周艷杰 張莉莉 楊 柳 王 月 肖哲曼

武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060

偏頭痛是神經(jīng)系統(tǒng)常見的疾病，被世界衛(wèi)生組織列為全球第六大致殘性疾病［1］。最新的全球疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查（GBD 2016）顯示，偏頭痛的傷殘損失健康生命年在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中位列第二［1］。皮質(zhì)擴(kuò)散性抑制（cortical spreading depression，CSD）是一種緩慢傳播（2～5 mm/min）的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的去極化波，以及隨后引起的一段時(shí)間的皮層突觸活動(dòng)抑制。CSD一直被認(rèn)為是偏頭痛的主要病理生理機(jī)制之一，通常與偏頭痛的先兆和偏頭痛發(fā)作期有關(guān)。偏頭痛CSD 發(fā)作引起的惡心、嘔吐、畏光、畏聲等先兆癥狀嚴(yán)重影響患者的工作、生活和學(xué)習(xí)［2］，因此尋找偏頭痛CSD后候選生物標(biāo)志物對(duì)偏頭痛的早期診斷及發(fā)作期治療極為重要。本研究通過提取美國(guó)國(guó)立生物中心的GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)數(shù)據(jù)，通過Deseq2 包以及clusterProfiler 包對(duì)家族性偏癱性偏頭痛1 型（familial hemiplegic migraine type 1，F(xiàn)HM1）小鼠誘發(fā)CSD 后皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，探討偏頭痛先兆及發(fā)作期的潛在機(jī)制［3-4］。此外，利用STRING 平臺(tái)和CytoHubba 插件鑒定出10 個(gè)核心基因，并利用qPCR 對(duì)核心基因進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。通過對(duì)變化最顯著的150個(gè)上調(diào)差異基因和43個(gè)下調(diào)差異基因進(jìn)行CMap 分析，鑒定出了20 種可以逆轉(zhuǎn)偏頭痛差異基因的小分子化合物，為偏頭痛的早期診斷及治療提供了新的潛在藥物靶點(diǎn)［5-6］。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源數(shù)據(jù)來源于GEO 數(shù)據(jù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），以“migraine”作為搜索詞，獲取到一個(gè)偏頭痛小鼠模型數(shù)據(jù)集GSE67933［7］。該數(shù)據(jù)集 基 于Illumina GPL13112 平 臺(tái)，由EISING 等［7］提交。本研究選擇了其中6 個(gè)FHM1 偏頭痛小鼠模型CSD 發(fā)作后的皮質(zhì)樣本和6 個(gè)野生型C57BL/6J 假手術(shù)后24 h的皮質(zhì)樣本，從樣本中分離得到總RNA，再利用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。

1.2 預(yù)處理數(shù)據(jù)與篩選差異表達(dá)基因基于GPL3112平臺(tái)構(gòu)建的信息，將Ensemble gene ID名稱識(shí)別號(hào)轉(zhuǎn)化為正式基因名稱。利用R 軟件中的sva包對(duì)樣本進(jìn)行背景表達(dá)值校正和數(shù)據(jù)歸一化后，剔除掉離群樣本，剩余3個(gè)FHM1偏頭痛小鼠模型CSD發(fā)作后的皮質(zhì)樣本和3個(gè)野生型C57BL/6J假手術(shù)后24 h的皮質(zhì)樣本。再通過Deseq2包分析基因表達(dá)矩陣，采用Benjamini ＆ Hochberg錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率的方法對(duì)P 值進(jìn)行校正，以降低假陽性率［8］。根據(jù)｜logFC｜＞1，Padjust＜0.05 的條件篩選出319 個(gè)差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs），其中包括155個(gè)上調(diào)基因和35個(gè)下調(diào)基因。差異基因的可視化通過R軟件中的Pheatmap包以及ggplot2包實(shí)現(xiàn)。

