楊鳳姣 李翔 劉紅佶 萬婧雯 易文華

青光眼是以持續(xù)性RGCs丟失、視神經(jīng)軸突變性及特征性視野缺損縮小為特征的一組致盲性視神經(jīng)病變，是世界第一位不可逆性致盲眼病，發(fā)病率和致盲率不斷上升。預(yù)計(jì)2040年將達(dá)1億1180萬[1]。目前針對(duì)青光眼的治療主要是降眼壓藥物和保護(hù)視神經(jīng)，降低眼壓仍然是治療青光眼的最有效手段。但單純控制眼壓并不能完全阻止RGCs的凋亡，這表明除病理性眼壓升高的主要危險(xiǎn)因素外，還存在其他損害機(jī)制[2]。我們前期實(shí)驗(yàn)及臨床研究均證實(shí)補(bǔ)精益視片可保護(hù)青光眼視功能[3-10]，但對(duì)RGCs保護(hù)作用機(jī)制研究不夠深入，治療靶點(diǎn)欠明確。沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1(sirtuintypel，SIRT1)是一種細(xì)胞代謝輔酶NAD依賴的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，是Sirtuin家族中被研究最深入的一員，SIRT1在眼部角膜、虹膜、葡萄膜、睫狀體、晶狀體、視網(wǎng)膜等組織中均有表達(dá)[11-14]，在葡萄膜炎、白內(nèi)障、視神經(jīng)病變以及視網(wǎng)膜退行性疾病發(fā)揮作用，尤其對(duì)視網(wǎng)膜及視神經(jīng)退行性變化有保護(hù)作用[15-16]，近年發(fā)現(xiàn)促進(jìn)SIRT1活性對(duì)青光眼RGCs凋亡有一定保護(hù)作用，促進(jìn)SIRT1活性可能成為青光眼新型藥物治療靶點(diǎn)[17-20]，但尚無中藥干預(yù)的研究。故本課題通過觀察補(bǔ)精益視片對(duì)自發(fā)性青光眼模型DBA/2J小鼠RGCs的SIRT1活性及RGCs凋亡的干預(yù)及影響,為進(jìn)一步尋找補(bǔ)精益視片保護(hù)青光眼視功能的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1模型動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)分組與治療藥物 模型動(dòng)物購(gòu)置：DBA/2J青光眼模型基因小鼠、對(duì)照組C57BL/6J小鼠，均購(gòu)于上海斯萊克有限責(zé)任公司，動(dòng)物批號(hào)：19082808451783CF。該試驗(yàn)已通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，倫理批件G2020001。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組6只(C57BL/6J小鼠)、模型組6只(DBA/2J小鼠)、給藥組每組各6只(DBA/2J小鼠補(bǔ)精益視片高、中、低劑量組)。治療藥物：補(bǔ)精益視片為成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，規(guī)格：100片/瓶，每片重0.3g，川藥制字Z20070649。

1.2主要試劑及儀器 Neurobasal/B27培養(yǎng)基購(gòu)自Life公司，CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio公司，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁公司，中強(qiáng)度RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒及ECL發(fā)光液均購(gòu)自弗德生物公司，SDS購(gòu)自Acmec公司，SIRT1抗體購(gòu)自Abcam公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱、臺(tái)式高速離心機(jī)均購(gòu)自Thermo Fisher公司，生物倒置顯微鏡購(gòu)自Nikon公司，脫色搖床購(gòu)自其林貝爾儀器公司，電泳儀購(gòu)自Bioneer公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司，熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自東華電子公司。

1.3給藥方法 對(duì)照組、模型組生理鹽水2mL灌胃，給藥組各組每天灌胃補(bǔ)精益視片混懸液2mL，低劑量組0.45g/kg、中劑量組0.9g/kg、高劑量組1.8g/kg，每天同一時(shí)間段(2:00pm～5:00pm)測(cè)眼壓后灌胃1次，連續(xù)灌胃8周。

