高孝，高潔，劉曉宇，王中選，劉慶濤，桑亞新*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一種廣泛存在于發(fā)酵食品和酒精飲料[1-3]中屬于2A類的致癌物質(zhì)[4]，并且在食品的發(fā)酵及貯藏過程中均可由其前體物質(zhì)所產(chǎn)生的一種有害物質(zhì)[5-6]。目前，人們常常通過優(yōu)化食品的發(fā)酵工藝[7-8]、對(duì)釀酒酵母進(jìn)行基因改造[9-11]以及微生物酶法（包括脲酶[12-14]、氨基甲酸乙酯水解酶[15-17]）實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基甲酸乙酯的控制，由于微生物酶法可直接作用于底物，對(duì)底物的降解效率高并且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成影響，從而使其在降解EC方面具有很好的優(yōu)勢(shì)[18-19]。脲酶可以通過水解EC的前體物質(zhì)尿素從而實(shí)現(xiàn)對(duì)終產(chǎn)物EC含量的控制[20]，但是EC一旦生成將很難在食品中消除[21]，而氨基甲酸乙酯水解酶（urethanase，UH）可以直接作用于EC使其水解為無害的物質(zhì)，因此其在實(shí)際的應(yīng)用過程中具有良好的前景[22]。

2006 年，Akutsu-Shigeno等[21]從馬紅球菌（Rhod-ococcus equistrain TB-60）中發(fā)現(xiàn)了可以降解EC的蛋白質(zhì)，并克隆了該蛋白的基因序列（GenBank：DD320008.1），成功實(shí)現(xiàn)了其在E.coli中的異源表達(dá)。卜攀攀等[23]在2013年從小鼠的胃部獲得了一株具有UH活性的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），驗(yàn)證該菌所產(chǎn)的EC水解酶對(duì)于氯化鈉具有較好的耐受性。隨后李京京等[24]在2014年從小鼠腸道篩選得到一株賴氨酸芽孢桿菌，證明其具有對(duì)EC進(jìn)行降解的功能，并對(duì)所產(chǎn)的EC水解酶進(jìn)行分離純化，通過N端測(cè)序獲得了該EC水解酶的基因序列（GanBank：KU353448.1），隨后在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌中均實(shí)現(xiàn)了該酶的活性表達(dá)，但該酶的耐酸性以及耐乙醇性較差。2019年，Masakik等[25]在Candida parapsilosis中獲得了具有編碼EC水解酶的基因序列（GanBank：LC511748.1），并實(shí)現(xiàn)了該基因在釀酒酵母中的表達(dá)，且該酶對(duì)乙醇具有一定耐受性。

本研究根據(jù)來源于長(zhǎng)孢洛德酵母菌屬的UH蛋白序列，并依據(jù)大腸桿菌系統(tǒng)的密碼子偏好性來合成該UH蛋白的目的基因，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行異源表達(dá)，將得到的粗酶液進(jìn)行細(xì)胞破碎后經(jīng)鎳柱親和層析純化，研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì)[26]，以期為在實(shí)際應(yīng)用中降解氨基甲酸乙酯提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coli BL21（DE3）（過表達(dá)目的基因的宿主菌）、誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pET-30a（＋）：由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；含有氨基甲酸乙酯水解酶基因的E.coli DH5α：金唯智生物科技（蘇州）有限公司。

1.1.2 試劑

質(zhì)粒小提試劑盒：全式金生物技術(shù)（北京）有限公司；蛋白胨、酵母粉：英國(guó)Oxiod公司；氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、丁基氨基甲酸酯、乙酰胺、丁酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、煙酰胺：上海麥克林生化科技有限公司。以上化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；Thermo Cel I恒溫金屬浴：杭州博日科技股份有限公司；BG-Power600型電泳儀：上海貝晶生物技術(shù)有限公司；1500酶標(biāo)儀：賽默飛爾科技公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Tanon-4600SF凝膠成像系統(tǒng)：北京原平皓生物科技有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中來源于Lodderomyces elongisporus的UH的氨基酸序列（XP_001524600.1），在序列的5’端和3’端分別添加限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)，在不改變氨基酸序列的前提下根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對(duì)序列進(jìn)行優(yōu)化后合成目的基因，隨后連接至pET-30a（＋）載體上，命名為pET-30a（＋）-UH，并轉(zhuǎn)化至克隆菌株E.coli DH5α中。