1.3 差異表達(dá)基因本體論分析和基因集富集分析基因本體論分析（gene ontology，GO）作為一種常用的生物信息學(xué)分析方法，可對(duì)基因產(chǎn)物及其功能特征進(jìn)行注釋，在分子生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。GO分析由生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）組成［9］?；蚣患治觯╣ene set enrichment analysis，GSEA）是一種用來計(jì)算預(yù)定的基因集在2組之間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的、一致性差異的方法，被廣泛用于高通量測(cè)序樣本的生物學(xué)功能分析［10］。本研究中的GO 和GSEA 分析均由R 軟件中的clusterProfiler包實(shí)現(xiàn)［4］。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析DEGs中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析由STRING（The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING，version 11.0）數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建［11］。該數(shù)據(jù)庫(kù)覆蓋了約2 460 萬個(gè)蛋白質(zhì)，可以用來顯示蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而探究蛋白質(zhì)的直接和間接關(guān)聯(lián)。以置信度得分≥0.4 和最小相互作用數(shù)≥1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。核心基因使用Cytoscape 軟件（Cytoscape 3.7.1）的插件Cytohubba進(jìn)行識(shí)別，使用MCC算法，從PPI網(wǎng)絡(luò)中挑選出與周圍基因具有高度連通性前10個(gè)基因作為核心基因［5，12］。

1.5 動(dòng)物及偏頭痛模型的建立成年C57BL/6雄性小鼠（18～20 g）購(gòu)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在無特定病原體（specific pathogen free，SPF）實(shí)驗(yàn)室條件下單獨(dú)飼養(yǎng)，12 h/12 h 光照周期和正常飲食。適應(yīng)1 周后，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=3）和偏頭痛組（n=3）。采用間歇性腹腔注射硝酸甘油（nitroglycerin，NTG）建立偏頭痛小鼠模型，即每隔1天給予偏頭痛組小鼠腹腔注射1次NTG 10 mg/kg，空白對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水，均注射5次。

1.6 小鼠皮層mRNA 表達(dá)檢測(cè)用Trizol 試劑（Invitrogen，USA）從小鼠皮層組織中制備總RNA，并使 用First Strand cDNA Synthesis kit（Servicebio，China）制備cDNA。根據(jù)說明使用SYBR 預(yù)混EX Taq?Ⅱ試劑盒（Servicebio，China）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，并在Bio-Rad CFX Manager 2.1 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）中進(jìn)行。使用采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 rt-PCR引物序列Table 1 rt-PCR primer sequences

1.7 CMap分析Connectivity Map（CMap）（https：//portals.broadinstitute.org/cmap）是一個(gè)含有藥物特異性基因表達(dá)譜的參考數(shù)據(jù)庫(kù)，并將其與疾病特異性基因標(biāo)記進(jìn)行比較，可用于識(shí)別藥物、基因與疾病之間的聯(lián)系，從而確定潛在的治療候選藥物［6］。本研究中以P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，Enrichment 評(píng)分按負(fù)值由高到低排序篩選出前3個(gè)化合物作為逆轉(zhuǎn)DEGs表達(dá)改變的潛在靶點(diǎn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析DEGs的篩選以及GO和GSEA通路富集分析均在R 4.0.3 軟件中執(zhí)行。CMap 分析在CMap 網(wǎng)站中進(jìn)行。rt-PCR 數(shù)據(jù)分析在GraphpadPrism 8.0 進(jìn)行。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±se）描述，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選結(jié)果與野生型假手術(shù)組小鼠相比，F(xiàn)HM1 型小鼠誘發(fā)CSD 24 h 后皮質(zhì)樣本中共篩選出190 個(gè)差異基因，其中上調(diào)差異基因有155 個(gè)，下調(diào)差異基因有35 個(gè)。從篩選出的所有DEGs中挑選出變化最顯著的40 個(gè)差異基因繪制熱圖（圖1），紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因；顏色越深，變化越顯著。

圖1 TOP 40 DEGs基因表達(dá)水平Figure 1 Gene expression levels of TOP 40 DEGs

2.2 DEGs的GO 分析 將篩選到的190 個(gè)差異基因進(jìn)行GO 分析，如圖2 所示，差異基因細(xì)胞組分顯示，主要定位于細(xì)胞質(zhì)、高爾基體、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架以及神經(jīng)元突觸連接等。生物學(xué)過程顯示，主要集中在細(xì)胞通訊、小分子GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、軸突的發(fā)育以及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)等方面。分子功能顯示，主要與轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)活動(dòng)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、酶激活活動(dòng)以及小GTP 酶、Ras GTP 酶、ATP酶、泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶等多種酶的活性有關(guān)。