1.4取樣 藥物處理小鼠8周后取眼球：5組，每組6只小鼠，各組小鼠分別在喂養(yǎng)8周后摘除眼球并固定，處死動(dòng)物，取眼球樣本(左眼和右眼)，共計(jì)60個(gè)樣本，并妥善保存。其中30個(gè)眼球組織樣本(左眼)用多聚甲醛固定，用于HE染色病理實(shí)驗(yàn)；另外30個(gè)眼球樣本(右眼)，制備視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞懸液，-80℃保存，用于Q-PCR、Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)、CCK-8實(shí)驗(yàn)。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及技術(shù)

1.5.1Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組RGCs凋亡率 ①用PBS洗滌孔內(nèi)細(xì)胞三次，加入不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞；②室溫，2000 rpm離心5min，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞兩次；③在50μL的Binding Buffer中加入5μL PI染液，混勻；④在收集的細(xì)胞沉淀中加入上述PI染液，混勻，室溫避光反應(yīng)15min；⑤反應(yīng)后加入450μL的Binding Buffer混勻；⑥加入1μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；⑦用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm，Annexin V-FITC熒光信號(hào)呈綠色，使用FL1通道檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em≥630 nm，PI紅色熒光用FL3通道檢測(cè)于48h時(shí)間點(diǎn)收集各組細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，得到四個(gè)象限內(nèi)細(xì)胞百分比，計(jì)算右上和右下象限內(nèi)細(xì)胞百分比和，每組重復(fù)3次，最后取平均值，得出細(xì)胞凋亡率。

1.5.2CCK-8檢測(cè)各組RGCs存活 提取的各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞懸液，以5×104/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板內(nèi)，每孔加入液體100μL，37℃孵箱培養(yǎng)24 h后，以含3%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，每孔加10μL CCK-8試劑，酶標(biāo)儀測(cè)光度值、吸光度值計(jì)算各組細(xì)胞間的存活率。

1.5.3Q-PCR檢測(cè)各組RGCs的SIRT1 mRNA表達(dá) 先提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液，加入1μL oligo(dT)15，用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μL，于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻，依次加入4μL 5×buffer，2μL 10mM dNTPs，1μL RNA inhibitor和1μL 反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻，于PCR儀上42℃保溫30min，結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，其次定量PCR反應(yīng)，循環(huán)結(jié)束后從55℃升高到95℃獲取熔解曲線，進(jìn)行結(jié)果分析：ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測(cè)樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本)，B=CT(目的基因，對(duì)照樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本)，K=A-B，表達(dá)倍數(shù)=2-K。

1.5.4Western Blot檢測(cè)各組RGCs的SIRT1蛋白表達(dá) 提取蛋白并測(cè)量蛋白濃度，進(jìn)行樣品蛋白處理：將待測(cè)樣本分別與5×SDS上樣緩沖液按4∶1比例混合，置于沸水中加熱5min，立即置于冰上3min；上樣，電泳：將玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，按實(shí)驗(yàn)安排配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，約45min后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干， 配制5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中，加足夠的電泳液后上樣電泳，濃縮膠電壓75V，分離膠用120V，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件：200mA，1小時(shí)；封閉，顯影；進(jìn)行圖像分析：以β-actin作為內(nèi)參，以目的條帶與內(nèi)參條帶的比值代表各組目的蛋白的表達(dá)水平，每個(gè)目的條帶Western blot重復(fù)3次。

2 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1眼壓 實(shí)驗(yàn)前、后模型組與對(duì)照組相比均高(P<0.05)，模型組實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高、中、低劑量給藥組實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前相比均明顯降低(P<0.01)，與模型組比較降低(P<0.05)，說明補(bǔ)精益視片有降低眼壓的作用(表1)。

表1 各組小鼠實(shí)驗(yàn)前后眼壓情況每組n=6)

3.2補(bǔ)精益視片對(duì)體外培養(yǎng)小鼠RGCs中的SIRT1mRNA表達(dá)的影響 結(jié)果表明：模型組與對(duì)照組相比降低(P<0.05)，高、中、低劑量給藥組與模型組相比均升高(P<0.05)、高劑量組最高，說明模型組RGCs SIRT1 mRNA表達(dá)明顯降低，補(bǔ)精益視片能提高RGCs的SIRT1 mRNA表達(dá)量，且與劑量呈正相關(guān)(圖1-2、表2)。