1.3.2 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)

參照質(zhì)粒小提試劑盒提取克隆菌株中的表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，隨后涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取重組菌接入LB液體培養(yǎng)基中過夜活化后，以1%的接種量將菌液接種至LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，至OD600值約為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.1mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷溶液，在30℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.3.3 氨基甲酸乙酯水解酶的分離純化

將表達(dá)后的菌液以12 000 r/min離心10 min后收集發(fā)酵誘導(dǎo)的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體后放于冰水浴上超聲破碎，將破碎液于4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液即為所需的粗酶液。使用鎳柱親和層析法純化重組氨基甲酸乙酯水解酶，使用截留分子量為3.3 kDa的透析袋透析，隨后經(jīng)過截留分子量為10 kDa的超濾離心管離心后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 檢測(cè)分析，以確定洗脫蛋白是否為目的蛋白及其純化程度。

1.3.4 重組氨基甲酸乙酯水解酶酶活的測(cè)定

根據(jù)Berthelot反應(yīng)顯色法，在波長(zhǎng)625 nm下測(cè)定吸光值計(jì)算酶活。在0.2 mL含200 mmol/L氨基甲酸乙酯的磷酸鹽緩沖液（對(duì)照組為磷酸鹽緩沖液）中加入0.2 mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液，在37℃恒溫水浴箱中反應(yīng)20 min后，立即加入0.2 mL終止劑終止反應(yīng)，混勻后依次加入0.2 mL顯色劑Ⅰ、0.2 mL顯色劑Ⅱ，搖勻，37℃水浴繼續(xù)保持10 min。酶活定義：在37℃、pH7.4條件下每分鐘分解底物EC產(chǎn)生1 μmol NH4+所需酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.3.5 氨基甲酸乙酯水解酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.5.1 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

將純化后的酶液與底物分別在 20、25、30、37、40、45、50、55、60℃條件下測(cè)定酶活力，以測(cè)得的最高活力為100%，計(jì)算出其余溫度下的相對(duì)酶活，確定該酶的最適反應(yīng)溫度。將純化后的酶液分別于20、30、37、40、45、50℃條件下恒溫放置1 h后測(cè)定殘余酶活，以反應(yīng)所測(cè)的最高酶活力為100%，探討酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.5.2 最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

將等量的純酶液置于不同 pH 值（4、5、6、7、8、9）的緩沖液中，于37℃反應(yīng)測(cè)定酶活力，考察該酶在不同pH值條件下的酶活力，確定該酶的最適pH值。將等量的酶液分別與不同 pH 值（4、5、6、7、8、9）的緩沖液在4℃放置4 h后，測(cè)定殘余的酶活力，考察酶在不同pH值下的穩(wěn)定性。

1.3.5.3 酶的乙醇耐受性以及NaCl耐受性

將純化的酶液加入含底物不同體積分?jǐn)?shù)（0%～30%）的乙醇溶液中，于37℃反應(yīng)后測(cè)定酶的活力，觀察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)酶活力的影響。將酶液加入含底物不同質(zhì)量濃度（0%～20%）的NaCl溶液中，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定酶的殘余酶活力，觀察酶對(duì)NaCl的耐受性。

1.3.5.4 底物特異性

在最適的條件下，將酶液分別與不同底物（氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、丁基氨基甲酸酯、乙酰胺、丁酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、煙酰胺）反應(yīng)測(cè)定酶活力，以酶對(duì)氨基甲酸乙酯的酶活為100%，換算得到酶對(duì)其他底物的降解活性。

1.3.5.5 金屬離子與化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響

將酶液與終濃度為1 mmol/L的不同金屬離子（Cu2+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Fe3+） 以及終濃度為0.1 mmol/L（0.1%）的化學(xué)試劑混合，于37℃保溫5 min后加入底物測(cè)定酶的殘余酶活力，研究金屬離子與化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響。

1.3.5.6 酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

將純化后的酶液與不同終濃度（5mmol/L～50mmol/L）的氨基甲酸乙酯底物作用，在37℃磷酸鹽緩沖液中測(cè)定酶反應(yīng)的初速度，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出酶對(duì)底物的Km值和Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

