劉開放 劉立明

CO是地球上最主要的溫室氣體，但同時(shí)也是自然界最為豐富的碳一資源（如CO、甲酸、甲醇等含有一個(gè)碳原子的物質(zhì)，可當(dāng)作資源被利用）。因此，若能發(fā)展高效的CO捕集和轉(zhuǎn)化技術(shù)，將其轉(zhuǎn)化成酯、醇、醚、酸等具有高應(yīng)用價(jià)值和高經(jīng)濟(jì)效益的化學(xué)產(chǎn)品，溫室效應(yīng)等問題或?qū)㈦S之得到改善。

CO捕集和轉(zhuǎn)化技術(shù)可分為物理、化學(xué)和生物3種。物理固定技術(shù)是對(duì)CO進(jìn)行分離、收集和濃縮，再將其輸送至地下或深海中實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)存，但很容易受地殼運(yùn)動(dòng)的影響，繼而發(fā)生CO泄漏，造成新的生態(tài)問題?；瘜W(xué)固定方法則是以CO為底物生產(chǎn)化工產(chǎn)品，或?qū)⑵洳迦牖瘜W(xué)鍵中制備有機(jī)物，然而該過程會(huì)消耗大量的試劑，并產(chǎn)生多種新的副產(chǎn)物。而通過模擬植物光合作用開發(fā)的微生物細(xì)胞捕集和轉(zhuǎn)化CO的技術(shù)體系，具有運(yùn)行成本低、安全性高等特點(diǎn)，為CO高效封存提供了一種可持續(xù)發(fā)展的新方法。但要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，核心在于改造微生物，進(jìn)而直接利用CO和光能合成高值化學(xué)品，為此需要解決兩個(gè)關(guān)鍵的科學(xué)問題：如何設(shè)計(jì)高效的CO固定途徑，如何為CO固定提供充足的能量。

自然界存在著兩大類固定CO的微生物，一類是自養(yǎng)型，另一類是異養(yǎng)型。

自養(yǎng)型固碳微生物具有完善的能量捕獲系統(tǒng)，能利用CO為唯一碳源生長(zhǎng)。根據(jù)能量捕獲途徑的不同，自養(yǎng)型微生物又可分為光能自養(yǎng)型和化能自養(yǎng)型。

光能自養(yǎng)型主要是微藻類、光合細(xì)菌和藍(lán)藻等。其中，微藻的光能利用率可達(dá)10%～15%，每年可固定全球40%以上的CO，在碳循環(huán)中發(fā)揮重要作用；光合細(xì)菌能將CO轉(zhuǎn)化為多種化合物，模式菌株包括類球紅細(xì)菌、莢膜紅菌和沼澤紅假單胞菌等，每克菌體在單位小時(shí)內(nèi)的固碳量可達(dá)12.4 毫克；藍(lán)細(xì)菌具有較強(qiáng)的光合系統(tǒng)，能吸收廣泛的太陽(yáng)光波長(zhǎng)，光能利用率可達(dá)10%以上，是陸生植物的10倍，模式菌株包括聚球藻、魚腥藻和集胞藻等。

化能自養(yǎng)型微生物，如鐵細(xì)菌、一氧化碳細(xì)菌、硫氧化細(xì)菌和硝化細(xì)菌等，則是通過氧化亞鐵化合物、硫化氫、亞硝酸鹽等有機(jī)物產(chǎn)生電子，再經(jīng)過電子傳遞鏈產(chǎn)生三磷酸腺苷和還原態(tài)輔酶Ⅰ，驅(qū)動(dòng)CO固定。

