王 雪，楊玉婷，趙立春，廉 潔，趙小峪，高學(xué)旺，高云華,4，張鎖慧,4*

(1. 中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所，北京 100190；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；3. 中國人民公安大學(xué)，北京 100038；4. 中科微針(北京)科技有限公司，北京 102600)

黃褐斑是一種常見的慢性色素沉積性疾病，臨床表現(xiàn)為患者皮膚表面呈對稱性和不規(guī)則的色素沉著棕褐色斑紋[1-2]，目前確切的黃褐斑發(fā)病機(jī)制尚未明確，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃褐斑的病因病機(jī)主要與肝、脾、腎三臟密切相關(guān)[3]。氨甲環(huán)酸(Tranexamic Acid, TA)是一種纖溶酶抑制劑，結(jié)構(gòu)見圖1，其能通過抑制纖維蛋白的溶解發(fā)揮止血功效，常用于預(yù)防和治療出血[4-5]。TA是賴氨酸的合成衍生物，能抑制纖溶酶原激活物(PA)轉(zhuǎn)化為纖溶酶，其機(jī)制是通過與賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)的可逆相互作用競爭性從而抑制PA的激活[6]。從1979年Nijosadako發(fā)現(xiàn)TA能淡化黃褐斑開始,TA便作為一種治療黃褐斑的藥物引起人們關(guān)注[7-8]。

分析生物基質(zhì)中氨甲環(huán)酸的方法最常用的為高效液相色譜法[9-10]，但考慮到TA為末端吸收，其結(jié)構(gòu)中不具有發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，因此常需要衍生化處理以提高檢測靈敏度，無形中繁瑣化了氨甲環(huán)酸分析程序，并且可能造成較大的分析差異。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可獲得高效液相色譜法衍生化后的檢測限，然而所需血漿樣品體積大[11-12]。本工作擬基于色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用[13]，建立簡單、快捷、靈敏度高的分析方法用于測定血漿中TA的含量，并將應(yīng)用于治療黃褐斑的臨床口服TA片劑在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究。

圖1 氨甲環(huán)酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of tranexamic acid

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

UPLC-Q-Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用Dionex Ultimate 3000 RS 快速高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司，配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))；AB1040N分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；MS3渦旋振蕩器(德國 IKA公司)；3K15冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；超低溫冰箱(中科美菱公司產(chǎn)品)；pH酸度計(jì)(杭州市奧立龍有限公司產(chǎn)品)。

1.2 試劑

氨甲環(huán)酸對照品(含量：100%，中國食品藥品檢定研究院)；順式-4-氨基環(huán)己烷羧酸(含量：98%，北京伊諾凱公司產(chǎn)品)；微針制劑(中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所生物材料與應(yīng)用技術(shù)中心研制，批號：20200118)；甲醇(色譜純，百靈威試劑公司)；甲酸銨(色譜級，上海麥克林試劑公司)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(質(zhì)譜級，美國Fisher公司)；超純水(色譜級，美國 Thermo Fisher 公司產(chǎn)品)。

1.3 動物

SPF 級健康 SD 大鼠，雌性，體質(zhì)量為(250±10) g，購買于北京金牧陽動物技術(shù)有限公司。

1.4 LC-MS/MS分析方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Nano Hilic柱(150 mm × 2.1 mm，3 μm)；流動相： 10 mmol/L甲酸銨(pH 3.8)-乙腈(95∶5，體積比)；流速為0.2 mL/min；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2 μL；采集時(shí)間為 2 min；洗針液為50 % 甲醇溶液。

1.4.2質(zhì)譜條件

ESI+離子源，掃描模式為 Targeted-MS2-正離子，檢測離子對分別為 TAm/z158.117 4 → 95.085 9，內(nèi)標(biāo)物(I.S.)m/z144.101 9 → 81.070 4，其他質(zhì)譜方法相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