本文采用pET-30a（＋）質(zhì)粒作為克隆及表達(dá)載體，克隆菌株為E.coli strain DH5α，因此挑取單菌落進(jìn)行過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切處理，對(duì)目的基因的大小進(jìn)行驗(yàn)證。取雙酶切之后的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electropherogram of recombinant plasmid double digestion product

如圖1所示，1號(hào)泳道代表未經(jīng)雙酶切處理的重組質(zhì)粒，2號(hào)泳道代表經(jīng)過內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ處理的重組質(zhì)粒，因此顯示共有兩條帶，其中第一條為線性pET-30a（＋）質(zhì)粒，大小為5 231 bp，另外一條為目的基因，大小為1 703 bp，表明目的基因與載體質(zhì)粒連接成功,可以進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化表達(dá)。

2.2 重組氨基甲酸乙酯水解酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

對(duì)重組菌誘導(dǎo)后的表達(dá)蛋白進(jìn)行超聲破碎，經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行蛋白條帶檢測(cè)，結(jié)果見圖2。

圖2 重組氨基甲酸乙酯水解酶分離純化過程SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis in the purification process of recombinant urethanase

從圖2可以看出，在70 kDa附近有明顯的目的條帶，粗酶液經(jīng)親和層析柱純化后得到目的蛋白條帶，粗酶液的比活力為4.52 U/mg，純化后的酶比活力達(dá)到9.86 U/mg，是純化前的2.18倍。

2.3 溫度與pH值對(duì)重組氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響

不同溫度和pH值下的重組氨基甲酸乙酯水解酶酶活力結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度和pH值對(duì)重組氨基甲酸乙酯水解酶的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on the activity of recombinant urethanase

由圖3A可知，重組水解酶的酶活隨著溫度的逐漸升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，重組酶在20℃～40℃范圍內(nèi)相對(duì)活性在50%以上，最適反應(yīng)溫度為30℃；由圖3B可知，重組酶在40℃以下處理1 h后，仍能保持70%以上的酶活力，高于40℃后，酶活力幾乎完全喪失，結(jié)果表明，重組酶在20℃～40℃的情況下具有良好的反應(yīng)活性以及熱穩(wěn)定性。

由圖3C可知，在pH4～9條件下，隨著pH值的升高，酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)。在pH7時(shí)，酶活力最高，為UH的最適反應(yīng)pH值，最適pH值范圍為6～8，相對(duì)活力在50%以上。將該酶分別在pH值為4～9條件下，4℃放置4 h后測(cè)定酶活力，如圖3D所示，當(dāng)酶在pH值為6～8時(shí)，酶活力基本穩(wěn)定，能維持50%以上的酶活力，當(dāng)pH值低于6或大于8時(shí)，酶活力迅速下降。該結(jié)果表明，重組酶在中性范圍內(nèi)具有較好的反應(yīng)活性以及穩(wěn)定性。

2.4 乙醇與鹽對(duì)氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)和NaCl質(zhì)量濃度對(duì)氨基甲酸乙酯水解酶的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)和NaCl質(zhì)量濃度對(duì)氨基甲酸乙酯水解酶的影響Fig.4 Effects of ethanol volume fraction and NaCl concentration on the activity of urethanase

由圖4A可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，UH的相對(duì)酶活在30%左右，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于20%時(shí)，殘余酶活力不到原來的10%。由圖4B可知，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，UH的酶活力只有初始酶活力的20%。結(jié)果表明，與已報(bào)道過的氨基甲酸乙酯水解酶[15-17]相比，UH對(duì)低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl以及低體積分?jǐn)?shù)乙醇具有一定耐受性。

2.5 金屬離子與化學(xué)試劑對(duì)重組氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響

不同的金屬離子與化學(xué)試劑對(duì)氨基甲酸乙酯水解酶的酶活影響見圖5。

圖5 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)重組氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響Fig.5 Effects of metal ions and chemicals on the activity of recombinant urethanase

