徐欣玉　劉潔　夏慧敏　陳麗婷　李鵬飛　肖俊　陸穎

摘要：【目的】比較低溫脅迫下野生羅非魚和養(yǎng)殖吉富羅非魚的基因表達(dá)模式，揭示野生羅非魚低溫應(yīng)答的特有分子調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)開展野生羅非魚耐冷親本大范圍篩選打下基礎(chǔ)?！痉椒ā刻暨x規(guī)格相近的野生羅非魚和養(yǎng)殖吉富羅非魚進(jìn)行梯度降溫試驗(yàn)，水溫先以1 ℃/12 h的速度從26 ℃降至14 ℃，并保持288 h（12 d），于26 ℃、20 ℃及14 ℃保持0、120和288 h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別解剖羅非魚采集腦組織樣品，構(gòu)建cDNA文庫后以Illumina HiSeq×Ten測序平臺(tái)進(jìn)行雙端測序及比較轉(zhuǎn)錄組分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對具有重要功能的差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。【結(jié)果】野生羅非魚在11 ℃時(shí)開始出現(xiàn)死亡個(gè)體，但在8 ℃時(shí)仍有50.0%的存活個(gè)體，說明野生羅非魚較養(yǎng)殖吉富羅非魚具有更強(qiáng)的低溫耐受能力。在14 ℃的長時(shí)間低溫脅迫過程中，養(yǎng)殖吉富羅非魚腦組織中表達(dá)顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)量約是野生羅非魚的10倍，即養(yǎng)殖吉富羅非魚的應(yīng)激反應(yīng)遠(yuǎn)比野生羅非魚強(qiáng)烈。KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，養(yǎng)殖吉富羅非魚和野生羅非魚在14 ℃保持120和288 h的上調(diào)差異表達(dá)基因均富集到核糖體發(fā)生、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工及剪接體信號等信號通路上，野生羅非魚的上調(diào)差異表達(dá)基因還額外富集到核苷酸切除修復(fù)、N-糖基化生物合成和DNA復(fù)制信號等通路上。與養(yǎng)殖吉富羅非魚相比，在野生羅非魚中發(fā)現(xiàn)577個(gè)特有的差異表達(dá)基因，主要富集在NOD受體信號通路、凋亡和內(nèi)吞等通路上，且表現(xiàn)為NOD受體信號通路被啟動(dòng)，而細(xì)胞凋亡受抑制。在野生羅非魚中，參與NOD受體信號通路的關(guān)鍵功能基因（Nemo、NFκB、p38、JNK和IL-1β）在長時(shí)間低溫脅迫中均維持在一個(gè)較高的表達(dá)水平，而內(nèi)吞途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)上升倍數(shù)也明顯高于養(yǎng)殖吉富羅非魚。【結(jié)論】野生羅非魚通過避免過度的應(yīng)激反應(yīng)和維持低水平代謝的細(xì)胞穩(wěn)定以減輕低溫脅迫對機(jī)體的損傷，并持續(xù)啟動(dòng)NOD受體信號通路及內(nèi)吞途徑以維持其免疫能力，而具有較養(yǎng)殖羅非魚更強(qiáng)的低溫耐受力。

關(guān)鍵詞： 羅非魚;腦組織;低溫脅迫;差異表達(dá)基因（DEGs）;轉(zhuǎn)錄組測序

中圖分類號： S917.4;S965.125? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）03-0704-10

Transcriptome sequencing analysis of the brain tissues responding to low temperature stress in wild tilapia

XU Xin-yu LIU Jie XIA Hui-min CHEN Li-ting LI Peng-fei XIAO Jun LU Ying

（1Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， （Shanghai Ocean University），Shanghai? 201306， China; 3Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key

Laboratory of? Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture， Nanning， Guangxi? 530021， China; 4Guangxi Academy of Sciences/Guangxi Engineering Research Center for Fishery Major Diseases Control and Efficient