精準(zhǔn)稱取 TA 標(biāo)準(zhǔn)品100 mg于100 mL 容量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度線，此儲備液的質(zhì)量濃度為1 000 mg/L。再分別精確吸取0.02、0.05、0.15、0.5、1、2、5、7 mL的 TA 儲備液于10 mL容量瓶中，加入流動相定容至刻度，得2、5、15、50、100、200、500、700 mg/L系列 TA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將 TA 系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液再分別用大鼠空白血漿稀釋 10 倍，配制成相當(dāng)于 TA 血漿濃度為0.2、0.5、1.5、5、10、20、50、70 mg/L的加標(biāo)血漿工作液。精密吸取100 μL空白血漿，分別向其加10 μL TA 標(biāo)準(zhǔn)溶液5、50和500 mg/L，配制成相當(dāng)于氨甲環(huán)酸血漿濃度為0.5、5和50 mg/L的低、中、高3個濃度樣品，按“1.6”方法操作得質(zhì)控樣品(quality control， QC)。

稱取10 mg 順式-4-氨基環(huán)己烷羧酸對照品于10 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度；應(yīng)用時(shí)再用流動相稀釋上述溶液至25 mg/L，得內(nèi)標(biāo)溶液。

1.6 血漿樣品的處理

精密吸取100 μL加標(biāo)血漿樣品于1.5 mL離心管中，加入質(zhì)量濃度為25 mg/L 的內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，3 500 r/min渦旋30 s，再加入500 μL甲醇，3 500 r/min渦旋1 min，13 000 r/min離心15 min，取上清液2 μL于裝有潔凈內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中分析測試。

取空白血漿，加入500 μL甲醇，3 500 r/min渦旋1 min，13 000 r/min高速離心15 min。

1.7 穩(wěn)定性考察

1.7.1 樣品的室溫穩(wěn)定性

平行制備3份質(zhì)控樣品(0.5、5、50 mg/L)，于室溫下放置 12 h 后，按照“1.6”樣品處理方法進(jìn)行處理并依“1.4”法進(jìn)行測定，主要考察樣品濃度的變化情況，以此評價(jià)血樣的室溫穩(wěn)定性。

1.7.2 樣品的凍融穩(wěn)定性

平行制備3份質(zhì)控樣品(0.5、5、50 mg/L)，將3 種濃度的質(zhì)控樣品置于-20 ℃低溫冰箱使其充分冷凍，然后再取出至室溫使其融化，重復(fù)3次上述凍融步驟，按照“1.6”樣品處理方法進(jìn)行處理并依“1.4” 法進(jìn)行測定，主要考察測定濃度的變化情況，以此評價(jià)血樣的凍融穩(wěn)定性。

1.7.3 樣品處理后的室溫放置穩(wěn)定性

將低、中、高(0.5、5、50 mg/L)3 種濃度的質(zhì)控樣品按“1.6” 法處理后，將處理后的質(zhì)控樣品轉(zhuǎn)入至潔凈液相進(jìn)樣瓶中，用封口膜依次密封進(jìn)樣瓶瓶口，室溫放置12 h 后進(jìn)樣，以此評價(jià)提取后血漿樣品于室溫放置后的血樣穩(wěn)定性。

1.8 藥代動力學(xué)研究

大鼠于SPF級動物房下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，根據(jù)TA治療黃褐斑的臨床口服單次給藥劑量按照人與大鼠劑量關(guān)系進(jìn)行換算。使用生理鹽水作為溶媒，配制0.9%的TA溶液，使用灌胃針輸送0.5 mL的0.9%TA溶液至大鼠胃部(平行6只)，給藥開始記錄給藥時(shí)間，每只大鼠在給藥前及給藥后預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、3、4、5、6、10、13、16、24、30 h)對大鼠用割尾法進(jìn)行尾靜脈采血，每次采血0.4 mL左右，將收集的大鼠血液置于預(yù)先經(jīng)過抗凝處理的肝素管中，4 ℃、 5 000 r/min下離心15 min，取200 μL上層血漿保存于-20 ℃冰箱中。按照 “1.6” 血漿樣品處理法進(jìn)行血樣處理，并行 “1.4” 法進(jìn)行血漿樣品中 TA 的含量測定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 血漿樣品處理方法優(yōu)化

