楊延紅，宋桂全，李孔棟，姜倩倩，李光耀，孟迎迎

(濰坊學(xué)院 山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261000)

花粉是高等植物雄性器官，在雙受精過(guò)程中起著傳遞父本基因的作用，了解植物小孢子發(fā)育的胚胎學(xué)進(jìn)程對(duì)于品種改良、新品種繁育意義重大。目前雜交育種中獲得單倍體植株的最佳方法為小孢子培養(yǎng)技術(shù)，但不是所有發(fā)育時(shí)期的小孢子均可培養(yǎng)成功，如在黃瓜[1]、蕪菁[2]等多數(shù)植物中僅單核靠邊期的小孢子可培養(yǎng)成功，從而獲得所需特性的純種個(gè)體，減少繁殖周期和加速繁育過(guò)程。因此研究不同植物小孢子發(fā)育時(shí)期是成功培養(yǎng)小孢子的前提。

雜交育種中花粉活力的高低與育種成功率密切相關(guān)，需選擇花粉活力高的品種作為父本，授粉后才可得到較多的雜交種子。目前檢測(cè)花粉活力最準(zhǔn)確的方法是花粉離體萌發(fā)，通過(guò)選擇合適的培養(yǎng)基將花粉體外萌發(fā)，找出活力高的品種作為父本，以提高雜交植物的受精率。適宜的培養(yǎng)基組分可促進(jìn)花粉更好地體外萌發(fā)。蔗糖作為花粉培養(yǎng)基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，起調(diào)節(jié)滲透壓和提供能源作用[3]。蔗糖含量太低會(huì)導(dǎo)致供能不足，且因影響滲透壓會(huì)使花粉破裂；蔗糖含量過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基水勢(shì)下降，致使花粉失水無(wú)法萌發(fā)。硼可促進(jìn)花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)，提高受精率[4-5]，缺硼時(shí)植物雌雄蕊形成受到影響，一般表現(xiàn)為開花而不孕。鈣離子是組成細(xì)胞壁果膠質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分[6]，在多種植物中均發(fā)現(xiàn)鈣可促進(jìn)花粉萌發(fā)，培養(yǎng)基中無(wú)鈣或低鈣都可能出現(xiàn)花粉管頂管膨大及破裂[7-9]。

郁金香(Tulipagesneriana)是百合科郁金香屬植物，世界著名球根花卉，花開時(shí)顏色繽紛，植株挺拔，具有極高的觀賞價(jià)值，為園林綠化中重要的觀賞花卉[10]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)美景的需求日益增多，郁金香產(chǎn)業(yè)也得到快速發(fā)展，但我國(guó)優(yōu)良的郁金香品種多從荷蘭引進(jìn)，國(guó)內(nèi)對(duì)郁金香研究主要集中在品種引進(jìn)和栽培上[11-13]，而對(duì)郁金香小孢子發(fā)育及花粉萌發(fā)等生殖方面的研究較少。本試驗(yàn)觀察了郁金香小孢子發(fā)育過(guò)程，探討了郁金香花粉培養(yǎng)的最適條件，以期為郁金香小孢子培養(yǎng)的時(shí)期選擇及雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

阿帕爾頓(Tulipagesneriana‘Apeldoorn’)郁金香種球，由濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，低溫處理30 d后備用。

1.2 郁金香小孢子發(fā)育過(guò)程觀察

將郁金香種球經(jīng)體積分?jǐn)?shù)0.05%的高錳酸鉀溶液消毒處理后，剝出種球內(nèi)大小不同的花芽，用鑷子摘掉花瓣，取出花藥置于載玻片上用鑷子擠壓，釋放出不同時(shí)期的花粉細(xì)胞后，滴1滴4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液，蓋上蓋玻片，制成臨時(shí)裝片，于奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察、拍照。照片拍攝均為同一視野，一張為明場(chǎng)照片，另一張為暗場(chǎng)DAPI染色的熒光照片。

1.3 郁金香花粉離體培養(yǎng)

將郁金香種球定植于直徑20 cm花盆內(nèi)，在室溫20 ℃、陽(yáng)光充足的溫室中培養(yǎng)，常規(guī)管理，8周后開花，于晴天上午10:00-10:30取新鮮花粉用于離體培養(yǎng)。