異養(yǎng)型固碳微生物主要利用自身的固碳酶來固定CO，具有生長(zhǎng)速度快、易放大和遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)?？茖W(xué)家們?cè)?0世紀(jì)初就發(fā)現(xiàn)了戊糖丙酸桿菌中存在固碳途徑，隨后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、釀酒酵母和谷氨酸棒狀桿菌等都具有一定的固碳能力。但是，天然異養(yǎng)微生物存在固碳效率低、能量供應(yīng)不足等缺點(diǎn)，導(dǎo)致難以大規(guī)模應(yīng)用。因此，通過合成生物學(xué)的技術(shù)手段改造異氧微生物，能顯著提升其固碳能力，如工程化改造大腸桿菌BL21（DE3），可使其固碳效率與藍(lán)藻相當(dāng)；通過代謝工程改造釀酒酵母YSX4C222，可將固碳效率提高75倍。由此可見，微生物展現(xiàn)出強(qiáng)大的固碳潛力，在CO利用方面大有可為。

科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微生物中存在7條天然固碳途徑，根據(jù)代謝特點(diǎn)和固碳種類可分為三大類。

第一類是磷酸戊糖途徑相關(guān)的卡爾文循環(huán)。CO進(jìn)入該循環(huán)，在酶和能量的催化驅(qū)動(dòng)下形成糖。雖然它是最普遍的固碳途徑，但關(guān)鍵酶二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）存在效率低和易發(fā)生副反應(yīng)等缺點(diǎn)。近幾年來，隨著關(guān)鍵酶Rubisco晶體結(jié)構(gòu)被解析，結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬和蛋白質(zhì)改造策略，能顯著提高其催化性能。2019年，這一途徑被引入大腸桿菌中，獲得了能同時(shí)利用CO和木糖的工程菌，隨后利用適應(yīng)性進(jìn)化的方法，逐步消除工程菌對(duì)木糖的依賴，得到了僅利用CO為唯一碳源就能生長(zhǎng)的自養(yǎng)菌[3]。

第二類是直接還原CO的還原乙酰輔酶A途徑和還原性甘氨酸途徑。它們都是首先將一部分CO還原為甲酸，然后再同化另一部分CO生成碳二化合物（如乙醇、乙醛和乙酸等含有兩個(gè)碳原子的化合物）。但還原乙酰輔酶A途徑是厭氧途徑，限速酶分別是甲酸脫氫酶、一氧化碳脫氫酶和呋喃脫氫酶；而還原性甘氨酸途徑則是耐氧途徑，限速酶是甘氨酸裂解酶復(fù)合體。

第三類是靠近碳中心代謝的4條固碳循環(huán)途徑：①能同時(shí)固定CO和HCO3？的二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)。它們先通過丙酮酸合酶固定1摩爾CO，再通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶固定1摩爾HCO3？。由于其限速酶4-羥基丁酰輔酶A脫水酶中含有氧不穩(wěn)定的鐵硫中心，所以為厭氧途徑；②僅固定HCO3？的3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán) 和3-羥基丙酸循環(huán)。它們具有高耗能、長(zhǎng)路徑的特點(diǎn)，可通過乙酰輔酶A和丙酰輔酶A羧化酶固定HCO3？；③僅固定CO的還原三羧酸循環(huán)。含有3種不可逆的酶：富馬酸還原酶、2-酮戊二酸合成酶和檸檬酸合成酶，其中，2-酮戊二酸合成酶是重要的固碳元件。該途徑為低耗能的耐氧途徑，能利用光能使每個(gè)循環(huán)固定CO。

上述7條天然路徑由于反應(yīng)復(fù)雜、效率較低等原因，難以滿足實(shí)際需求。因此科學(xué)家們開始設(shè)計(jì)和構(gòu)建人工固碳途徑：①理論設(shè)計(jì)。借助生物信息學(xué)和基因組網(wǎng)絡(luò)模型，通過計(jì)算路徑反應(yīng)的自由能、熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)等，評(píng)估路徑可行性。②固碳元件選取。從BRENDA、KEGG和UNIPORT等數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘固碳路徑中的固碳羧化酶和固碳還原酶，并進(jìn)行生物化學(xué)和酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定。③固碳元件改造。通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，確定固碳路徑的限速酶，并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，提高固碳效率。④固碳路徑構(gòu)建。將最優(yōu)固碳元件進(jìn)行體內(nèi)組裝和優(yōu)化，提高固碳途徑的效率。