Healthy Breeding Industrial Technology， Nanning， Guangxi? 530007， China）

Abstract：【Objective】To investigate regulatory mechanism of the responses to low temperature stress in wild tilapia， comparing to that of the cultured tilapia， so as to contribute to screen cold tolerant parents from wild tilapia in the future.【Method】A wild and a cultured tilapia populations with similar sizes were selected for a gradient low temperature stress test that the water temperature was decreased from 26 ℃ to 14 ℃ at the rate of 1 ℃/12 h and kept at 14 ℃ for 288 h （12 d）. The brain tissues were collected at 26 ℃， 20 ℃ and 14 ℃ for 0， 120 and 288 h during this period， respectively， and were dissected. The prepared cDNA libraries were sequenced using Illumina HiSeq×Ten platform. A comparative transcriptome analysis was carried out to identify differentially expressed genes （DEGs） between the stressed and control tissues. Expression of the critical genes involved in the responses to low temperature stress were verified with a qRT-PCR analysis. 【Result】Death of wild tilapia individuals initially occurred at 11 ℃ and still 50.0% of them were alive at 8 ℃， indicating that the wild tilapia had a better tolerance to low temperature than the cultured tilapia.During the long-term low temperature stress at 14 ℃， DEGs expression in cultured tilapia brain tissue was about 10 times higher than that in wild tilapia， indicating that the stress response of cultured tilapia was much stronger. KEGG pathway enrichment analysis results showed that the up-regulated DEGs of cultured GIFT tilapia and wild tilapia maintained at 14 ℃ for 120 and 288 h were both enriched in ribosome formation， endoplasmic reticulum protein processing and spliceosome signaling pathways. The up-regulated DEGs of wild tilapia were additionally enriched in nucleotide excision repair， N-glycosylation biosynthesis and DNA replication pathways. Compared with the cultured Tilapia， there were 577 unique DEGs in wild Tilapia， which were mainly enriched in the NOD receptor signaling pathway， apoptosis， endocytosis and other pathways. The NOD receptor signaling pathway was activated， and apoptosis was inhibited. In wild tilapia， the key functional genes involved in Nod-like receptor signal pathway， such as Nemo， NFκB， P38， JNK and IL-1β， maintained a high expression under the long-term low temperature stress. Meanwhile，the key genes employed in the endocytosis pathway had the much higher expression than the cultured tilapia. 【Conclusion】Wild tilapia has stronger cold tolerance than cultured tilapia by avoiding excessive stress response and maintaining low-level metabolic cell stability to alleviate the damage of low temperature stress on the body， as well as continuing to activate NOD receptor signaling pathways and endocytosis pathways to maintain their immunity.D702AD90-53E9-41CC-98A9-65C771A49FD3

Key words： tilapia; brain tissue; low temperature stress; DEGs; transcriptome sequencing

Foundation items：National Key Research and Development Program of China“Technological Innovation of Blue Granary”（2018YFD0900101， 2018YFD0900601）; Guangxi Freshwater Fish Industry Innovation Team of National Mo-dern Agricultural Industry Technology System（nycytxgxcxtd-2021-08-03）