依據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，郁金香花粉在含有單一成分蔗糖、硼酸或鈣的培養(yǎng)基中基本不萌發(fā)，因此本試驗(yàn)以200 mg/L硫酸鎂+200 mg/L磷酸二氫鉀為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(調(diào)培養(yǎng)基pH始終在5.6～6.0)，改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖(0，50，100，150，200，250 g/L)、硼酸(0，60，80，100，120，140 mg/L)、氯化鈣(0，100，300，500，700，900 mg/L)劑量水平，于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1，3，5，7 h取花粉，在倒置顯微鏡下鏡檢、拍照，并統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)數(shù)量，計(jì)算花粉萌發(fā)率，篩選郁金香花粉適宜培養(yǎng)基。萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為花粉管長(zhǎng)度大于萌發(fā)孔的直徑?；ǚ酃荛L(zhǎng)度用測(cè)微尺測(cè)量，取平均值。

在以上篩選的最佳培養(yǎng)基組分下培養(yǎng)花粉1，3，5和7 h，篩選郁金香花粉離體萌發(fā)的最佳時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003和 SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 郁金香小孢子的發(fā)育時(shí)期及細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征

2.1.1 四分體時(shí)期 郁金香小孢子母細(xì)胞完成整個(gè)減Ⅰ和減Ⅱ過(guò)程后產(chǎn)生4個(gè)子代細(xì)胞，稱為四分體(圖1-A,B)。4個(gè)子代細(xì)胞外圍存在一個(gè)胼胝質(zhì)壁，且各個(gè)細(xì)胞也有胼胝質(zhì)分隔，使小孢子處于完全獨(dú)立的空間中。染色后，核區(qū)域藍(lán)色熒光明顯(圖2-A,B)。其中多數(shù)為四面體型(圖1-A,圖2-A)，少數(shù)為左右對(duì)稱型(圖1-B,圖2-B)。

2.1.2 單核早中期 在完成整個(gè)減Ⅰ和減Ⅱ過(guò)程后，郁金香花粉壁的絨氈層開始產(chǎn)生酶，將四分體外側(cè)的胼胝質(zhì)壁破壞，單個(gè)細(xì)胞逐漸從四分體中解離，此時(shí)小孢子外壁較薄，細(xì)胞內(nèi)積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少(圖1-C,D)；然后絨氈層開始退化，隨著發(fā)育小孢子細(xì)胞質(zhì)變得更加濃厚，花粉外壁變厚，而細(xì)胞核則明顯變大，在細(xì)胞中央，稱為單核早中期(圖2-C,D)。

2.1.3 單核靠邊期 隨著郁金香小孢子的不斷成熟，花粉將持續(xù)從絨氈層中汲取養(yǎng)料和能量，體積不斷增大，最明顯的特征是液泡逐漸變大，形成了中央大液泡。液泡在逐漸變大的過(guò)程中將小孢子細(xì)胞核從中央位置向外圍擠壓，最終細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣靠近壁的位置(圖2-E)，此時(shí)花粉外壁已發(fā)育完全，壁明顯增厚(圖1-E,圖2-E)，細(xì)胞核位于邊緣，故稱為單核靠邊期。

2.1.4 二胞花粉時(shí)期 郁金香小孢子繼續(xù)生長(zhǎng)，開始一次有絲分裂，產(chǎn)生兩個(gè)細(xì)胞核，其中一個(gè)細(xì)胞核形態(tài)較大，呈半月形貼近大液泡，稱為生殖核；另一個(gè)較圓的細(xì)胞核為營(yíng)養(yǎng)核，故稱該時(shí)期為二胞花粉時(shí)期。隨后，生殖核由梭形(圖1-F,圖2-F)逐漸轉(zhuǎn)變成橢圓形(圖1-G,圖2-G)，成為成熟花粉粒，這一時(shí)期花粉粒內(nèi)容物逐漸增多、顏色較深，且細(xì)胞壁增厚。

2.1.5 發(fā)育時(shí)期不同步和其他異常現(xiàn)象 在觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)視野內(nèi)存在不同發(fā)育時(shí)期的小孢子。為了探究這一現(xiàn)象，進(jìn)行多次取樣觀察發(fā)現(xiàn)，這不是偶然現(xiàn)象，在一個(gè)花藥制片中可能同時(shí)存在二胞花粉和單核花粉，且單核花粉體積明顯小于二胞花粉(圖1-H,圖2-H)。因此，郁金香花粉發(fā)育是不同步的。郁金香花粉中2個(gè)二胞花粉緊緊粘連在一起，粘連花粉常在某一朵花的花藥中。觀察發(fā)現(xiàn)粘連花粉均具有正常的營(yíng)養(yǎng)核和生殖核(圖2-I)，但花粉內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)顏色較淡，積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)明顯少于正常花粉(圖1-I)。