表2 各組體外培養(yǎng)小鼠RGCs的SIRT1 mRNA表達(dá)情況每組n=6)

圖1 SIRT1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(A:Melt Curve B:Amplification Plot)

3.3補(bǔ)精益視片對(duì)體外培養(yǎng)小鼠RGCs中的SIRT1蛋白表達(dá)的影響 Weston blot蛋白印跡法結(jié)果顯示：模型組RGCs的 SIRT1蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比降低(P<0.05)，高、中、低劑量給藥組與模型組相比均升高(P<0.05)，高劑量組最高(P<0.05)，說明模型組RGCs的SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低，補(bǔ)精益視片能提高RGCs的SIRT1 mRNA表達(dá)量，且與劑量呈正相關(guān)(圖3-4、表3)。

表3 各組體外培養(yǎng)小鼠RGCs中的SIRT1蛋白表達(dá)每組n=6)

圖3 各組體外培養(yǎng)小鼠RGCs中的SIRT1蛋白表達(dá)

3.4補(bǔ)精益視片對(duì)體外培養(yǎng)小鼠RGCs凋亡的影響 AnnexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明：模型組凋亡率較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，高、中、低劑量給藥組凋亡率均低于模型組(P<0.05)，高劑量組最低，表明補(bǔ)精益視片對(duì)細(xì)胞凋亡起到了抑制作用，且與劑量呈正相關(guān)(表4、圖5)。

圖5 補(bǔ)精益視片對(duì)體外培養(yǎng)小鼠RGCs凋亡的影響

表4 補(bǔ)精益視片對(duì)體外培養(yǎng)小鼠RGCs凋亡率的影響每組n=6)

3.5補(bǔ)精益視片對(duì)體外培養(yǎng)小鼠RGCs存活的影響 CCK-8法檢測(cè)各組RGCs存活結(jié)果表明：RGCs經(jīng)24h、48h、72h培養(yǎng)后細(xì)胞RGCs生存率(OD值)，模型組與對(duì)照組相比均降低(P<0.05)，高、中、低劑量給藥組均高于模型組(P<0.05)，高劑量組最高，表明模型組RGCs存活率明顯降低，而補(bǔ)精益視片對(duì)RGCs存活有促進(jìn)作用，且與劑量呈正相關(guān)(表5，圖6)。

圖6 各組體外培養(yǎng)小鼠RGCs細(xì)胞增殖情況

表5 各組體外培養(yǎng)小鼠RGCs細(xì)胞增殖情況每組n=6)

*P<0.05 vs 對(duì)照組，#P<0.05 vs 模型組

圖2 各組體外培養(yǎng)小鼠RGCs的SIRT1 mRNA表達(dá)情況

圖4 各組體外培養(yǎng)小鼠RGCs中的SIRT1蛋白表達(dá)

4 討論

自發(fā)性青光眼小鼠DBA/2J模型能更好地模擬臨床青光眼發(fā)病特點(diǎn)，也更適于表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究，2～3月齡DBA/2J小鼠虹膜眼壓視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的組織結(jié)構(gòu)均正常，6月齡開始出現(xiàn)眼壓升高和明顯的虹膜異常，8～9月齡開始出現(xiàn)RGCs和視神經(jīng)的變性到18個(gè)月，且雌性發(fā)病早，進(jìn)展快，眼壓更高，視神經(jīng)損害較重，故本研究選擇10月齡雌性DBA/2J小鼠為研究對(duì)象[21-23]，而C57BL/6J小鼠被廣泛用于DBA/2J小鼠正常對(duì)照實(shí)驗(yàn)，故以C57BL/6J小鼠為對(duì)照組[24-25]。