0 引言

【研究意義】羅非魚隸屬于慈鯛科（Cichlidae）羅非魚屬（Oreochromis），是全球重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，具有繁殖能力強(qiáng)、生長速度快、抗病力強(qiáng)及食性雜等優(yōu)點(diǎn)（鄭雄等，2019;李柳清等，2020）。羅非魚起源于非洲的熱帶亞熱帶地區(qū)，屬于暖水性魚類，在越冬期間會(huì)增加能量損耗，導(dǎo)致其免疫力下降甚至死亡（Abdel-Ghany et al.，2021），制約著其養(yǎng)殖區(qū)域的向北拓展。野生羅非魚較養(yǎng)殖羅非魚具有更強(qiáng)的低溫耐受能力，因此開展野生羅非魚低溫應(yīng)激分子機(jī)制研究，有助于篩選具有較強(qiáng)耐低溫能力的野生品系作為雜交育種親本，以拓展羅非魚養(yǎng)殖區(qū)域?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】寒冷是水生環(huán)境中魚類的主要應(yīng)激源。近年來，已有學(xué)者運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序及其他組學(xué)研究方法探究冷應(yīng)激反應(yīng)下不同魚類的基因表達(dá)模式（Mininni et al.，2014;Qian and Xue，2016）。Long等（2012）對斑馬魚（Danio rerio）幼蟲的研究發(fā)現(xiàn)，在冷應(yīng)激條件下顯著差異表達(dá)的基因主要參與RNA剪接、核糖體生物合成和蛋白質(zhì)分解等通路。Xu等（2018）在對冷應(yīng)激存活黃姑魚（Nibea albiflora）的研究中發(fā)現(xiàn)，其腦和肌肉組織中參與分子—分子相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、消化系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)等通路的基因表達(dá)均顯著上調(diào)，可能與應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝和應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞膜變化等生理過程相關(guān)。Sun等（2019）研究表明，在受低溫脅迫的石斑魚（Epinephelus coioides）肝臟轉(zhuǎn)錄組中，其應(yīng)激反應(yīng)涉及細(xì)胞黏附分子、PPAR信號通路及脂肪酸延長等途徑。Wen等（2019）通過對低溫脅迫后的暗紋東方鲀（Takifugu fasciatus）肝臟組織進(jìn)行多組學(xué)分析，建立的mRNA—蛋白質(zhì)—代謝物相互作用網(wǎng)絡(luò)證實(shí)分子互作網(wǎng)絡(luò)主要參與脂肪酸代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及DNA損傷和修補(bǔ)等代謝過程。Liu等（2020）通過對低溫脅迫8月齡虎皮魚的腦、鰓、肝臟和肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)參與晝夜節(jié)律、類固醇和脂肪酸生物合成等途徑的基因在低溫脅迫下其表達(dá)模式均發(fā)生改變，并證實(shí)泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解可能是虎皮魚應(yīng)對急性冷應(yīng)激過程的關(guān)鍵。針對羅非魚而言，不同羅非魚品種的耐低溫能力也存在明顯差異，其致死溫度范圍在8.9～10.5 ℃（唐章生等，2012）。在羅非魚耐受低溫應(yīng)激的分子調(diào)控機(jī)制研究中，Chen等（2002）研究認(rèn)為免疫相關(guān)基因?qū)α_非魚的耐寒能力存在影響，當(dāng)羅非魚處于12.0 ℃時(shí)其血漿腎上腺素增加，血清皮質(zhì)醇水平顯著升高，血清中的高皮質(zhì)醇水平對魚體免疫產(chǎn)生抑制作用;Ammar等（2018）對尼羅羅非魚在夏季和冬季的基因表達(dá)差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)冬季IV型防凍基因在其腸道、鰓、皮膚、脾臟、肝臟和腦組織中的表達(dá)量明顯上調(diào);Nitzan等（2019）對冷應(yīng)激下的奧利亞羅非魚鰓組織和肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)基因在局部黏附和細(xì)胞—細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用通路中的表達(dá)下調(diào)，而在蛋白酶體及各種細(xì)胞內(nèi)蛋白水解活性信號通路中的表達(dá)上調(diào)。可見，羅非魚的低溫應(yīng)答過程主要表現(xiàn)在免疫、節(jié)律、信號傳導(dǎo)、DNA修補(bǔ)和基礎(chǔ)物質(zhì)合成或降解等相關(guān)代謝途徑的基因啟動(dòng)，且主要發(fā)生在免疫器官、消化器官及中樞控制器官——腦。腦是調(diào)控低溫脅迫下應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵器官（Song and McDowell，2020），機(jī)體對于冷刺激的耐受機(jī)制是在神經(jīng)系統(tǒng)的主導(dǎo)下進(jìn)行?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】選擇合適的親本，采用臨界非損傷性的溫度適應(yīng)選育方法有可能改善子代羅非魚耐低溫能力（肖俊等，2014;杜雪松等，2019），但從育種角度而言迫切需要耐低溫性狀能穩(wěn)定遺傳的親本，并將其耐低溫性狀引入現(xiàn)有的優(yōu)良家系中。野生羅非魚是耐寒研究和育種實(shí)踐的良好材料，開展野生羅非魚低溫應(yīng)激反應(yīng)的分子生物學(xué)研究對加速羅非魚抗寒性育種進(jìn)程具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選擇野生羅非魚進(jìn)行低溫脅迫試驗(yàn)，并以養(yǎng)殖的吉富羅非魚為對照，通過Illumina HiSeq×Ten測序平臺(tái)對羅非魚的腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，比較低溫脅迫下2種羅非魚的基因表達(dá)模式，旨在揭示野生羅非魚低溫應(yīng)答的特有分子調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)開展野生羅非魚耐冷親本大范圍篩選打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 降溫試驗(yàn)及樣品采集

