賈 茹，黃學(xué)者，賈光群，石玉秋，崔宗巖*，郭澤鑌*

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北 秦皇島 066004）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜味物質(zhì)［1］。蜂蜜中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括糖類、維生素、礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)等［2］。其中，糖類物質(zhì)占蜂蜜總含量的65%～75%，除了果糖、葡萄糖這兩種主要單糖類物質(zhì)外，蜂蜜中還含有微量的蔗糖、松二糖、麥芽糖、異麥芽糖、麥芽酮糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖等二糖或三糖物質(zhì)［3］。

我國食品安全國家標準GB 5009.8-2016［4］中規(guī)定了食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定方法，但對于我國蜂蜜中其它種類的二糖和三糖（松二糖、麥芽酮糖、曲二糖、異麥芽蔗糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麥芽三糖等）缺乏相應(yīng)的檢測方法。對于當前市場上存在的部分摻假蜂蜜，僅基于單糖組分（果糖和葡萄糖），難以區(qū)分蜂蜜和糖漿，因而蜂蜜中微量二糖和三糖組分的檢測顯得尤為重要。

目前，蜂蜜中糖類化合物的檢測方法包括高效液相色譜-示差折光檢測法（HPLC-RID）［5-7］、高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測法（HPLC-ELSD）［8-9］、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法（HPAECPAD）［10］、近紅外光譜法（NIR）［11］、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）［12-13］、液相色譜-質(zhì)譜法［14］、核磁共振波譜法（NMR）［15-16］和滴定法［17］等。其中最為常用的是HPLC-RID法，該方法可用于蜂蜜中果糖和葡萄糖的準確定量，但松二糖、麥芽酮糖、吡喃葡糖基蔗糖和松三糖等微量糖組分在蜂蜜中的含量遠低于果糖和葡萄糖，RID的靈敏度無法滿足其檢測要求，且不能進行梯度洗脫，導(dǎo)致分離效果相對較差，分析時間較長；ELSD靈敏度比RID高，可利用梯度洗脫對蜂蜜中的二糖和三糖進行有效分離，且已有大量研究表明HPLC-ELSD 可用于蜂蜜中微量糖分的準確定量［18-21］?；诖?，本研究建立了采用UPLC-ELSD 測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、松二糖、麥芽酮糖、麥芽糖、曲二糖、異麥芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麥芽三糖的方法，以期可同時準確定量蜂蜜中12種糖組分，從而為蜂蜜品質(zhì)和質(zhì)量評價提供支撐。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

油菜蜜、椴樹蜜、荊條蜜、棗花蜜、洋槐蜜、荔枝蜜和百花蜜等樣品均于2020～2021年間采集自我國河北、陜西、山西、四川、遼寧、黑龍江等地蜂場。

乙腈（色譜純）和三乙胺（優(yōu)級純）購自迪馬公司，實驗用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

果糖、葡萄糖、蔗糖、松二糖、麥芽酮糖、麥芽糖、曲二糖、異麥芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麥芽三糖標準物質(zhì)的純度均≥98%，購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀 器

Acquity UHPLC I-Class 超高效液相色譜儀配蒸發(fā)光散射檢測器、Waters 2695 高效液相色譜儀配示差檢測器（美國Waters公司）；分析天平（感量0.1 mg，0.001 g，梅特勒-托利多儀器有限公司）；微量可調(diào)移液器（100、1 000 μL，德國Eppendorf 公司）；Milli-Q IQ 7000 型超純水發(fā)生器（美國Merck Millipore公司）。

1.3 標準溶液的配制

標準儲備溶液：分別稱取果糖和葡萄糖標準物質(zhì)各4.0 g（精確至1 mg），置于100 mL 容量瓶中，加入60 mL 水溶解，用乙腈定容，搖勻，配制成各標準物質(zhì)儲備液，質(zhì)量濃度為40 g/L；分別稱取蔗糖、松二糖、麥芽酮糖、麥芽糖、曲二糖、異麥芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麥芽三糖標準物質(zhì)各0.2 g（精確至1 mg），置于10 mL容量瓶中，加入6 mL水溶解，用乙腈定容，搖勻，配制成各標準物質(zhì)儲備液，各糖組分儲備液質(zhì)量濃度均為20 g/L。上述儲備液均于4 ℃冰箱儲存。

標準工作溶液：分別吸取果糖和葡萄糖標準儲備溶液各2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 至10 mL 容量瓶中，用乙腈-水（40∶60）稀釋并定容，混勻，分別配制成8、12、16、20、24 g/L的果糖和葡萄糖標準工作溶液；分別吸取蔗糖、松二糖、麥芽酮糖、麥芽糖、曲二糖、異麥芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麥芽三糖標準儲備溶液0.05、0.1、0.25、0.5、0.75 mL 至10 mL 容量瓶中，用乙腈-水（40∶60）稀釋并定容，混勻，分別配制成0.1、0.2、0.5、1、1.5 g/L 的10 種糖混合標準工作溶液，用于繪制標準工作曲線。該工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