2.2 郁金香花粉的離體培養(yǎng)條件

2.2.1 蔗糖對(duì)郁金香花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響 如圖3-A所示，郁金香花粉萌發(fā)數(shù)量與蔗糖質(zhì)量濃度密切相關(guān)。不添加蔗糖時(shí)，郁金香花粉基本不萌發(fā)；蔗糖質(zhì)量濃度為150 g/L時(shí)，郁金香花粉萌發(fā)率高達(dá)39.98%；蔗糖質(zhì)量濃度為250 g/L時(shí)，郁金香花粉萌發(fā)數(shù)量明顯減少，多數(shù)花粉失水無(wú)法萌發(fā)。蔗糖還影響花粉管生長(zhǎng)，其質(zhì)量濃度低于或高于150 g/L時(shí)，花粉管生長(zhǎng)均明顯變慢。綜上，郁金香花粉萌發(fā)及生長(zhǎng)的適宜蔗糖質(zhì)量濃度為150 g/L。

2.2.2 硼酸對(duì)郁金香花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響 由圖3-B可知，郁金香花粉萌發(fā)數(shù)量隨硼酸質(zhì)量濃度的升高先增后減。不添加硼酸時(shí)，郁金香花粉基本不萌發(fā)；添加100 mg/L硼酸時(shí)，郁金香花粉萌發(fā)率為67.45%；添加140 mg/L硼酸時(shí)，郁金香花粉萌發(fā)數(shù)量明顯降低。在硼酸質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)，郁金香花粉管粗細(xì)均勻，生長(zhǎng)最好，長(zhǎng)度可達(dá)335.47 μm；高于或低于該質(zhì)量濃度時(shí)花粉管長(zhǎng)度顯著降低。綜上，郁金香花粉萌發(fā)及生長(zhǎng)的適宜硼酸質(zhì)量濃度為100 mg/L。

2.2.3 鈣對(duì)郁金香花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響 由圖4-A可知，郁金香花粉萌發(fā)數(shù)量隨著鈣質(zhì)量濃度增大先增后減。不添加外源鈣時(shí)，郁金香花粉基本不萌發(fā)，推測(cè)可能是由于花粉本身內(nèi)源鈣含量不足所致；添加500 mg/L鈣時(shí)，花粉萌發(fā)率為57.38%；添加900 mg/L鈣時(shí)，萌發(fā)的花粉數(shù)量極少。鈣也影響花粉管生長(zhǎng)速度，添加500 mg/L鈣時(shí)，花粉管長(zhǎng)度迅速增大，達(dá)到346.21 μm；過(guò)低或過(guò)高質(zhì)量濃度鈣均明顯不利于花粉管的生長(zhǎng)。綜上，郁金香花粉萌發(fā)及生長(zhǎng)的適宜鈣質(zhì)量濃度為500 mg/L。

2.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)郁金香花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響 在最適培養(yǎng)條件(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+150 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+500 mg/L氯化鈣)下，培養(yǎng)1 h時(shí)郁金香花粉開始少量萌發(fā)，萌發(fā)率為20.06%，花粉管長(zhǎng)度為88.80 μm(圖4-B，圖5-A)；培養(yǎng)3 h時(shí)花粉萌發(fā)數(shù)量增加，萌發(fā)率為37.37%，花粉管生長(zhǎng)速度明顯加快，長(zhǎng)度達(dá)152.80 μm(圖4-B，圖5-B)；培養(yǎng)5 h時(shí)花粉萌發(fā)率快速增大，達(dá)69.60%，花粉管長(zhǎng)度達(dá)439.12 μm，長(zhǎng)勢(shì)良好，花粉管粗細(xì)均勻(圖4-B，圖5-C)；培養(yǎng)7 h時(shí)花粉萌發(fā)率為70.31%，花粉管生長(zhǎng)變緩，長(zhǎng)度為588.23 μm(圖4-B，圖5-D)。因此，郁金香花粉離體培養(yǎng)的最佳時(shí)間是5 h，超過(guò)7 h花粉管生長(zhǎng)變緩，且易發(fā)生纏繞現(xiàn)象，不易觀察。

3 討 論

3.1 郁金香小孢子發(fā)育特征

McCormick[14]研究認(rèn)為，植物小孢子發(fā)育從母細(xì)胞開始到成熟花粉結(jié)束，分為母細(xì)胞、四分體、單核花粉、成熟花粉4個(gè)時(shí)期。在百合科植物開口箭[15]、山麥冬[16]中發(fā)現(xiàn)其四分體全部為左右對(duì)稱型；而東方百合[17]四分體則是左右對(duì)稱型和四面體型同時(shí)存在。本試驗(yàn)結(jié)果表明，郁金香中兩種類型四分體都存在，其中四面體型占多數(shù)，偶見左右對(duì)稱型。