成年野生羅非魚采自廣西崇左市扶綏縣左江流域（東經(jīng)107°54′14.76″，北緯22°38′2.76″），選用規(guī)格相近的養(yǎng)殖吉富羅非魚為對照（唐永凱等，2010）。隨機(jī)挑選野生羅非魚和吉富羅非魚各30尾，26 ℃下暫養(yǎng)60 d后進(jìn)行降溫預(yù)試驗(yàn)。參考Healy等（2017）、Giordano等（2021）的降溫試驗(yàn)方法，使水溫先以1 ℃/12 h的速度從26 ℃降至8 ℃，降溫過程中每2 h記錄1次水溫及羅非魚死亡數(shù)量。正式取樣時(shí)，使水溫先以1 ℃/12 h的速度從26 ℃降至14 ℃，并保持288 h（12 d），于26 ℃、20 ℃及14 ℃保持0、120和288 h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別解剖羅非魚采集腦組織樣品，各時(shí)間點(diǎn)均取2尾羅非魚作為平行重復(fù)。按取樣水溫和時(shí)間，吉富羅非魚樣品分別命名為G26、G20、G14H0、G14H120和G14H288，野生羅非魚樣品分別命名為W26、W20、W14H0、W14H120和W14H288。采集的腦組織立即凍存于液氮中備用。D702AD90-53E9-41CC-98A9-65C771A49FD3

1. 2 RNA提取與測序

采用TRIzol試劑提取羅非魚腦組織總RNA，在安捷倫生物分析儀芯片RNA 7500 Series II上檢測其質(zhì)量和濃度。使用TruSeq RNA樣品制備試劑盒（Illumina）從每個(gè)樣品中提取3 μg總RNA，轉(zhuǎn)錄合成cDNA后構(gòu)建平均插入片段大小為300～500 bp的測序文庫，然后以Illumina HiSeq×Ten測序平臺(tái)進(jìn)行雙端測序。

1. 3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)處理與分析

使用Trimomatic v0.32對測序獲得的原始序列（Raw reads）進(jìn)行檢測和過濾（Bolger et al.，2014），過濾掉低質(zhì)量序列及接頭序列后得到有效序列（Clean reads）。通過HISAT v2.1.0將Clean reads比對到尼羅羅非魚參考基因組（GenBank登錄號GCA_000002035.4）上（Kim et al.，2019;Tao et al.，2021），再使用Cufflinks 2.2.1計(jì)算基因表達(dá)量（FPKM）（Trapnell et al.，2012），以R語言軟件包edgeR篩選差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）（Chen et al.，2016），篩選條件：[log2 Fold Change]≥1和P<0.05。通過KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋及信號通路分析（Kanehisa et al.，2016），并用R語言軟件包ggplot2對結(jié)果進(jìn)行可視化處理（Ginestet，2011）。

1. 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對NOD受體、內(nèi)吞及凋亡等信號通路上的17個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將各樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，使用FastStart Universal SYBR? Green Master（ROX）試劑在CFX96 Real-Time PCR Detection System定量PCR儀（Bio-Rad）上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。每個(gè)樣品測定3個(gè)平行，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2. 1 羅非魚低溫存活率測定結(jié)果