果糖和葡萄糖模擬樣品配制：分別稱取40 g 果糖和32 g 葡萄糖于100 mL 燒杯中，加入28 mL 去離子水，攪拌溶解并混合均勻。

1.4 樣品預(yù)處理

稱取2.5 g（精確至0.001 g）蜂蜜樣品，置于50 mL燒杯中，加入15 mL水，用玻璃棒攪拌使試樣完全溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用5 mL 水清洗燒杯并轉(zhuǎn)移至上述50 mL 容量瓶中，重復(fù)3 次，用乙腈定容，混合均勻后過0.22 μm濾膜，置于樣品瓶中供液相色譜測定。

1.5 高效液相色譜條件

1.5.1 UPLC-ELSD 色譜條件色譜柱：Amide（1.7 μm，150 mm×2.1 mm i.d）（或相似規(guī)格）；柱溫：60 ℃；進樣量：3 μL。流動相A：乙腈（含0.1%三乙胺）；流動相B：水；流速：0.25 mL/min。梯度洗脫條件：0～3 min，10% B；3～10 min，10%～20% B；10～23 min，20% B；23～26 min，20%～35%B；26～28 min，35%B；28～29 min，35%～10%B；29～35 min，10%B。

蜂蜜中的果糖和葡萄糖含量遠高于其余10種糖組分，檢測條件如下：

果糖和葡萄糖測定條件：噴霧器模式：冷卻；增益值：1；漂移管溫度：55 ℃；氣體壓力：207 kPa（30 psi）。

蔗糖等10種糖測定條件：噴霧器模式：加熱，動力水平：60%；增益值：5；漂移管溫度：55 ℃；氣體壓力：207 kPa（30 psi）。

1.5.2 HPLC-RID 色譜條件色譜柱：Amide（3.5 μm，250 mm×4.6 mm i.d）（或相似規(guī)格）；進樣量：10 μL。流動相：乙腈（含0.1%三乙胺）-水（75∶25）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

實驗對樣品前處理的稀釋倍數(shù)進行了優(yōu)化。蜂蜜成分以糖類為主，極易溶于水，可直接用去離子水稀釋后進樣檢測。不同的稀釋倍數(shù)會對儀器和結(jié)果造成不同的影響：稀釋倍數(shù)過低易對儀器造成污染，同時，會縮短色譜柱的使用壽命；稀釋倍數(shù)過高則會導(dǎo)致方法的重復(fù)性和靈敏度變差。經(jīng)多次試驗，最終選擇稀釋倍數(shù)為1∶20，在該條件下，實驗方法的靈敏度和重復(fù)性良好，同時也不會對儀器造成嚴重污染。

2.2 UPLC-ELSD條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇目前，糖類檢測常用的色譜柱有NH2型和離子交換型。離子交換柱按照分子量的大小對糖類化合物進行分離，而蜂蜜中多種二糖、三糖分子量相同，在離子交換柱上難以實現(xiàn)有效分離。實驗結(jié)果表明，在優(yōu)化的梯度洗脫條件下，使用NH2柱可實現(xiàn)10種糖組分良好的分離且峰形較好，因此選擇NH2型色譜柱。

2.2.2 ELSD 條件的優(yōu)化針對10 種微量糖分，選擇1 g/L 的10 種糖混合標準溶液對ELSD 的增益系數(shù)、漂移管溫度、噴霧器氣體壓力及模式等參數(shù)進行選擇和優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在增益系數(shù)為5，漂移管溫度為55 ℃，噴霧氣壓力為207 kPa（30 psi），加熱模式下，可獲得高的靈敏度和響應(yīng)值。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

將配制好的果糖和葡萄糖混合標準溶液和10種糖混合標準溶液分別按照上述色譜條件測定，以峰面積的對數(shù)值（y）為縱坐標，標準工作液濃度的對數(shù)值（x）為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，12 種糖的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.997 7～0.999 8。以3 倍信噪比（S/N）對應(yīng)的濃度為方法檢出限（LOD），10 倍信噪比對應(yīng)的濃度為方法定量下限（LOQ）。結(jié)果表明該方法對蜂蜜中果糖和葡萄糖的LOD 為0.5 g/100 g，LOQ 為1.0 g/100 g，其余10 種糖組分的LOD 均為0.1 g/100 g，定量下限均為0.2 g/100 g，滿足蜂蜜中12 種糖組分的檢測要求。12 種糖組分標準溶液和代表性樣品（荊條蜜）的色譜圖見圖1。

圖1 12種糖組分標準溶液及代表性樣品的UPLC-ELSD色譜圖Fig.1 UPLC-ELSD chromatograms of 12 saccharides standard solutions and representative samples

2.4 準確度與精密度

2.4.1 果糖及葡萄糖由于蜂蜜中的果糖和葡萄糖是主要物質(zhì)，含量一般在60 g/100 g以上，無法進行加標回收實驗。本文通過與HPLC-RID法比對的方式，驗證方法準確性。選取代表性樣品洋槐蜜、荊條蜜、油菜蜜、棗花蜜和椴樹蜜，按“1.5”實驗條件，分別進行HPLC-ELSD和HPLC-RID測定，每個樣品平行測定3次。結(jié)果表明，兩種方法測定均值的相對偏差均在4.3%以內(nèi)。在顯著水平α=5%的情況下進行F檢驗，結(jié)果表明兩種方法的結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05），說明本方法結(jié)果準確可靠。