由圖5A可知，除了Mg2+外其它金屬離子對(duì)UH的酶活都有不同程度的抑制作用，其中Cu2+、Zn2+、Fe3+使酶活力降至原來的10%以下，其中Cu2+幾乎能完全抑制酶活。此結(jié)果與Patel等[27]研究得到的Cu2+可加快氧化自身半胱氨酸分子，從而使得二硫鍵或亞磺酸在分子內(nèi)或分子間形成，最終導(dǎo)致酶活力受到嚴(yán)重抑制結(jié)果一致。由圖5B可知，在不同種表面活性劑和抑制劑存在的情況下，酶活力依然在80%以上，且在表面活性劑吐溫-20、吐溫-80以及曲拉通X-100存在時(shí)，酶活力均在95%以上，表明其對(duì)酶活力影響較小。

2.6 重組氨基甲酸乙酯水解酶的底物特異性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

氨基甲酸乙酯水解酶的底物特異性分析結(jié)果如表1所示。

表1 氨基甲酸乙酯水解酶的底物特異性Table 1 Substrate specificity of urethanase%

由表1可知，將UH對(duì)氨基甲酸乙酯的降解活性設(shè)為100%，可以看出酶對(duì)氨基甲酸酯類化合物以及酰胺類化合物均具有降解活性，對(duì)一些L-氨基酸類物質(zhì)以及尿素?zé)o降解活性，與Kazuo等[24]研究氨基甲酸乙酯水解酶對(duì)于氨基酸和尿素?zé)o降解活性的結(jié)果相符，UH對(duì)于2A級(jí)的致癌物丙烯酰胺同樣具有較高的水解活性，說明在降解丙烯酰胺方面具有良好的應(yīng)用前景[28]。水解酶對(duì)于氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丁酯的降解相對(duì)酶活分別為110.05%、7.02%，表明隨著底物碳原子數(shù)的增加，水解酶的水解能力逐漸降低[23]。

以氨基甲酸乙酯為底物，通過測(cè)定重組酶在不同底物濃度下的酶活，計(jì)算出初始反應(yīng)速率，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖后計(jì)算得到UH的酶促反應(yīng)參數(shù)Km值為6.64mmol/L，Vmax值為8.24μmol/min。與來源于肺炎克雷伯氏菌[23]和變幻青霉[29]的氨基甲酸乙酯水解酶的Km分別為74 mmol/L和27.2 mmol/L相比，本研究中UH的Km值相對(duì)更低，表明該酶與底物的親和力更大。

3 結(jié)論

根據(jù)大腸桿菌系統(tǒng)對(duì)密碼子的偏好性，將來源于Lodderomyces elongisporus菌屬的氨基甲酸乙酯水解酶的氨基酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化后合成其目的基因，并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)后得到分子量大小約為70 kDa左右的重組蛋白，將蛋白粗酶液進(jìn)行超聲破碎后經(jīng)鎳柱進(jìn)行純化后，水解酶的比活力達(dá)到了9.86 U/mg，是純化前的2.18倍。最適反應(yīng)溫度為30℃，在最適反應(yīng)溫度及以下，酶的穩(wěn)定性較好；最適pH值為7.0，在pH6.0～8.0時(shí)酶的活性以及穩(wěn)定性較好。UH對(duì)低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl溶液以及低體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液具有一定耐受性，并且在乙醇體積分?jǐn)?shù)低于12%時(shí)，酶活力可以保持在50%以上。不同種類的金屬離子對(duì)酶活均有不同程度的抑制作用，尤其是Cu2+、Fe3+存在的情況下，酶活力幾乎喪失。酶對(duì)氨基甲酸酯類化合物、酰胺類化合物有較強(qiáng)的降解能力，但是對(duì)于一些L-氨基酸類物質(zhì)以及尿素沒有活性，表明其屬于一種酰胺類的酶。以氨基甲酸乙酯作為反應(yīng)底物時(shí)，氨基甲酸乙酯水解酶的酶促反應(yīng)參數(shù)Km值為 6.64 mmol/L，Vmax值為 8.24 μmol/min。本研究通過對(duì)蛋白的目的基因進(jìn)行合成后表達(dá)，驗(yàn)證其具有氨基甲酸乙酯水解酶的活性，使UH的來源得到了豐富，同時(shí)為后續(xù)實(shí)際應(yīng)用提供了很好的參考價(jià)值。