圖2 FHM1型小鼠誘發(fā)CSD后DEGs的GO分析Figure 2 GO analysis of DEGs after CSD induction in FHM1 mice

2.3 所有檢測(cè)基因的KEGG富集分析運(yùn)用GSEA分析鑒定FHM1 型小鼠誘發(fā)CSD 后和健康對(duì)照組小鼠皮質(zhì)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因組（圖3），結(jié)果顯示，F(xiàn)HM1 型小鼠誘發(fā)CSD 后，基因主要富集在人類巨細(xì)胞病毒感染、EB 病毒感染、卡波西肉瘤病毒感染、朊病毒病等會(huì)引起機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)的通路以及microRNA、細(xì)胞因子信號(hào)通路上，這些通路在FHM1型小鼠CSD誘發(fā)后被激活，現(xiàn)有待測(cè)基因并未富集到被抑制到的通路。

圖3 GSEA富集分析水平Figure 3 GSEA enrichment analysis level

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析將差異基因分析得到的190個(gè)差異基因?qū)雜tring平臺(tái)并分析構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，得到188 個(gè)節(jié)點(diǎn)，199 條關(guān)系。將上述蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入cytoscape 軟件中，如圖4 所示，紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)。點(diǎn)的直徑越大，P值越小。節(jié)點(diǎn)之間的連接顏色越紅，代表兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的相互作用越強(qiáng)；反之，節(jié)點(diǎn)之間的連接顏色越綠，代表兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的相互作用越弱。

圖4 DEGs蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 4 DEGs-protein interaction network

2.5 核心基因識(shí)別CytoHubba中的MCC算法是已被證實(shí)的預(yù)測(cè)重要靶點(diǎn)較為精確的方法。為進(jìn)一步鑒定DEGs 中的核心基因，利用Cytoscape 軟件的CytoHubba 插件，按照MCC 方法計(jì)算并選取前10 個(gè)基因，并把這些基因作為核心基因，顏色越紅，代表評(píng)分越高。

2.6 核心基因的鑒定為驗(yàn)證篩選出的核心基因是否在偏頭痛中增加，構(gòu)建偏頭痛小鼠模型，并提取小鼠皮層的RNA。箱線圖顯示，相對(duì)于對(duì)照組小鼠模型，偏頭痛小鼠模型皮質(zhì)中9個(gè)中樞基因均顯著變化，另外Mrps10 也有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 rt-PCR鑒定核心基因Figure 5 Identification of core genes by rt-PCR

2.7 CMap 分析為尋找潛在的小分子化合物來逆轉(zhuǎn)DEGs 表達(dá)的改變，對(duì)上調(diào)最顯著的前150個(gè)DEGs和所有下調(diào)的35個(gè)DEGs進(jìn)行了CMap分析，篩選出對(duì)逆轉(zhuǎn)偏頭痛CSD發(fā)作最重要的20 種小分子化合物，其中排名靠前的3種小分子化合物：芹菜素、1，4-屈烯醌、非諾特羅。

3 討論

本研究利用已報(bào)道的GEO 芯片數(shù)據(jù)集GSE67933 進(jìn)行分析，并通過提取其中的6只FHM1型小鼠誘發(fā)CSD后和6只健康對(duì)照小鼠皮質(zhì)的高通量測(cè)序樣本進(jìn)行差異基因的分析。去批次和背景歸一化后刪除掉離群樣本，剩余樣本通過R軟件的Deseq2包篩選出了190個(gè)差異基因，其中包括155 個(gè)上調(diào)基因和35 個(gè)下調(diào)基因。對(duì)差異基因進(jìn)行GO 分析顯示，主要定位于細(xì)胞質(zhì)、高爾基體、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架以及神經(jīng)元突觸連接等。

