姜 偉，薛國萍，白紅梅，杜金偉，朱春俠，李 杰，宋慶成，季淑麗，王黎勝

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.赤峰市農(nóng)牧科學研究院，內(nèi)蒙古赤峰 024031；3.寧城縣農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古寧城 024200；4.呼倫貝爾市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古海拉爾 021000）

黃瓜（Cucumis sativusL.）是我國設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要的蔬菜作物之一，然而隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；M一步發(fā)展，許多地方出現(xiàn)了種植模式單一、黃瓜連作障礙嚴重的問題，造成土壤微生物多樣性下降、養(yǎng)分失衡、土傳病害嚴重、土壤微環(huán)境惡化，導致黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)下降[1-4]。連作障礙已成為制約設(shè)施農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題，因此，通過改變種植模式，創(chuàng)新種植技術(shù)，改善連作土壤環(huán)境，已成為設(shè)施黃瓜可持續(xù)發(fā)展亟待解決的問題。克服連作障礙的措施較多，高溫悶棚、季節(jié)填閑、秸稈還田、使用微生物菌肥、石灰氮土壤熏蒸消毒等均是促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要管理措施。高溫悶棚可改善土壤養(yǎng)分含量，顯著提高細菌和放線菌的含量，降低土傳病害病原菌，增加作物產(chǎn)量[5]。以小麥作為填閑作物是目前蔬菜研究中最優(yōu)的填閑方式，能夠減緩土壤中氮和鉀的富集且具有溶磷作用，可以有效緩解土壤次生鹽漬化[6]；玉米秸稈還田通過改善土壤團聚體結(jié)構(gòu)，不僅能夠提高土壤有機質(zhì)含量、豐富土壤中微生物數(shù)量、增加微生物活性與多樣性，還可以提高作物產(chǎn)量[7]；微生物菌肥能夠增加土壤微生物多樣性，降低病原菌和真菌數(shù)量，提高植物的抗逆抗病能力[8]；石灰氮是一種高效的土壤消毒劑，對土傳病害防治效果顯著[9]，對枯萎病的防治也具有一定效果[10]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最為活躍的部分，在維持生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用[11-12]，土壤中的微生物數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)與土壤質(zhì)量密切相關(guān)，均能作為判斷土壤健康狀況的重要指標[13-14]。細菌是土壤中數(shù)量最豐富、分布最廣泛的微生物類群，參與土壤養(yǎng)分循環(huán)等生物化學過程，對于保持土壤健康具有重要的作用。

本試驗以黃瓜連作12年的土壤為研究對象，在夏季休閑期進行高溫悶棚的基礎(chǔ)上，分別進行秸稈還田、小麥填閑、添加有益微生物菌肥、石灰氮消毒的4 種土壤處理，研究不同處理對黃瓜連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性的影響，從而評價不同處理措施對黃瓜連作的改良效果，為設(shè)施土壤健康保持和可持續(xù)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2020年在內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市寧城縣大雙廟鎮(zhèn)巴里營子村（N：41°16′17″～41°57′53″，E：118°21′26″～119°55′25″）進行，該地區(qū)平均海拔920 m，年平均氣溫7 ℃，年平均日照時數(shù)2 700 h，全年無霜期130～145 d，年平均降水量350～450 mm。試驗地種植黃瓜的年限為2008—2020年，采用一年一大茬栽培方式，每年9月中旬至10月初定植，次年6月初拉秧清棚。

1.2 試驗材料

供試材料為黃瓜連作12年的日光溫室0～15 cm土層土壤，有機質(zhì)含量25.00 g/kg、全氮含量1.47 g/kg、全磷含量1.10 g/kg、全鉀含量2.39%、水解性氮含量96.00 mg/kg、速效磷含量170.50 mg/kg、速效鉀含量199.00 mg/kg、pH 值8.36、電導率14.30 mS/m。

1.3 試驗設(shè)計和樣品采集

1.3.1 試驗設(shè)計

在夏季休閑季節(jié)，前茬黃瓜清理后，2020年7月20日—8月20日高溫悶棚。試驗設(shè)置4 個處理，每個處理30 m2，重復3 次。處理1：玉米秸稈還田（C1），高溫悶棚時，將已經(jīng)腐熟好的玉米秸稈撒入試驗區(qū)，施腐熟秸稈7 500 kg/hm2；處理2：小麥填閑（C2），高溫悶棚結(jié)束后，撒播小麥種子75～150 kg/hm2，當小麥幼苗生長至15～20 cm 時，隨著翻地一起翻入土壤；處理3：添加抗重茬生物菌肥（C3），高溫悶棚結(jié)束后，起壟定植時，隨著有機肥一起施入，施用量為30 kg/hm2，施用方法為拌細砂均勻撒施；處理4：石灰氮消毒（C4），高溫悶棚時，地面均勻撒施石灰氮，用量1 200～1 500 kg/hm2，澆透水，覆蓋薄膜，進行熏蒸消毒；對照（CK）為黃瓜連作12年土壤。