組蛋白乙?；揎椬鳛楸碛^遺傳學(xué)重要機(jī)制之一，在細(xì)胞分化和凋亡中發(fā)揮重要作用，已廣泛應(yīng)用于心血管疾病、腫瘤及退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病的研究[26-28]，其中SIRT1是調(diào)控衰老、神經(jīng)功能、細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[29]。研究證實(shí)SIRT1表達(dá)活性的下調(diào)可能是青光眼發(fā)病因素之一、SIRT1與青光眼小梁網(wǎng)細(xì)胞 (GTM)DNA雙鏈損傷修復(fù)能力與細(xì)胞衰老有關(guān)[30]，有學(xué)者對(duì)RGC-5研究發(fā)現(xiàn)SIRT1上調(diào)能減弱RGC-5凋亡[31]，通過研究大鼠視神經(jīng)損傷模型也發(fā)現(xiàn)SIRT1參與視神經(jīng)損傷及修復(fù)過程[32]，促進(jìn)SIRT1活性可能成為青光眼新型藥物治療靶點(diǎn)[33]。補(bǔ)精益視片(枸杞子、菟絲子、五味子、丹參、三七、茺蔚子、楮實(shí)子、車前子、青皮、木瓜)為中醫(yī)眼科名家陳達(dá)夫教授經(jīng)驗(yàn)制成的成都中醫(yī)院大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，廣泛用于肝腎虛損、脈絡(luò)瘀滯所致的眼目昏花、視神經(jīng)視網(wǎng)膜功能減退等癥，備受醫(yī)患青睞[34]，其滋養(yǎng)肝腎、活血通絡(luò)的功效，切合青光眼視神經(jīng)病變“肝腎虛損、脈絡(luò)瘀滯”的主要病機(jī)[35]，我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)精益視片對(duì)SD大鼠青光眼視功能損害從RGCs、視神經(jīng)至視中樞均具有確切保護(hù)作用[4-10]。臨床也證實(shí)補(bǔ)精益視片治療眼壓控制后青光眼療效確切，可不同程度改善患者中醫(yī)癥狀，提高視力、視覺敏感度，有效控制視野缺損，從而保護(hù)青光眼患者視功能[3-4]。

本研究基于SIRT1觀察補(bǔ)精益視片對(duì)自發(fā)性青光眼模型DBA/2J小鼠RGCs凋亡的干預(yù)及影響，眼壓結(jié)果提示高、中、低劑量給藥組實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前相比、與模型組相比，眼壓值均明顯降低，說明補(bǔ)精益視片能降低眼壓；通過Q-PCR檢測(cè)SIRT1 mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)模型組RGCs中的SIRT1 mRNA表達(dá)低于對(duì)照組；高、中、低劑量給藥組SIRT1 mRNA表達(dá)均升高，尤以高劑量組表達(dá)最高，說明補(bǔ)精益視片能增加小鼠RGCs的SIRT1 mRNA表達(dá)；通過Western Blot檢測(cè)RGCs的SIRT1蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)模型組低于對(duì)照組，高、中、低劑量給藥組均高于模型組，高劑量組表達(dá)量最多，說明補(bǔ)精益視片能促進(jìn)小鼠RGCs的SIRT1蛋白表達(dá)，以上表明補(bǔ)精益視片上調(diào)SIRT1的表達(dá)作用可能類于SIRT1“激動(dòng)劑”；另外，Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組RGCs凋亡率發(fā)現(xiàn)，模型組高于對(duì)照組，高、中、低劑量給藥組均低于模型組，高劑量組最低，CCK-8檢測(cè)各組RGCs生存結(jié)果表明：模型組低于對(duì)照組，高、中、低劑量給藥組均高于模型組，高劑量組最高，進(jìn)一步證實(shí)了補(bǔ)精益視片抑制小鼠RGCs凋亡，促進(jìn)小鼠RGCs細(xì)胞存活作用。

綜上所述，補(bǔ)精益視片既可上調(diào)SIRT1組蛋白去乙?；?，促進(jìn)RGCs存活、抑制RGCs調(diào)亡、增加RGCs的SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)，且均與劑量呈正相關(guān)，又能降眼壓，表明補(bǔ)精益視片可通過降低眼壓、上調(diào)SIRT1組蛋白去乙酰化酶、抑制RGCs凋亡、促進(jìn)RGCs生存而實(shí)現(xiàn)保護(hù)青光眼視功能的作用，推測(cè)其治療靶點(diǎn)可能為促進(jìn)SIRT1活性，為將補(bǔ)精益視片開發(fā)成青光眼視功能損害保護(hù)新藥奠定科學(xué)基礎(chǔ)，惠及更多青光眼患者。