本文試驗(yàn)了不同蛋白沉淀劑，包含乙腈[14-15]、甲醇[16-18]、高氯酸[19]，對TA血漿樣品的提取效率，經(jīng)比較色譜譜圖觀察甲醇作為沉淀劑對TA的提取效果最佳。本試驗(yàn)也曾嘗試對甲醇處理后的上清液進(jìn)行吹干后流動相復(fù)溶[20]，結(jié)果顯示此前處理方法可極大地提高TA檢測靈敏度，但極易引起基質(zhì)抑制效應(yīng)過大，故綜合考慮本文選擇甲醇作為最終沉淀劑。本文考察了溶劑效應(yīng)對峰型的影響，分別試驗(yàn)了水、流動相、50%甲醇及50%乙腈水作為溶媒對TA及內(nèi)標(biāo)物出峰的影響，結(jié)果顯示含鹽流動相作為溶媒可促進(jìn)目標(biāo)物的電離，獲得更強(qiáng)的信號，起到離子增強(qiáng)作用。同時(shí)可以向流動相中加入甲酸，提高TA與I.S.的離子化強(qiáng)度，并且可以起到改善峰型的作用。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 特異性

分別配制100 μg/L 的TA溶液與內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)樣質(zhì)譜，首先用全掃描(Full scan)模式確定兩種化合物的分子離子峰后，再選用 AIF - MS / MS模式優(yōu)化出TA與I.S. 碰撞能量分別為 20、50 eV，繼而確定出了二者的分子離子峰。TA 和 I.S. 的二級掃描質(zhì)譜圖分別如圖2、圖3所示。其中TA 分子離子峰為m/z158.117 4，以m/z158.117 4為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，圖譜中出現(xiàn)m/z95.080 9；內(nèi)標(biāo)物分子離子峰為m/z144.107 9，以m/z144.107 9為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，圖譜中出現(xiàn)m/z81.070 4。

2.2.2 方法學(xué)專屬性

取大鼠的空白血漿分別配制標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜分析，按照“1.6” 的血樣前處理方法及 “1.4” 的LC- MS / MS分析方法進(jìn)行測定，流動相、空白血漿、空白血漿加標(biāo)樣品及實(shí)際血樣的LC- MS / MS提取離子流色譜圖如圖4所示。圖4中A、B、C、D分別為流動相、大鼠空白血漿、空白血漿加標(biāo)樣品及給藥后大鼠血漿樣品的提取離子流色譜圖。其中1和2分別是TA 的提取離子流色譜圖和 I.S. 的提取離子流色譜圖。在本分析方法中 TA 和 I.S. 的保留時(shí)間分別為 1.72 min 和 1.70 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明TA 和 I.S. 的測定不受血漿中內(nèi)源物質(zhì)干擾，方法的專屬性良好。

圖2 氨甲環(huán)酸分子離子峰Fig.2 Product ion mass spectra of TA

圖3 內(nèi)標(biāo)物分子離子峰Fig.3 Product ion mass spectra of I.S.

圖4 流動相(A)、大鼠空白血漿(B)最小定量限(C)和給藥后大鼠血漿樣品(D)的提取離子流色譜圖，1為 TA ，2為I.S.Fig.4 Extracted ion chromatograms of mobile phases(A) blank rat plasma(B) limit of quantification(LOQ)(C) and rat plasma after TA microneedle are applied(D). 1 is for TA and 2 is for I.S.

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

按照 “1.5” 的方法與 “1.6” 的方法分別配制加標(biāo)血漿工作液并處理，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，以待測物濃度即血漿中 TA 濃度為橫坐標(biāo)，以待測物 TA 與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖 5，線性方程為Y= 0.088 2X+ 0.018 8，R2= 0.999 6，TA 的線性范圍為0.2～70 mg/L，定量下限為 0.2 mg/L，在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve

2.2.4 精密度考察

取空白血漿，配制 TA 低、中、高3個濃度(0.5、5、50 mg/L)的質(zhì)量控制樣品，對每一濃度的5個樣品進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批于1 d內(nèi)和連續(xù)2 d測定，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，再根據(jù)QC濃度結(jié)果與配制的標(biāo)準(zhǔn)濃度作對照，計(jì)算本法的精密度，結(jié)果見表2。血漿中各濃度樣品的RSD在5.5%以下，表明儀器精密度良好。