在低溫預(yù)試驗(yàn)中，統(tǒng)計(jì)梯度降溫過程中各時(shí)間點(diǎn)養(yǎng)殖吉富羅非魚和野生羅非魚的存活數(shù)量，計(jì)算存活率。結(jié)果顯示，養(yǎng)殖吉富羅非魚在水溫降至14 ℃時(shí)開始出現(xiàn)個(gè)體失去平衡的現(xiàn)象，在水溫降至11 ℃時(shí)出現(xiàn)個(gè)體死亡，并于8 ℃時(shí)全部死亡（圖1）。相比之下，野生羅非魚雖然在14 ℃時(shí)出現(xiàn)失去平衡的個(gè)體，并于11 ℃時(shí)開始出現(xiàn)死亡個(gè)體，但在8 ℃時(shí)仍有50.0%的存活個(gè)體，說明野生羅非魚較養(yǎng)殖吉富羅非魚具有更強(qiáng)的低溫耐受能力。

2. 2 羅非魚腦組織轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

對養(yǎng)殖吉富羅非魚和野生羅非魚5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦組織共20個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)質(zhì)控后共獲得141.31 Gb的Clean reads。測序堿基達(dá)Q30（測序堿基準(zhǔn)確率達(dá)99.9%）的比例超過92.0%（表1），即測序準(zhǔn)確率較高。將各樣品的Clean reads比對到尼羅羅非魚參考基因組上，其比對率均在69.5%以上，最高為94.2%，滿足后續(xù)分析的要求。

2. 3 低溫脅迫下羅非魚腦組織差異表達(dá)基因功能注釋分析結(jié)果

為認(rèn)定野生羅非魚的種屬關(guān)系，將26 ℃的野生型羅非魚轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)比對到7種羅非魚[奧利亞羅非魚（NC_013750.1）、紅羅非魚（NC_014060.1）、布氏異羅非魚（NC_023470.1）、莫桑比克羅非魚（AY597335.1）、 尼羅羅非魚（GU477624.1）、齊氏羅非魚（KM658974.1）和維多利亞綠羅非魚（NC_026109.1）]的線粒體基因組上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)比對到紅羅非魚的數(shù)目最多，故推測該野生羅非魚與紅羅非魚的親緣關(guān)系最為接近。對G14H0 vs G26、G14H120 vs G26、G14H288 vs G26、W14H0 vs W26、W14H120 vs W26和W14H288 vs W26等6對樣品的基因表達(dá)量進(jìn)行比較分析，鑒定出各組差異表達(dá)基因中的上調(diào)差異表達(dá)基因如圖1-D所示。其中，野生羅非魚W14H288和W14H120共有的上調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)量為162個(gè)，而養(yǎng)殖吉富羅非魚G14H288和G14H120共有的上調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)量為1686個(gè)，約是野生羅非魚的10倍。野生羅非魚W14H288特有的上調(diào)差異表達(dá)基因是200個(gè)，而養(yǎng)殖吉富羅非魚G14H288特有的上調(diào)差異表達(dá)基因?yàn)?909個(gè)，也是野生羅非魚的10倍以上，說明長期處于14 ℃下養(yǎng)殖吉富羅非魚的應(yīng)激反應(yīng)遠(yuǎn)比野生羅非魚強(qiáng)烈。