1.3.2 土樣采集

在前茬黃瓜拉秧前（2020年4月22日）以及不同處理后（2020年9月11日）取土樣。各處理隨機收集黃瓜根際土壤，土壤樣品的采集采用抖根法[15]。

每個處理隨機取5 個樣點進行混合，3 次重復。土樣保存在-80 ℃冰箱中，用于土壤細菌的測定。

1.4 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和生物信息學分析

1.4.1 基因組DNA 提取

采用試劑盒提取土樣的基因組DNA，之后利用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000 超微量分光光度計檢測DNA 的質(zhì)量和純度。

1.4.2 PCR 擴增及建庫

提取樣品總DNA 后，以基因組DNA 為模板，使用帶barcode 的特異引物343F（TACGGRAGGCAGCAG）和798R（AGGGTACTAATCCT）對細菌V3～V4 可變區(qū)進行PCR 擴增。擴增程序為預變性：94 ℃5 min；26 個循環(huán)（變性：94 ℃30 s，退火：56 ℃30 s，延伸：72 ℃20 s）；72 ℃穩(wěn)定延伸5 min，最后在4 ℃條件下保存。對PCR 擴增產(chǎn)物進行電泳檢測、磁珠純化，二輪擴增后，純化的PCR 產(chǎn)物進行Qubit 定量，混樣并上機測序。建庫測序及數(shù)據(jù)分析由上海市歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成。

1.4.3 生物信息分析及數(shù)據(jù)處理

高通量測序分析步驟如下：雙端序列采用Trimmomatic 軟件進行去雜質(zhì)[16]；使用FLASH 軟件拼接去雜后的雙端系列[17]；利用UCHIME 檢測并去除序列中的嵌合體序列；得到的優(yōu)質(zhì)序列，采用Vsearch軟件[15]，根據(jù)序列的相似性，將序列歸為多個OTU；使用QIIME 軟件包[18]，以Silva（version132）數(shù)據(jù)庫比對進行數(shù)據(jù)注釋，物種對比注釋使用RDPclassifier 軟件[19]。在QIIME（multiple_rarefactions.py）中計算細菌α 多樣性和β 多樣性；使用R 3.5.1 軟件包進行PCoA、Adonis 和LEfSe 分析；使用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，使用Duncan 新復極差法進行差異顯著性分析（One-way ANOVA，P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對黃瓜連作土壤微生物的測序結(jié)果分析

由圖1 可知，各處理稀釋曲線接近平緩，表明土壤微生物細菌群落測序數(shù)據(jù)量充足，能夠最大限度地反映各處理樣品信息，測序可信度較高，可以用來研究細菌的群落結(jié)構(gòu)。

圖1 不同處理樣本中OTU 數(shù)的稀釋曲線

2.2 不同處理對黃瓜根際土壤細菌群落豐富度和多樣性的影響

2.2.1 不同處理對黃瓜根際土壤OTU 數(shù)的影響

由圖2 可知，各處理共享的OTU 數(shù)量為1 157，C1～C4 處理特有的OTU 數(shù)目分別為1 069、769、830、1 045。與CK 相比，分別降低了55.05%、67.66%、65.10%、56.06%，表明不同處理均降低特有微生物種類。

圖2 不同處理下黃瓜連作土壤共有和特有的OUT 數(shù)目Venn 圖

2.2.2 不同處理對黃瓜連作土壤細菌群落α 多樣性的影響

由表1 可知，不同處理改變了微生物群落物種豐富度指數(shù)（Chao1）及多樣性指數(shù)（Simpson、Shannon-Wiener）。與CK 相比，不同處理均增加豐富度指數(shù)（Chao1），C1 ～C4 處理，分別增加了29.60%、16.18%、25.43%、10.51%，C1、C3 處理顯著高于CK（P<0.05），不同處理物種豐富度指數(shù)（Chao1）依次為C1>C3>C2>C4。不同處理均增加Simpson 多樣性指數(shù)，與CK 相比，C1、C3 處理分別增加了3.90%、3.75%，差異顯著（P<0.05）；C2、C4 處理分別增加了2.59%、2.83%，差異不顯著（P>0.05）。不同處理對Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)的影響為C1、C3 處理較CK 分別增加了8.90%、8.54%，差異不顯著（P>0.05）；C2、C4 分別降低了3.37%、5.05%，差異不顯著（P>0.05）。上述結(jié)果表明，不同處理改變了黃瓜連作土壤根際微生物α 多樣性。

