武興剛 黃文華 董星星 趙伯文 張祥鑫 魏育濤，3

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000；2贛州市立醫(yī)院心胸外科;3濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院胸外科)

N-α乙?；D(zhuǎn)移酶(Naa10) 在人體各種組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，參與蛋白質(zhì)乙?；揎棧谡{(diào)控機(jī)體病理生理等生物學(xué)進(jìn)程中扮演重要的角色〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)Naa10基因在部分惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，對(duì)腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和侵襲起關(guān)鍵作用，有望成為檢測(cè)部分惡性腫瘤的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)〔2，3〕。有關(guān)Naa10在腫瘤化療耐藥方面的影響研究較少，但有報(bào)道發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)影響細(xì)胞凋亡從而改變腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性〔4，5〕。目前食管癌常用的治療方式有內(nèi)鏡治療、外科食管癌根治術(shù)、放射治療、藥物治療等〔6〕。但食管癌患者長(zhǎng)期預(yù)后較差，臨床上常用化療藥物有順鉑、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、表柔比星、卡培他濱等，但化療過(guò)程中，常常伴隨著食管癌對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，尋找新型的治療策略，提高食管癌對(duì)化療藥物敏感性，從而延長(zhǎng)食管癌患者預(yù)后較為重要。本研究探討Naa10表達(dá)對(duì)順鉑抑制人食管鱗癌ECA109細(xì)胞敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株、試劑與儀器 人食管鱗癌細(xì)胞ECA109來(lái)源于中科院細(xì)胞庫(kù)，RPMI1640培養(yǎng)基( 美國(guó) Gibco公司，貨號(hào)31800022)；胎牛血清(以色列BI公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Gibco 公司)；順鉑(DDP，合肥巴斯夫生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司)；細(xì)胞毒性測(cè)定(CCK)-8(日本同仁公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus IX51)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Rad公司，iMark Microplate Reader Model 680)；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人食管鱗癌ECA109細(xì)胞在含10%的胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)使用0.25%胰酶消化3～4 min 后，待倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞圓縮時(shí)，加入含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基終止消化，以移液槍輕輕吹下貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，輕柔吹打均勻后分至提前加入培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞凍存時(shí)配制凍存液1 ml〔100 μl二甲基亞砜(DMSO)+900 μl胎牛血清〕，靜置20 min，按照細(xì)胞傳代的操作方法離心得到細(xì)胞，棄上清，使用提前配制好的凍存液重懸細(xì)胞，用移液槍將細(xì)胞輕柔緩慢吹打均勻，移入凍存管，放入凍存盒內(nèi)。4℃保存20 min，-20℃保存1 h后，置于-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2向ECA109細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)及轉(zhuǎn)染效率鑒定 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司對(duì)siRNA進(jìn)行構(gòu)建、包裝和純化。將人食管鱗癌ECA109細(xì)胞鋪至24孔板，將siRNA-Naa10和siRNA-NC分別轉(zhuǎn)染人食管鱗癌ECA109細(xì)胞系，設(shè)立不同的Lip2000與siRNA比例，轉(zhuǎn)染完成后，放入培養(yǎng)箱中，經(jīng)過(guò)5 h，更換成完全培養(yǎng)基，移至熒光顯微鏡下觀察，確定最佳轉(zhuǎn)染效率及最低細(xì)胞毒性的Lip2000與siRNA比例，并用Western印跡檢測(cè)Naa10的表達(dá)狀況。

1.2.3Western印跡檢測(cè) 分別取轉(zhuǎn)染后48 h及72 h細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取各分組樣品的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，將制備好的蛋白加入5×上樣緩沖液，沸水浴8 min使蛋白變性，每組蛋白取3 μl上樣，進(jìn)行蛋白凝膠電泳，待溴酚藍(lán)至凝膠底部時(shí)停止電泳，將電泳開(kāi)的蛋白叢凝膠上電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)，后將NC膜浸入含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h，將一抗使用5%牛血清蛋白(BSA)按1∶1 000稀釋浸潤(rùn)NC膜，4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，將條帶充分浸潤(rùn)于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)中室溫孵2 h，再次洗膜后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)方法進(jìn)行顯影、曝光，膠片晾干后，掃描并分析。使用ImageJ(V2.1)軟件對(duì)目的蛋白與內(nèi)參進(jìn)行灰度對(duì)比。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)各細(xì)胞組對(duì)DDP的敏感性 將ECA109-siRNA-Naa10組、ECA109-siRNA-NC組和ECA109-空白組分別以4×103個(gè)/孔接種于96孔板(100 μl/孔)，間隔24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，各孔加入不同濃度的DDP進(jìn)行培養(yǎng)，濃度分別為1、2、4、6、8、10、20、30、40、50、70 μg/ml，相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組使用等容積的0.9% NaCl溶液代替DDP，每組每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，充分混勻后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。24 h后更換培養(yǎng)基，每孔加含有10%的CCK-8試劑的培養(yǎng)液?；靹蚝笈囵B(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，全自動(dòng)酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)450 nm測(cè)定吸光度值A(chǔ)450，計(jì)算平均細(xì)胞存活率，以藥物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，繪制回歸直線，并計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)值。每個(gè)處理組進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定細(xì)胞對(duì)藥物敏感程度的改變。計(jì)算公式如下：細(xì)胞存活率=處理組A450值/對(duì)照組A450值×100%；耐藥指數(shù)(RI)=處理組細(xì)胞IC50 /對(duì)照組IC50。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1siRNA轉(zhuǎn)染效率的確定 熒光顯微鏡下分別觀察ECA109-siRNA-Naa10組、ECA109-siRNA-NC組、ECA109-空白組，發(fā)現(xiàn)lip2000與siRNA比例為10 μl∶10 μl的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到80%以上，且對(duì)各細(xì)胞組毒性較小，故選取Lip2000∶siRNA為10 μl∶10 μl用于轉(zhuǎn)染ECA109細(xì)胞，見(jiàn)圖1。Western印跡檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染ECA109細(xì)胞48 h的ECA109-siRNA-Naa10組Naa10表達(dá)(0.521±0.163)明顯低于ECA109空白組(0.923±0.292)、ECA109-siRNA-NC組(0.946±0.499)，見(jiàn)圖2；轉(zhuǎn)染72 h的ECA109-siRNA-Naa10組Naa10表達(dá)(0.205±0.008)明顯低于ECA109-空白組(0.617±0.006)、ECA109-siRNA-NC組(0.662±0.017)，見(jiàn)圖3。