KEGG信號通路富集分析結(jié)果（圖2）顯示，養(yǎng)殖吉富羅非魚和野生羅非魚在14 ℃保持120和288 h的上調(diào)差異表達(dá)基因均富集到核糖體發(fā)生、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工及剪接體信號等信號通路上，可能與應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體利用這些蛋白作為應(yīng)激狀態(tài)的供能物質(zhì)有關(guān)。富集到晝夜節(jié)律信號通路上與本研究觀察到低溫脅迫下羅非魚運(yùn)動(dòng)和攝食節(jié)奏急劇變慢的現(xiàn)象相符（Li et al.，2020;Zou et al.，2021）;富集到蛋白酶體等信號通路上，則可能與清除細(xì)胞內(nèi)冷應(yīng)激下產(chǎn)生的異常蛋白有關(guān)（Yu et al.，2021）。與養(yǎng)殖吉富羅非魚相比，野生羅非魚的上調(diào)差異表達(dá)基因還額外富集到核苷酸切除修復(fù)、N-聚糖生物合成和DNA復(fù)制信號等通路上，可能參與冷應(yīng)激過程中的損傷修復(fù)（Huang et al.，2021）。養(yǎng)殖吉富羅非魚的這些差異表達(dá)基因則富集到自噬、線粒體自噬、細(xì)胞凋亡、泛素介導(dǎo)蛋白水解及賴氨酸降解等信號通路上，可能與長期低溫脅迫下能量利用途徑的改變有關(guān)，并激活自噬和細(xì)胞凋亡途徑，將細(xì)胞內(nèi)一些不重要的蛋白及細(xì)胞器分解以維持細(xì)胞的基本存活?？梢?，野生羅非魚在長期低溫脅迫下主要通過避免過度的應(yīng)激反應(yīng)、及時(shí)啟動(dòng)修復(fù)和減弱細(xì)胞調(diào)亡等機(jī)制，以獲得較養(yǎng)殖羅非魚更強(qiáng)的耐低溫能力。D702AD90-53E9-41CC-98A9-65C771A49FD3

2. 4 低溫脅迫下野生羅非魚的基因表達(dá)模式

為了解野生羅非魚特有的低溫應(yīng)激機(jī)制，對14 ℃脅迫下僅在野生羅非魚中上調(diào)的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。在計(jì)算得到野生羅非魚在14 ℃下各時(shí)間點(diǎn)上調(diào)差異表達(dá)基因（W14H0 vs W26、W14H120 vs W26和W14H288 vs W26）的基礎(chǔ)上，將這些差異表達(dá)基因中在相同時(shí)間點(diǎn)的養(yǎng)殖吉富羅非魚腦組織也發(fā)生顯著上調(diào)（G14H0 vs G26、G14H120 vs G26和G14H288 vs G26）的基因舍去，即去除養(yǎng)殖吉富和野生羅非魚在相同時(shí)間點(diǎn)共有的上調(diào)差異表達(dá)基因后，得到在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)僅在野生羅非魚中上調(diào)的差異表達(dá)基因。通過篩選共得到這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)僅在野生羅非魚中發(fā)生表達(dá)變化的差異表達(dá)基因有577個(gè)，且主要富集在NOD受體信號通路（Nod-like receptor signal pathway，map04621）、凋亡（Apoptosis，map 04210）和內(nèi)吞（Endocytosis，map04144）等通路上。對這些差異表達(dá)基因所參與的生物反應(yīng)過程進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)在野生羅非魚中存在NOD受體信號通路被啟動(dòng)而細(xì)胞凋亡受抑制的平衡（圖3）。

結(jié)合參與這3條信號通路上關(guān)鍵差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果（圖4），發(fā)現(xiàn)在NOD受體信號通路上，野生羅非魚的B細(xì)胞編碼κ輕鏈多肽抑制基因（Nemo）顯著上調(diào)，并激活下游的核轉(zhuǎn)錄因子kappa B1（NFκB）、絲裂原活化蛋白激酶（p38）和C-Jun氨基末端激酶（JNK）等，促進(jìn)炎癥相關(guān)因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）表達(dá)上升，進(jìn)而啟動(dòng)天然免疫和炎癥反應(yīng)（Elabd et al.，2020），且這些基因在長期低溫脅迫中均維持在一個(gè)較高的表達(dá)水平。在該過程中，養(yǎng)殖吉富羅非魚的這些基因幾乎沒有參與全程的冷應(yīng)激反應(yīng)，尤其是NOD受體信號通路上的Nemo基因一直未被啟動(dòng);而參與這一途徑的其他基因中只觀察到p38和IL-1β在個(gè)別時(shí)間點(diǎn)因未知原因突然劇烈升高，但隨后又迅速恢復(fù)至原有水平。在細(xì)胞調(diào)亡途徑中，重要抑制因子顆粒酶B（GZMB）在野生羅非魚呈顯著上升，而抑制細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)展（Yang et al.，2021）。此外，野生羅非魚的蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型13（ptpn13）和細(xì)胞凋亡相關(guān)半胱氨酸肽酶2（casp2）等基因參與細(xì)胞調(diào)亡調(diào)控表達(dá)量上升的倍數(shù)明顯小于養(yǎng)殖吉富羅非魚，細(xì)胞調(diào)亡可能在一定程度上受到抑制，而有利于避免過度應(yīng)激的發(fā)生。在內(nèi)吞途徑中，大部分野生羅非魚關(guān)鍵基因表達(dá)上升的倍數(shù)也明顯高于養(yǎng)殖吉富羅非魚，對及時(shí)清理細(xì)胞內(nèi)的不良物質(zhì)及維持細(xì)胞穩(wěn)定均有利。故推測野生羅非魚較養(yǎng)殖吉富羅非魚具有更強(qiáng)的耐低溫能力是通過避免過度應(yīng)激反應(yīng)及維持低水平代謝的細(xì)胞穩(wěn)定來實(shí)現(xiàn)。