表1 不同處理條件下黃瓜連作土壤細菌α 多樣性指數(shù)的變化

2.2.3 不同處理對黃瓜連作土壤細菌群落β 多樣性的影響

主坐標軸分析（principal co-ordinates analysis），可以反映不同處理間群落組成相似性和差異性。處理間距離越近，群落組成越相似，相反，群落結(jié)構(gòu)差異越大[20]。對土壤處理前后不同土壤細菌進行主坐標軸分析（PCoA），使用Bray-Crrtis 距離算法，同時經(jīng)Adonis 統(tǒng)計學軟件分析處理間的差異顯著性。由圖3 可知，不同處理間的黃瓜連作土壤微生物群落差異極顯著（P<0.01）。不同處理主成分PC1 為27.62%，主成分PC2 為21.72%，主成分PC3 為9.12%，累積貢獻率為58.46%。各處理均與CK 相距較遠，表明不同處理對黃瓜連作土壤細菌群落結(jié)構(gòu)造成的影響較大。

圖3 不同處理對黃瓜連作土壤細菌群落結(jié)構(gòu)主坐標（PCoA）分析

2.3 不同處理對黃瓜連作土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 不同處理對黃瓜連作土壤細菌門水平群落結(jié)構(gòu)的影響

在不同處理及CK 的土壤細菌群落中觀察到36 個門，各處理相對豐度排序前15 的細菌門分布見圖4。各處理中，相對豐度大于1.00%的細菌菌門為變形菌門（Proteobacteria）、 擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria），相對豐度分別為36.10%～55.53%、10.59%～35.41%、4.68%～8.15%、3.56%～22.45%、3.12%～13.58%、0.81%～2.90%，變形菌門相對豐度最高。不同處理沒有改變門水平多樣性，但不同處理細菌門所占比例存在差異。與CK 相比，4 種處理均增加了放線菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門的相對豐度，降低了變形菌門、酸桿菌門的相對豐度。C1、C2、C3 處理與CK 相比，擬桿菌門相對豐度分別增加了23.5、19.60、23.30 個百分點；C2、C4處理顯著增加了放線菌門、芽單孢菌門的相對豐度，放線菌門分別增加了9.46、8.95 個百分點，芽單胞菌門分別增加了5.2，18.89 個百分點。對于其他菌門，C3 處理顯著增加了疣微菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度，不同處理均增加了梭桿菌門的相對豐度。C2、C4 處理顯著降低變形菌門和酸桿菌門的相對豐度，變形菌門分別降低了19.43、16.59 個百分點，酸桿菌門分別降低了1.84、2.09 個百分點。

圖4 不同處理對黃瓜連作土壤細菌在門水平上的優(yōu)勢物種相對豐度

2.3.2 不同處理對黃瓜根際土壤細菌屬水平群落結(jié)構(gòu)的影響

在細菌群落中觀察到1 158 個屬，各處理相對豐度排序前15 的細菌屬分布見圖5。細菌群落中平均相對豐度超過1.00%的細菌屬分別為類固醇桿菌屬（Steroidobacter）、Chryseolinea、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、熱多孢菌屬（Thermopolyspora）、熱單孢菌屬（Thermomon ospora）、黃異桿菌屬（Flavisolibacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）。與CK 相比，熱多孢菌屬、熱單孢菌屬為新增菌屬，C2 處理顯著增加了熱單孢菌屬相對豐度，增加了1.97 個百分點；C4 處理顯著增加了熱多孢菌屬相對豐度，增加了2.22 個百分點。不同處理不同程度地改變了優(yōu)勢菌屬的相對豐度，與CK相比，C2 處理顯著增加了類固醇桿菌屬相對豐度，增加了5.57 個百分點；C1、C3 處理顯著增加了Chryseolinea、纖維弧菌屬、黃異桿菌屬相對豐度，分別增加了3.57、2.67、2.70 個百分點和2.77、1.83、2.32 個百分點；各處理均顯著降低了雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）相對豐度，分別降低了2.58、2.54、2.57、2.52 個百分點。其他菌屬，與CK 相比，C1 處理顯著增加了農(nóng)研絲桿菌屬（Niastella）相對豐度；C3處理顯著增加了黃桿菌屬相對豐度；C4 處理顯著增加了不動桿菌屬（Acidibacter）相對豐度，降低了芽單胞菌屬（Gemmatimonas）相對豐度。