1～3:ECA109-空白組、ECA109-siRNA-NC組、ECA109-siRNA-Naa10組，圖3同圖2 Western印跡檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染ECA109細(xì)胞48 h的Naa10表達(dá)水平

圖3 Western印跡檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染ECA109細(xì)胞72 h的Naa10表達(dá)水平

2.2不同濃度DDP作用后對(duì)各處理組細(xì)胞增長(zhǎng)的抑制作用 圖4顯示，DDP在1～70 μg/ml濃度范圍內(nèi)，作用時(shí)間24 h不變的情況下，各組細(xì)胞隨著DDP藥物濃度增加，其存活率逐漸減弱。ECA109-siRNA-Naa10組細(xì)胞的IC50值〔(12.776±0.739)μg/ml〕較ECA109-siRNA-NC組〔(19.223±0.276)μg/ml〕、ECA109-空白組〔(18.526±0.568)μg/ml〕明顯減小(P<0.001)，ECA109-siRNA-NC組與ECA109-空白組細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性基本一致，IC50值變化差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.180)。ECA109-siRNA-NC組RI為1.037、ECA109-siRNA-Naa10組RI為0.689。

圖4 不同濃度DDP作用后各組細(xì)胞的存活率

3 討 論

目前臨床上對(duì)食管癌患者主要采用手術(shù)治療輔以放化療等綜合治療手段，但其臨床治療效果及遠(yuǎn)期預(yù)后較差，術(shù)后復(fù)發(fā)率及病死率仍然居高不下，化療藥物出現(xiàn)耐藥性是化療失敗的主要因素，DNA拷貝數(shù)變化、靶蛋白活性改變、DNA修復(fù)能力增強(qiáng)、抗凋亡能力增加等機(jī)制可能參與腫瘤化療耐藥的過(guò)程〔7〕。DDP是第一代鉑類抗腫瘤藥物，是食管癌化療過(guò)程中較為常用的一種藥物，療效確切〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)在兩藥或者三藥聯(lián)合化療時(shí)，加與不加DDP，在療效上存在著顯著差別〔9〕。食管癌患者在臨床化療過(guò)程中常常會(huì)使用DDP作為基礎(chǔ)化療藥物，在長(zhǎng)期使用后也不可避免地出現(xiàn)耐藥性。很多研究都在致力于尋找能夠抑制多藥耐藥基因(MDR)1基因及其蛋白表達(dá)的藥物〔10～13〕。

Fisher等〔14〕報(bào)道干擾Naa10后DNA修復(fù)蛋白(RAD)51表達(dá)下調(diào)，該基因是DNA修復(fù)復(fù)合體的成員之一，在DNA雙鏈損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，因此推測(cè)Naa10可能具有DNA修復(fù)的功能。Arnesen等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)Naa10也可能同時(shí)通過(guò)其他途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物的耐受。在宮頸癌細(xì)胞中，Naa10表達(dá)下調(diào)表達(dá)可以促進(jìn)凋亡，同時(shí)增加細(xì)胞對(duì)化療藥物柔紅霉素的敏感性。上述研究表明，Naa10參與腫瘤耐藥及影響藥物敏感性的過(guò)程。有關(guān)Naa10 在食管癌對(duì)順鉑敏感性的作用機(jī)制尚未見(jiàn)明確報(bào)道。本研究在分子和細(xì)胞層次闡明了下調(diào)Naa10表達(dá)對(duì)食管癌藥物敏感性的調(diào)控。

本研究結(jié)果顯示，DDP作用后，ECA109-siRNA-Naa10組細(xì)胞的 IC50值明顯降低，增加了ECA109細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，這與先前報(bào)道的結(jié)果不盡相同〔15，16〕，可能是因?yàn)镹aa10在不同種類的癌癥的藥物敏感性的影響中存在著不同的生物學(xué)意義。尚有研究〔14,17～19〕表明，Naa10表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能影響不全一致，在部分腫瘤中可以促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，但也有研究認(rèn)為 Naa10能抑制腫瘤增殖〔20〕。不同腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程中Naa10也同樣起雙重作用〔21，22〕。所以Naa10在不同腫瘤中對(duì)化療藥物的作用可能會(huì)表現(xiàn)出不同的敏感性的明確機(jī)制還需要更多的研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，本研究成功構(gòu)建以低表達(dá)Naa10的食管癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)Naa10能夠增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，這對(duì)食管癌耐藥研究鋪墊了基礎(chǔ)，有望對(duì)現(xiàn)有化療方案進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，尤其是在耐藥性產(chǎn)生后發(fā)揮重要作用。