一般情況下，同一科或?qū)俚某墒旎ǚ垲愋褪且恢碌腫18-19]。通常認(rèn)為三胞花粉比二胞花粉更加進(jìn)化。在百合科植物中，二胞花粉類型遠(yuǎn)多于三胞花粉，僅有山麥冬[16]、玉簪[20]等少數(shù)植物是三胞花粉。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，郁金香成熟花粉為二胞花粉，未見三胞花粉。說(shuō)明郁金香可能在百合科植物的系統(tǒng)進(jìn)化中屬于較原始的類群。

小孢子發(fā)育時(shí)期的不一致性在多種植物[21-22]中均有發(fā)現(xiàn)。多數(shù)學(xué)者一致認(rèn)為，花粉發(fā)育時(shí)期的不同步是植物為抵抗逆境而作出的延長(zhǎng)花粉成熟時(shí)期、提高受精率的一種策略。本研究發(fā)現(xiàn)，郁金香花粉發(fā)育過(guò)程中也存在不同步現(xiàn)象，相差一兩個(gè)發(fā)育時(shí)期，二胞花粉和單核花粉共存現(xiàn)象較為常見，這可能是郁金香適應(yīng)環(huán)境變化的結(jié)果。在郁金香成熟花粉中觀察到2個(gè)成熟花粉緊緊粘連在一起的現(xiàn)象，此類花粉細(xì)胞外壁不明顯，細(xì)胞質(zhì)稀少，積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少，但花粉內(nèi)生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育正常，染色后可清晰看到營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞核和生殖細(xì)胞核，推測(cè)可能是花粉發(fā)育過(guò)程中突遇高溫或其他環(huán)境因素引起的，具體原因有待進(jìn)一步試驗(yàn)觀察。

3.2 郁金香花粉的離體培養(yǎng)

蔗糖是花粉離體萌發(fā)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在花粉體外培養(yǎng)過(guò)程中，蔗糖是花粉萌發(fā)的能量來(lái)源，同時(shí)還參與維持花粉外圍環(huán)境的滲透壓，蔗糖質(zhì)量濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于花粉萌發(fā)及生長(zhǎng)，這在睡蓮[23]、茶樹[24]、黃刺玫[25]等植物中已被證實(shí)。本研究中，郁金香花粉萌發(fā)及生長(zhǎng)的適宜蔗糖質(zhì)量濃度為150 g/L。

在植物生殖過(guò)程中，糖的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)及代謝均需要硼元素參與，適量的硼酸可加快植物花粉管壁物質(zhì)的運(yùn)輸與合成[1,26]，對(duì)花粉體外萌發(fā)有促進(jìn)作用。植物花粉本身含硼量較低，在自然受精過(guò)程中，柱頭及花柱會(huì)為花粉提供部分硼，用于花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)[24,27]。本試驗(yàn)中，未添加硼酸時(shí)郁金香花粉基本不萌發(fā)，但隨著體外硼酸質(zhì)量濃度的升高，郁金香花粉萌發(fā)數(shù)量明顯增多，說(shuō)明郁金香花粉萌發(fā)及生長(zhǎng)必須有外源硼的參與。

鈣是植物體內(nèi)最重要的信號(hào)分子，大多數(shù)植物細(xì)胞均含有鈣離子以維持正常生理需求。在花粉管頂端的極性生長(zhǎng)過(guò)程中，鈣也起到非常重要的調(diào)節(jié)作用，在花粉管頂端鈣的濃度最高，向下逐步遞減，因此多數(shù)植物花粉在體外萌發(fā)時(shí)都需要外源鈣的參與[28-29]。在本試驗(yàn)中，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加鈣時(shí)，郁金香花粉基本不萌發(fā)，推測(cè)可能是由于花粉本身內(nèi)源鈣含量不足所致，具體原因有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

郁金香小孢子發(fā)育歷經(jīng)四分體時(shí)期、單核早中期、單核靠邊期和二胞花粉時(shí)期，其中，以四面體型四分體為主，偶見左右對(duì)稱型；花粉發(fā)育過(guò)程中存在發(fā)育不同步、異?；ǚ鄣痊F(xiàn)象?；ǚ勖劝l(fā)最適培養(yǎng)基組分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+150 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+500 mg/L氯化鈣，培養(yǎng)最佳時(shí)長(zhǎng)為5 h。此結(jié)論有助于了解郁金香花粉發(fā)育的胚胎學(xué)特征以及花粉離體萌發(fā)所需要的條件，為郁金香新品種選育過(guò)程中父本花粉的選擇及花粉萌發(fā)能力的提高提供了數(shù)據(jù)支持。