圖5 不同處理對黃瓜連作土壤細菌在屬水平上的優(yōu)勢物種相對豐度

2.3.3 不同處理對黃瓜連作土壤優(yōu)勢菌群門水平和屬水平組間差異性的影響

基于LEfSe 分析，不同處理中共得到46 個差異物種。其中，C4 處理差異物種最多，有16 個差異物種，其次是C2、C1、C3、CK 處理，分別有10、9、6、5 個。各處理均在LDA≥4 水平下差異顯著，在C1 處理，擬桿菌門（Bacteroidetes）、Chyseolinea差異顯著；C2 處理，熱單胞菌屬（Thermomonospora）差異顯著；C3 處理，纖維弧菌屬（Cellvibrio）差異顯著；C4 處理，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）差異顯著（圖6）。

圖6 不同處理對黃瓜連作土壤細菌的LEfSe 分析

3 結(jié)論與討論

不同的土壤改良措施對土壤細菌多樣性及群落組成有不同的影響[21－23]。Chao1 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Shannon-Wiener 指數(shù)用于評價細菌群落的豐富度和多樣性，多樣性指數(shù)越高表明細菌群落的豐富度和多樣性越高[24]。本試驗中，與CK 相比，秸稈還田（C1）、小麥填閑（C2）、添加抗重茬生物菌肥（C3）及石灰氮消毒土壤（C4）處理均顯著影響細菌群落多樣性，以秸稈還田、添加抗重茬生物菌肥處理的多樣性指數(shù)最高。主坐標（PCoA）分析和線性判別（LEfSe）分析均表明，不同處理改變了黃瓜連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其組成。

本試驗中，不同處理沒有改變細菌門水平的群落組成，但改變了屬水平的群落組成。在門水平，不同處理顯著增加或降低了菌群的相對豐度；不同處理均增加了擬桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門的相對豐度，秸稈還田、小麥填閑、添加抗重茬生物菌肥處理顯著增加擬桿菌門相對豐度，小麥填閑、石灰氮消毒土壤處理顯著增加放線菌門和芽單胞菌門的相對豐度。不同處理均降低變形菌門、酸桿菌門的相對豐度，與羅俊等[25]在不同改良措施甘蔗土地上的應(yīng)用結(jié)果相似。本試驗中，小麥填閑、石灰氮消毒土壤處理顯著降低變形菌門的相對豐度，添加抗重茬生物菌肥、石灰氮消毒土壤處理顯著降低酸桿菌門的相對豐度。有研究表明，擬桿菌門為富營養(yǎng)菌，相對豐度與有機質(zhì)含量呈正相關(guān)[26－27]。放線菌門細菌多為腐生菌，有利于土壤中動物和植物（纖維素和木質(zhì)素）殘體的分解[28]。芽單胞菌門是植物促生菌，對植物生長具有促進作用[29]。酸桿菌門常作為貧瘠土壤環(huán)境指標，相對豐度與土壤質(zhì)量呈負相關(guān)[30－31]。本試驗中，酸桿菌門的降低，擬桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門的增加表明不同處理均改善了土壤質(zhì)量。變形菌門作為優(yōu)勢菌門顯著降低，其原因可能是當?shù)厥┓柿晳T所致，當?shù)攸S瓜栽培以磷肥作為底肥及追肥使用過量，使得土壤積累磷肥含量多，磷肥以難以被利用的無機磷和大分子有機磷形式存在，不同處理可能增加了可吸收利用的磷素形態(tài)，導致土壤pH 值增加。已有研究得出，小麥填閑顯著提高了土壤pH 值[32]，石灰氮消毒土壤處理后，非根際土壤pH 值提高[33]。

在屬分類水平上，不同處理下，熱多孢菌屬（Thermopolyspora）、熱單孢菌屬（Thermomonospora）為新增菌屬。小麥填閑處理顯著增加了類固醇桿菌屬相對豐度，添加抗重茬生物菌肥顯著增加了黃桿菌屬相對豐度，秸稈還田、添加抗重茬生物菌肥處理顯著增加了Chryseolinea、纖維弧菌屬、熱單孢菌屬、黃異桿菌屬相對豐度。已有研究表明，黃桿菌屬、黃異桿菌屬在纖維素降解過程中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，秸稈還田、小麥填閑、添加抗重茬生物菌肥、石灰氮消毒土壤處理均能改變黃瓜連作土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成、豐富度和多樣性，并改善土壤健康狀況。秸稈還田處理、添加抗重茬生物菌肥處理菌群變化相似，小麥填閑、石灰氮消毒土壤處理菌群變化相似。添加抗重茬生物菌肥、秸稈還田處理顯著增加微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及有益菌門、菌屬種類和相對豐度；小麥填閑顯著增加微生物群落結(jié)構(gòu)有益菌門相對豐度、菌屬相對豐度；石灰氮消毒土壤處理顯著增加微生物菌門的相對豐度。可以說明4 個處理均改變了黃瓜連作土壤細菌群落,改變效果為添加抗重茬生物菌肥處理>秸稈還田處理>小麥填閑處理>石灰氮消毒處理。