3 討論

水溫對魚類的生長、繁殖、代謝、生理功能和行為活動(dòng)均產(chǎn)生重要影響（Somero，2010;Ma et al.，2014;Yang and Ma，2016）。雖然魚類可通過廣泛的調(diào)節(jié)代謝及生理生化適應(yīng)過程應(yīng)對一定范圍內(nèi)的水溫變化，但不適當(dāng)?shù)沫h(huán)境溫度仍然會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響（陳子桂等，2018;Xu et al.，2018）。冷應(yīng)激下，機(jī)體的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)是在神經(jīng)系統(tǒng)主導(dǎo)下，由下丘腦—腺垂體—甲狀腺系統(tǒng)（HPT）、下丘腦—腺垂體—腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)（HPA）和機(jī)體交感—腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)（SAM）配合相關(guān)激素的作用共同實(shí)現(xiàn)，其原理較復(fù)雜（Oyola and Handa，2017）。腦組織對冷應(yīng)激敏感，已有研究表明熱帶魚的腦組織較冷水魚的腦組織對熱刺激更具穩(wěn)定性，但對冷刺激不穩(wěn)定（Lu et al.，2019）。在低溫應(yīng)激后，金魚出現(xiàn)躲避游泳的現(xiàn)象是由一種存在魚類后腦組織中的神經(jīng)元細(xì)胞參與調(diào)控進(jìn)而激活聽覺傳入所引起（Silva et al.，2019）。在鯉魚中，低溫會(huì)減少腦組織的血容量，防止低溫血液進(jìn)入大腦而影響感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的活性（van den Burg et al.，2005）?？梢?，腦是魚類冷敏感檢測的理想組織。

現(xiàn)有關(guān)于羅非魚對低溫應(yīng)答機(jī)制的研究主要是通過長時(shí)間的低溫脅迫及觀察基因表達(dá)變化來實(shí)現(xiàn)。Nitzan等（2019）對具有相同遺傳背景的吉富羅非魚進(jìn)行降溫試驗(yàn)（從24 ℃降溫至12 ℃并保持），根據(jù)存活時(shí)間將吉富羅非魚分為冷耐受魚和冷敏感魚，發(fā)現(xiàn)冷敏感魚的差異表達(dá)基因數(shù)量多于冷耐受魚。本研究中，冷敏感的養(yǎng)殖吉富羅非魚在14 ℃保持120和288 h時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)的基因數(shù)量遠(yuǎn)多于低溫耐受能力較強(qiáng)的野生羅非魚，僅在冷應(yīng)激早期（14 ℃保持0 h）對冷應(yīng)激的響應(yīng)基因稍多一些，說明野生羅非魚對低溫環(huán)境的應(yīng)答啟動(dòng)更迅速，但在長期冷應(yīng)激反應(yīng)過程中對低溫更敏感的養(yǎng)殖吉富羅非魚中具有溫度依賴性表達(dá)的基因遠(yuǎn)多于野生羅非魚。從上調(diào)表達(dá)基因的功能注釋結(jié)果來看，Nitzan等（2019）發(fā)現(xiàn)鰓組織中糖酵解、糖異生及肝臟中氨基酸生物合成通路上的某些基因在耐冷魚類中呈下調(diào)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)在野生羅非魚的上調(diào)差異表達(dá)基因主要富集到核苷酸切除修復(fù)和N-糖基化的生物合成等通路上，而在能量代謝途徑基本上呈下調(diào)趨勢，表明能量代謝的減弱有利于魚類應(yīng)對寒冷環(huán)境。