表2 精密度考察結(jié)果(n=5)

2.2.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿，按 “1.5” 項(xiàng)下方法制備TA低、中、高3個濃度(0.5、5、50 mg/L)的質(zhì)控樣品，對每一濃度的樣品進(jìn)行5個樣本分析，進(jìn)樣2 μL，獲得 TA 相應(yīng)峰面積A1(5次測定的平均值)。

取低、中、高3個濃度(0.5、5、50 mg/L)的 TA 系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液(即100 μL流動相中加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液與10 μL TA標(biāo)準(zhǔn)品溶液)，對每一濃度的樣品進(jìn)行5個樣本分析，進(jìn)樣2 μL，獲得 TA 相應(yīng)峰面積A2(5次測定的平均值)。

照 “1.6” 法處理血漿樣品，吸取100 μL上清液，加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，配制TA低、中、高3個濃度(0.5、5、50 mg/L)的樣品，對每一濃度的樣品進(jìn)行5個樣本分析，進(jìn)樣2 μL，獲得 TA 相應(yīng)峰面積A3(5次測定的平均值)。以A3/A1計(jì)算提取回收率；以A3/A2計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，見表3。結(jié)果可知，TA 的基質(zhì)效應(yīng)在(82.16±15.5)%～(86.47±5.6)%之間，基質(zhì)效應(yīng)不會影響 TA 的測定；TA 的提取回收率在(83.90±12.6)%～(110.20±3.3)%之間。

表3 基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率結(jié)果(n=5)

2.2.6 穩(wěn)定性考察

照“1.7.2” 法考察低、中、高(0.5、5、50 mg/L)3 種濃度質(zhì)控樣品的室溫穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性以及處置后室溫穩(wěn)定性，其結(jié)果見表4。由表4結(jié)果可知，血漿樣品在經(jīng)室溫放置12 h、-20 ℃反復(fù)凍融3次、處理后室溫放置12 h后，血漿中 TA 測定濃度占添加濃度的百分率分別在(89.97±2.3)% ～(102.10±1.1)%、(89.03±3.7)% ～(98.19 ± 0.6)%、(81.60 ± 3.3)% ～(101.16 ± 1.5)%之間，RSD值均小于10%，說明在上述3種條件下樣品的穩(wěn)定性良好。

表4 血漿樣品穩(wěn)定性測試(n=3)

2.3 藥代動力學(xué)研究

照“1.8”法采集血漿樣品并進(jìn)行檢測，以采血時(shí)間為橫坐標(biāo)，以測得的 TA 血藥濃度為縱坐標(biāo)，使用 Origin 8軟件繪制藥時(shí)曲線，計(jì)算最大血藥濃度(Cmax)、達(dá)峰時(shí)間(tmax)以及根據(jù)梯形法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積 AUC。圖6為氨甲環(huán)酸灌胃給藥的藥時(shí)曲線，表5為給藥后的藥代動力學(xué)參數(shù)，在給藥1 h，血漿中TA濃度達(dá)峰值，峰值濃度為(2.52 ± 0.77) mg/L，隨后下降，給藥30 h后，血漿中TA濃度基本已達(dá)檢測定量限，TA的藥時(shí)曲線下面積AUC為(18.8 ± 10.38) mg·h/L，說明該方法成功應(yīng)用于TA在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。

圖6 TA經(jīng)大鼠灌胃后的血藥濃度-時(shí)間曲線圖Fig.6 Blood concentration-time graph of TA after gavage in rats

表5 給藥后大鼠血漿TA的藥代動力學(xué)參數(shù)(n=6)

3 結(jié)論

建立了可以用于血漿中TA含量測定，簡便快捷、專屬性強(qiáng)的UPLC-MS/MS分析方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定性、專屬性良好，精密度和提取回收率符合要求，而且該方法比現(xiàn)有的高效液相色譜法精密度更好。分析方法經(jīng)過完整驗(yàn)證后，成功應(yīng)用于TA血漿樣品的分析，并且報(bào)道了用于治療黃褐斑的TA口服制劑在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究，以期為TA治療黃褐斑的臨床應(yīng)用提供一定的參考。