根據(jù)這些原則，國(guó)外科學(xué)家們以羧化酶為起點(diǎn)，篩選了17個(gè)固碳元件，構(gòu)建了能量消耗減少40%而CO轉(zhuǎn)化速率可提高兩倍的循環(huán)途徑。另有國(guó)內(nèi)學(xué)者設(shè)計(jì)了一個(gè)可以在厭氧和50℃條件下固定CO的簡(jiǎn)易人工固碳循環(huán)（POAP循環(huán)），其反應(yīng)過程僅需4種酶，實(shí)現(xiàn)了高效固碳。此外，還有研究者借助計(jì)算機(jī)輔助挖掘，設(shè)計(jì)了新型固碳途徑，用于改善大腸桿菌的生長(zhǎng)。為了將人工途徑與微生物生產(chǎn)相偶聯(lián)，筆者團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中設(shè)計(jì)和構(gòu)建了一條產(chǎn)生ATP的蘋果酸合成途徑（PCK途徑），通過耦合耗能的CO固定途徑和產(chǎn)能的PCK途徑，開發(fā)了能量平衡的蘋果酸合成系統(tǒng)，使CO固定率提高了870%，蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到387毫摩爾每升[4]。

除了構(gòu)建人工固碳途徑外，給予充足的能量供應(yīng)也是提高微生物固碳效率的關(guān)鍵瓶頸。為此，科學(xué)家們借助合成生物學(xué)的技術(shù)策略，分別針對(duì)自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物發(fā)明了多種供能方法，以此提升CO的固定效率[6]。

對(duì)于光能自養(yǎng)型微生物，可通過改造捕光天線核心蛋白和構(gòu)建新型納米材料組成的捕光系統(tǒng)，增強(qiáng)光合作用的半飽和強(qiáng)度和光子捕獲能力，提高光子轉(zhuǎn)換為質(zhì)子和電子的能力，促進(jìn)能量產(chǎn)生。而對(duì)于化能自養(yǎng)微生物，主要通過改造膜相關(guān)氧化還原蛋白，如MtrB和CymA，以及過表達(dá)銅藍(lán)蛋白等無機(jī)氧化酶，來提高電子產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移的效率，獲得能量供應(yīng)。對(duì)于電自養(yǎng)微生物（利用電能驅(qū)動(dòng)碳固定，滿足自身生長(zhǎng)需要的微生物），則主要通過優(yōu)化陰極電極的結(jié)構(gòu)或開發(fā)鈷磷合金或者銦箔等無機(jī)陰極催化劑，促進(jìn)電子捕獲并介導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移到微生物細(xì)胞中，強(qiáng)化能量產(chǎn)生。

異養(yǎng)微生物的能量主要來自有機(jī)物的分解代謝，因此，“開源節(jié)流”是提高能量供應(yīng)的有效方法。研究者可通過提高底物水平磷酸化、增加胞內(nèi)還原態(tài)輔酶Ⅰ供應(yīng)和提高電子傳遞鏈產(chǎn)能效率等強(qiáng)化本源供能系統(tǒng)的策略，或者引入異源代謝途徑、開發(fā)電化學(xué)系統(tǒng)和構(gòu)建生物—雜合系統(tǒng)等外源能量供應(yīng)系統(tǒng)來進(jìn)行“開源”。筆者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了自組裝硫化鎘捕光系統(tǒng)并應(yīng)用于大腸桿菌中，在藍(lán)光照射下，胞內(nèi)還原態(tài)輔酶Ⅰ的含量提高62%，進(jìn)而顯著提升了CO的固定效率[7]。此外，“節(jié)流”能最大限度地減少非必需反應(yīng)的能量消耗，包括用能耗少的代謝途徑替代耗能高的代謝途徑、抑制或者阻斷耗能副產(chǎn)物的形成、刪除非必需基因等，減少不必要的能量消耗，為異養(yǎng)微生物固定CO提供足夠的能量供應(yīng)。也有研究通過刪除調(diào)控大腸桿菌鞭毛運(yùn)動(dòng)的62個(gè)基因，減少了大約20%的能量消耗，提高了CO的固定效率[8]。