根據(jù)已有關(guān)于低溫脅迫對羅非魚免疫系統(tǒng)的影響研究可知，長時(shí)間冷應(yīng)激反應(yīng)會(huì)直接導(dǎo)致其免疫力下降（Ndong et al.，2007），引起血液中兒茶酚胺、皮質(zhì)醇、腎上腺素、去甲腎上腺素和腎上腺素激的水平上升，從而抑制白細(xì)胞的吞噬作用，降低抗體水平（Chen et al.，2002）。此外，SGT1 和 ATG1等免疫相關(guān)基因在低溫脅迫下呈下調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象可能會(huì)影響過氧化物酶體、吞噬體和自噬的調(diào)節(jié)（Yang et al.，2015）。這是由于過度應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)的免疫能力下降，極大增加了羅非魚在低溫環(huán)境下的病原體感染風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下野生羅非魚的應(yīng)激反應(yīng)明顯弱于養(yǎng)殖吉富羅非魚，可能促使免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在一定程度上受到抑制，避免對機(jī)體的損傷。然而，在對免疫相關(guān)基因的分析中發(fā)現(xiàn)由p38、JNK、IL-1β、ptpn13和casp2等關(guān)鍵功能基因共同參與的NOD受體信號通路在長期低溫脅迫野生羅非魚腦組織中始終保持著較高的水平，暗示著NOD受體信號通路可能在野生羅非魚低溫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在NOD受體信號通路上，Nemo基因顯著上調(diào)，再激活下游的NFκB、p38和JNK基因等，促進(jìn)炎癥相關(guān)因子IL-1β表達(dá)上升，進(jìn)而啟動(dòng)天然免疫和炎癥反應(yīng)（Velmurugan et al.，2019;Elabd et al.，2020），可能對維持野生羅非魚的生存具有重要意義。就低溫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡或程序性死亡而言，GZMB是細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用的生物酶，其表達(dá)水平能反映細(xì)胞凋亡的程度。本研究結(jié)果表明，野生羅非魚可能通過激活GZMB基因，抑制核纖層蛋白，達(dá)到間接減弱因核膜完整性喪失而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐寒性。因此，控制免疫過度反應(yīng)和細(xì)胞調(diào)亡程度，且又保持局部的免疫能力，可能是野生羅非魚具有較強(qiáng)耐低溫能力的原因之一。D702AD90-53E9-41CC-98A9-65C771A49FD3

來自野生群體的優(yōu)良性狀，始終是良種選育的重要性狀來源 ，而攜帶有這些優(yōu)良性狀的野生家系是雜交育種的重要親本材料（Li et al.，2021）。本研究對養(yǎng)殖吉富羅非魚和野生羅非魚進(jìn)行耐寒能力測定，比較分析二者在低溫致死極限下的差異，并通過轉(zhuǎn)錄組測序分析揭示野生羅非魚低溫脅迫下細(xì)胞凋亡、內(nèi)吞和NOD受體等信號通路相關(guān)基因的表達(dá)模式，明確了導(dǎo)致羅非魚不同低溫耐受能力的分子調(diào)控機(jī)制，為今后篩選耐寒能力強(qiáng)的野生羅非魚品種打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

野生羅非魚通過避免過度應(yīng)激反應(yīng)和維持低水平代謝的細(xì)胞穩(wěn)定以減輕低溫脅迫對機(jī)體的損傷，并持續(xù)啟動(dòng)NOD受體信號通路及內(nèi)吞途徑以維持其免疫能力，即野生羅非魚較養(yǎng)殖羅非魚具有更強(qiáng)的耐受低溫能力。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）D702AD90-53E9-41CC-98A9-65C771A49FD3