GO 分析的生物學(xué)過程顯示，主要集中在細(xì)胞通訊、小分子GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、軸突的發(fā)育以及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)等方面。分子功能顯示，主要與轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)活動(dòng)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、酶激活活動(dòng)以及小GTP 酶、Ras GTP 酶、ATP酶、泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶等多種酶的活性有關(guān)。GSEA分析表明FHM1型小鼠誘發(fā)CSD后皮質(zhì)DEGs主要富集在一些會(huì)引起機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)的通路以及microRNA、細(xì)胞因子信號(hào)通路上。這些通路在FHM1型小鼠CSD誘發(fā)后被激活，現(xiàn)有待測(cè)基因并未富集到FHM1 型小鼠CSD發(fā)作后被抑制的通路。

通過構(gòu)建DEGs 的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并計(jì)算MCC 評(píng)分得出10 個(gè)與其他節(jié)點(diǎn)作用最多的基因并將這些基因作為核心 基 因，分 別 是Rplp0、Rpl4、Eef1b2、Eif5a、Mrps10、Rpl17、Rpl15、Tsfm、Src、Hsp90ab1。通過 人 類 基 因 數(shù) 據(jù) 庫(kù)GeneCards （https：//www.genecards.org/）對(duì)這10 個(gè)核心基因注釋發(fā)現(xiàn)這些基因主要與RNA 的結(jié)合、核糖體途徑以及蛋白質(zhì)的翻譯過程有關(guān)［13］。其中Hsp90ab1 即熱休克蛋白90 Alpha 家族B 類成員1，通過編碼細(xì)胞溶質(zhì)90 kDa 熱休克蛋白（Hsp90）在多種疾病中發(fā)揮作用，在疼痛領(lǐng)域中已得到廣泛研究。最近的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明抑制脊髓中的Hsp90 后ERK-RSK 通路被激活，進(jìn)而增強(qiáng)了嗎啡的鎮(zhèn)痛作用［14］。一項(xiàng)關(guān)于單關(guān)節(jié)炎大鼠模型的實(shí)驗(yàn)表明，Hsp90 抑制劑可在最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)減輕MA引起的機(jī)械性異常性疼痛［15］，表明Hsp90ab1有可能與偏頭痛的痛覺敏化有關(guān)。Src編碼酪氨酸蛋白激酶，與神經(jīng)病理性疼痛、慢性疼痛、癌痛多種疼痛反應(yīng)有關(guān)［16-18］。許多研究表明，酪氨酸蛋白激酶的激活或磷酸化在疼痛超敏反應(yīng)中起重要作用［19］。Rplp0、Rp14、Rpl17和Rpl15主要參與核糖體結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)合成。Eefib2編碼一種翻譯延伸因子，稱為真核翻譯延伸因子1beta2，參與將氨?；痶RNA 轉(zhuǎn)移到核糖體。Mrps10編碼哺乳動(dòng)物線粒體核糖體蛋白的核基因，有助于線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，與C 反應(yīng)蛋白、中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞等多種炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究用偏頭痛小鼠模型對(duì)Mrps10驗(yàn)證未得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，可能是樣本量較小的原因。Eif5a 參與翻譯延伸的mRNA 結(jié)合蛋白，在mRNA 更新水平上具有重要功能，參與肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞周期進(jìn)程，并可能參與應(yīng)激反應(yīng)和維持細(xì)胞壁完整性的途徑，其與合成蛋白Sdcbp 一起，作為p53/TP53 和p53/TP53 依賴性細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑起作用，還調(diào)節(jié)TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)多胺對(duì)神經(jīng)元過程延伸和存活的影響，可能在大腦發(fā)育和功能以及骨骼肌干細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。Tsfm編碼線粒體翻譯延伸因子，在線粒體蛋白翻譯的延伸步驟中，催化翻譯延伸因子Tu 上鳥嘌呤核苷酸的交換，研究表明Tsfm基因突變會(huì)引起多動(dòng)癥、腦心肌病、兒童共濟(jì)失調(diào)以及舞蹈病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病［20］。結(jié)合GO 和GSEA分析可以推斷偏頭痛CSD發(fā)作后關(guān)鍵基因的上調(diào)引起下游免疫細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，激活了炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步在偏頭痛疼痛反應(yīng)的啟動(dòng)、維持和延伸中發(fā)揮作用。