微生物生產(chǎn)具有占地少、易控制和單位面積產(chǎn)能高等顯著優(yōu)勢(shì)。借助合成生物學(xué)方法在微生物中構(gòu)建的高效固定CO細(xì)胞“工廠”，可將CO轉(zhuǎn)化為淀粉、蛋白質(zhì)、燃料和材料單體等高價(jià)值產(chǎn)品，正所謂是小個(gè)頭、多功能、大產(chǎn)業(yè)。

合成淀粉

植物通過光合作用固定CO生產(chǎn)淀粉的路徑涉及60余步代謝反應(yīng)，理論轉(zhuǎn)化率僅為2%左右。我國(guó)科學(xué)家們從頭設(shè)計(jì)，構(gòu)建了由四大模塊涉及11步反應(yīng)的人工淀粉合成代謝途徑（artificial starch anabolic pathway， ASAP），首次實(shí)現(xiàn)了從CO到淀粉分子的全合成。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，人工合成的淀粉分子與天然淀粉分子的結(jié)構(gòu)組成一致。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果顯示，人工合成淀粉的效率約為傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)淀粉的8.5倍。在充足能量供給的條件下，按照目前技術(shù)參數(shù)，理論上1噸發(fā)酵罐年生產(chǎn)淀粉總量相當(dāng)于我國(guó)5畝（1畝=666.7平方米）玉米地的年產(chǎn)淀粉量[9]。

合成蛋白質(zhì)

當(dāng)前，利用微生物固定CO合成蛋白質(zhì)領(lǐng)域已有了長(zhǎng)足進(jìn)展。有研究院校同企業(yè)合作，突破了自然光合固碳的限制，以鋼鐵廠、電廠含CO和CO的尾氣及氨水為原料，經(jīng)乙醇梭菌發(fā)酵、離心、干燥后獲得了一種新型乙醇梭菌蛋白質(zhì)。其粗蛋白含量超過80%，必需氨基酸含量及其結(jié)構(gòu)比例接近魚粉蛋白，優(yōu)于豆粕蛋白。目前，這一技術(shù)已實(shí)現(xiàn)萬噸級(jí)蛋白產(chǎn)能，開辟了一條“低成本、非傳統(tǒng)動(dòng)植物資源生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)”的新途徑。如果能在我國(guó)更多的鋼鐵企業(yè)、石化企業(yè)和煤炭加工廠推廣應(yīng)用，將是一場(chǎng)有效促進(jìn)碳循環(huán)、碳利用和碳捕集的碳革命。

合成燃料

為了供應(yīng)充足的燃料，科學(xué)家們已開發(fā)出利用微生物固定CO生產(chǎn)乙醇和生物柴油等燃料的技術(shù)。如在利用釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過程中，每生成1分子乙醇就會(huì)釋放1分子CO，造成大量碳損失。為此，科學(xué)家們將異源的磷酸核酮糖激酶和二磷酸核酮糖羧化酶導(dǎo)入釀酒酵母中構(gòu)建卡爾文循環(huán)來固定CO，使乙醇產(chǎn)量提高了25%以上[10]。此外，研究者還將微藻置于生物反應(yīng)器中，其吸收陽(yáng)光和CO后可生成微藻生物質(zhì)，經(jīng)過加工轉(zhuǎn)化成的生物柴油，熱值是木材和農(nóng)作物秸稈的1.5倍。

