 方法的正確度及精密度 在0.01、0.05 和0.10 mg/kg 添加水平下，各農(nóng)藥的回收率結(jié)果見表3。除敵敵畏在0.010 mg/kg 的添加水平下未檢出外，其余農(nóng)藥的回收率范圍在79%～117%，RSD 小于17%。根據(jù)歐盟文件SANTE/12682/2019 規(guī)定[27]，定量限 (LOD) 為試驗中最低添加水平并且回收率滿足工作需求。本試驗的最低添加水平為0.01 mg/kg，除敵敵畏未檢出外，其余29 種農(nóng)藥的回收率為81%～107%，故方法中這29 種農(nóng)藥的LOQ 為0.010 mg/kg。而敵敵畏在添加水平為0.05 mg/kg 時，回收率為103%，所以敵敵畏在本方法中的LOQ 為0.05 mg/kg。

表3 延胡索中30 種有機磷在不同添加水平下的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)Table 3 Recoveries and RSDs of the 30 OPPs in Rhizoma Corydalis at different spiking levels (n = 3)

2.3 方法適用性驗證

進一步對浙八味中其余7 種中藥材進行方法適用性驗證。采用建立的方法對玄參、白芍、浙貝母、郁金、白術(shù)、麥冬、杭白菊進行添加回收試驗，添加水平設(shè)為0.05 mg/kg，各農(nóng)藥在不同基質(zhì)中的平均回收率及RSD 見表4。結(jié)果表明，倍硫磷在郁金和杭白菊兩種基質(zhì)中未檢出，敵敵畏在玄參、郁金和麥冬中未檢出，氧樂果和乙酰甲胺磷的回收率在64%～71%之間，其余農(nóng)藥在8 種基質(zhì)中的回收率均介于70%～130%之間。分析8 種基質(zhì)空白樣品色譜圖發(fā)現(xiàn) (見附加材料S1)，郁金、麥冬、杭白菊和玄參空白基質(zhì)背景干擾峰較多，致使倍硫磷在郁金和杭白菊基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中無法準(zhǔn)確定量 (見附加材料S2)；敵敵畏在玄參、郁金和杭白菊基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中無法準(zhǔn)確定量 (見附加材料S3)。以上說明浙八味中藥基質(zhì)的不同，對倍硫磷和敵敵畏檢出的影響較大。

表4 白芍、浙貝母、玄參、郁金、白術(shù)、麥冬和杭白菊中30 種有機磷在添加水平為0.05 mg/kg 下的回收率 (n = 3)Table 4 Recoveries of the 30 OPPs in Radix Paeoniae Alba, Bulbus Fritillariae Thunbergii, Radix Scrophulariae, Radix Curcumae, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Radix Ophiopogonis, and Dendranthema Morifolium samples at spiked concentration of 0.05 mg/kg (n = 3)

2.4 實際樣品測定

采用本研究建立的方法對購自市場的30 份中藥材樣品進行檢測，結(jié)果見表5。共有15 個樣品檢出5 種有機磷農(nóng)藥殘留，涉及浙貝母、麥冬和杭白菊3 種中藥材，其中毒死蜱和丙溴磷在麥冬和杭白菊中檢出率較高，辛硫磷在浙貝母中檢出，馬拉硫磷和三唑磷在杭白菊中檢出。其余白芍、玄參、郁金、白術(shù)和延胡索5 種中藥材均未檢出有機磷農(nóng)藥。

表5 實際樣品中農(nóng)藥殘留的測定結(jié)果Table 5 The pesticide residues in real samples

3 結(jié)論

本研究建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定浙八味中30 種有機磷農(nóng)藥殘留的分析方法。本方法通過改良的QuEChERS 前處理技術(shù)，選取兩種吸附材料nano-ZrO2和介孔分子篩MCM-41 組合作為凈化吸附劑，對浙八味延胡索基質(zhì)中雜質(zhì)和色素有一定的去除效果。通過系統(tǒng)的方法驗證表明，除苯腈磷、敵百蟲 (0.002～0.25 mg/L) 和敵敵畏(0.005～0.25 mg/L) 外，其余27 種農(nóng)藥在0.001～0.25 mg/L 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù) (r) 均大于0.99。本方法檢出限 (LOD) 在0.00013～0.0026 mg/L 之間，定量限 (LOQ) 除敵敵畏 (0.050 mg/kg)外，均為0.01 mg/kg。該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足需求，除倍硫磷和敵敵畏外，其余28 種農(nóng)藥在浙八味中均有很好的適用性。此方法為浙八味中有機磷農(nóng)藥殘留分析提供了新的方法依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景，為浙八味的日常監(jiān)控、殘留限量制定及風(fēng)險評估等提供了可靠的分析手段。