為進(jìn)一步探究與偏頭痛CSD發(fā)作有關(guān)的偏頭痛先兆以及急性偏頭痛的潛在治療方案，進(jìn)行CMap分析，通過對(duì)變化最顯著的前5個(gè)上調(diào)DEGs和35個(gè)下調(diào)DEGs 進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到最有可能逆轉(zhuǎn)偏頭痛CSD 3 種小分子化合物是芹菜素、1,4-屈烯醌、非諾特羅。

芹菜素是一種黃酮類物質(zhì)，具有抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、鎮(zhèn)靜、改善睡眠等作用［21］，目前主要運(yùn)用于預(yù)防高血壓、動(dòng)脈硬化、心腦血管疾病等方面。最近許多研究表明芹菜素對(duì)偏頭痛有一定的鎮(zhèn)痛作用［22］。一項(xiàng)關(guān)于偏頭痛的植物療法研究顯示，使用以芹菜素為主要成分的洋甘菊油凝膠30 min 后，患者的疼痛、惡心、嘔吐、畏光和畏聲等現(xiàn)象顯著降低，表明芹菜素對(duì)偏頭痛有一定的治療功效［22］。另一項(xiàng)研究表明，芹菜素主要通過以下機(jī)制緩解偏頭痛：（1）抑制活化巨噬細(xì)胞中iNOS 的表達(dá)，導(dǎo)致NO 釋放和合成受阻。NO 在刺激中樞敏化方面具有重要作用，其合成的阻斷或減少可以幫助治療偏頭痛發(fā)作和疼痛。（2）選擇性抑制內(nèi)源性前列腺素E2（PGE2）水平，阻斷中樞神經(jīng)元和外周腦膜傷害性感受器的致敏作用。（3）具有與皮質(zhì)類固醇（如氫化可的松）一樣強(qiáng)的抗炎作用，通過緩解作用部位的炎癥減輕偏頭痛［23］。

1,4-屈烯醌（1,4-CQ）是芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）的激活劑。AhR是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，具有許多生理功能，包括調(diào)節(jié)胃腸道和調(diào)節(jié)腸腦軸。許多研究表明AhR 的活化與偏頭痛的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［24］。最近一項(xiàng)關(guān)于偏頭痛和功能性胃腸疾病中色氨酸代謝的研究表明，偏頭痛中存在犬尿氨酸途徑代謝的變化，而犬尿氨酸途徑的產(chǎn)物是AhR 的重要配體，犬尿氨酸類似物可競(jìng)爭(zhēng)性拮抗NMDA受體，減少偏頭痛中神經(jīng)元的過度活躍，從而消除硝酸甘油誘導(dǎo)的痛覺過敏［25］。此外，AhR 還可通過介導(dǎo)毒素反應(yīng)調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫，而偏頭痛的發(fā)病機(jī)制一直被認(rèn)為與免疫炎癥有關(guān)［26］，表明1,4-屈烯醌有望成為偏頭痛治療的候選藥物靶點(diǎn)之一。

非諾特羅是一種選擇性β2受體激動(dòng)劑，屬間羥異丙腎上腺素的衍生物，臨床上主要用于支氣管哮喘的治療。目前有研究發(fā)現(xiàn)非諾特羅等β2-腎上腺素能受體（β2-AR）能在很大程度上緩解神經(jīng)病理性疼痛小鼠模型的疼痛反應(yīng)［27］，認(rèn)為β2-腎上腺素能受體刺激物可作為潛在的神經(jīng)性疼痛的新療法。由此可以推測(cè)非諾特羅或許在偏頭痛中也有一定的治療效果。

本研究通過生物信息學(xué)分析確定了10個(gè)FHM1型小鼠CSD發(fā)作后的10個(gè)核心基因以及偏頭痛CSD發(fā)作的潛在機(jī)制，并預(yù)測(cè)了可用來逆轉(zhuǎn)DEGs 的20種小分子化合物，但仍需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證核心基因和深入的致病機(jī)制。本研究可為與CSD發(fā)作有關(guān)的先兆偏頭痛及急性偏頭痛的機(jī)制和治療提供潛在的靶點(diǎn)。