合成生物可降解塑料單體

通過代謝工程改造微生物，能替代石油路徑合成生物可降解材料單體[11]。如琥珀酸是生物可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯（PBS）的重要組成成分，年需求量超過300萬噸。筆者團(tuán)隊(duì)借助合成生物學(xué)的方法，在高產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌中引入高效的CO捕集元件、CO轉(zhuǎn)化路徑和光能驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，構(gòu)建了高效利用CO生產(chǎn)琥珀酸的碳負(fù)性細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了從化學(xué)工藝每生產(chǎn)1噸琥珀酸釋放1.66 噸CO，到每生產(chǎn)1噸琥珀酸吸收1.63噸CO的轉(zhuǎn)變，開辟了溫室氣體利用的新途徑。

綜上所述，通過解析微生物濃縮和捕集CO的分子機(jī)理，理性設(shè)計(jì)高效的CO固定途徑，構(gòu)建新型能量供應(yīng)系統(tǒng)，創(chuàng)制捕獲CO轉(zhuǎn)化生產(chǎn)有規(guī)?；袌?chǎng)需求的燃料、化工產(chǎn)品或建筑材料的“碳負(fù)性”人工細(xì)胞，是建立以CO為原料的工業(yè)生物轉(zhuǎn)化新路線，減少對(duì)石油資源和耕地需求，縮短工藝流程，降低生產(chǎn)成本，有助于我國(guó)在新一輪國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中贏得先機(jī)的重要策略，為實(shí)現(xiàn)“碳達(dá)峰”“碳中和”的目標(biāo)提供微生物解決方案。

[本文相關(guān)研究受江蘇省前沿引領(lǐng)技術(shù)基礎(chǔ)研究專項(xiàng)（BK20212013）資助。]

[1]Liu Z， Wang K， Chen Y， et al. Third-generation biorefineries as the means to produce fuels and chemicals from CO. Nature Catalysis， 2020， 3（3）： 274-288.

[2]Liang B， Zhao Y， Yang J. Recent advances in developing artificial autotrophic microorganism for reinforcing CO fixation. Frontiers in Microbiology， 2020， 11（6）： 542-556.

[3]Gleizer S， Ben-Nissan R， Bar-On Y M， et al. Conversion of Escherichia coli to generate all biomass carbon from CO. Cell， 2019， 179（6）： 1255-1263.

[4]Hu G， Zhou J， Chen X， et al. Engineering synergetic CO-fixing pathways for malate production. Metabolic engineering， 2018， 47： 496-504.

[5]Schwander T， von Borzyskowski L S， Burgener S， et al. A synthetic pathway for the fixation of carbon dioxide in vitro. Science， 2016， 354（6314）： 900-904.

[6]Wu H， Li Y， Ma Q， et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for high-yield uridine production. Metabolic engineering， 2018， 49： 248-256.

[7]Hu G， Li Z， Ma D， et al. Light-driven CO sequestration in Escherichia coli to achieve theoretical yield of chemicals. Nature Catalysis， 2021， 4（5）： 395-406.

[8]Qiao J， Tan X， Huang D， et al. Construction and application of an Escherichia coli strain lacking 62 genes responsible for the biosynthesis of enterobacterial common antigen and flagella. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2021， 69（14）： 4153-4163.

[9]Cai T， Sun H， Qiao J， et al. Cell-free chemoenzymatic starch synthesis from carbon dioxide. Science， 2021， 373（6562）： 1523-1526.

[10]Li Y J， Wang M M， Chen Y W， et al. Engineered yeast with a CO-fixation pathway to improve the bio-ethanol production from xylose-mixed sugars. Scientific Reports， 2017， 7（5）： 384-396.

[11]Meng J， Wang B， Liu D， et al. High-yield anaerobic succinate production by strategically regulating multiple metabolic pathways based on stoichiometric maximum in Escherichia coli. Microbial Cell Factories， 2016， 15（1）： 141-148.

關(guān)鍵詞：微生物 固碳 溫室氣體 碳中和 ■