2.4.2 其余10 種糖除果糖和葡萄糖之外，蜂蜜含有的松二糖、蔗糖、麥芽糖等糖組分的含量遠高于本方法的定量下限，無法通過加標回收方式驗證方法準確性。故采用果糖+ 葡萄糖+ 水（40∶32∶28，質(zhì)量比）配制模擬樣品代替蜂蜜樣品進行低、中、高（0.2、0.4、2.0 g/100 g）水平的加標回收實驗，每個水平平行測定6次，其回收率和相對標準偏差（RSD）見表1。結(jié)果表明，10種糖組分的平均加標回收率為97.0%～105%，RSD為0.70%～5.4%，說明此方法準確度和精密度良好。

表1 10種糖空白模擬樣在低、中、高水平的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 1 Recoveries and RSDs（n=6）of 10 saccharides spiked at low，medium and high concentration levels in a blank substitute honey sample（n=6）

選取代表性洋槐蜜、荊條蜜、油菜蜜、荔枝蜜、椴樹蜜和百花蜜樣品，進行10種糖組分高濃度水平（1.0 g/100 g）的加標回收實驗，其回收率和RSD 數(shù)據(jù)見表2。結(jié)果表明，10 種糖的平均回收率為90.0%～105%，RSD為1.0%～5.8%，滿足方法學(xué)要求。

表2 荊條蜜、荔枝蜜、洋槐蜜、百花蜜、油菜蜜和椴樹蜜添加1.0%含量10種糖的回收率和相對標準偏差Table 2 Recoveries and RSDs of 10 saccharides at the spiked level of 1.0%in vitex honey，litchi honey，acacia honey，multifloral honey，rape honey and linden honey

（續(xù)表2）

2.5 實際樣品檢測

采用建立的方法對我國5 種主要大宗蜜源蜂蜜共72 個樣品（15 個油菜蜜、14 個洋槐蜜、15 個荊條蜜、14個椴樹蜜、14個棗花蜜）進行測定，通過對比分析，發(fā)現(xiàn)不同蜜種的蜂蜜中糖分存在明顯差異。

如表3 所示，果糖和葡萄糖為蜂蜜的主要糖分，洋槐蜜中果糖含量最高，平均含量為（42.78±0.87）g/100 g；油菜蜜中果糖含量最低，平均含量為（34.00±1.05）g/100 g；油菜蜜中葡萄糖含量最高，平均含量為（34.46±2.56）g/100 g；洋槐蜜中葡萄糖含量最低，平均含量為（26.74±0.60）g/100 g。所有蜂蜜樣品中果糖和葡萄糖含量之和均大于60 g/100 g，蔗糖含量均小于5 g/100 g，符合GB 14963-2011［1］的要求。

表3 12種糖在5種代表性蜂蜜樣品中的含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of 12 saccharides in 5 types of honey samples

松二糖在所有樣品中全部檢出，是微量糖分中含量最高的糖類，但在不同蜜種中的分布情況差異較大。由表3可知，15個油菜蜜中松二糖的含量最低，其平均含量為（0.37±0.11）g/100 g；14個棗花蜜中松二糖的含量最高，其平均含量為（2.60±0.36）g/100 g。結(jié)果表明，松二糖含量具有一定的蜜種相關(guān)性，且與蜂蜜成熟度有關(guān)。油菜蜜成熟度一般相對較差，其松二糖含量較低；而成熟度較高的棗花蜜中松二糖含量較高，說明松二糖可以作為一種潛在的蜂蜜內(nèi)源標志物用于蜂蜜品質(zhì)評價。

麥芽糖在所有蜂蜜中全部檢出，油菜蜜中的麥芽糖含量最低，15個油菜蜜中麥芽糖的平均含量為（0.69 ± 0.17）g/100 g；荊條蜜中麥芽糖含量最高，15 個荊條蜜中麥芽糖的平均含量為（1.88 ±0.26）g/100 g。目前，國家標準尚未給出蜂蜜中麥芽糖含量的限量要求，本文檢測數(shù)據(jù)顯示，蜂蜜中均含有少量的麥芽糖，且含量一般不超過3.0 g/100 g，該數(shù)據(jù)為市場監(jiān)管機構(gòu)制定蜂蜜中麥芽糖限量標準提供了數(shù)據(jù)參考。

吡喃葡糖基蔗糖是蜂蜜中一種微量的三糖，其在油菜蜜中的檢出率和含量相對較低，在其余4 種蜂蜜中全部檢出，且在荊條蜜、洋槐蜜、棗花蜜中的含量相對較高。麥芽酮糖、曲二糖和異麥芽糖在5種蜂蜜中的分布情況類似，這3種糖在油菜蜜中的檢出率均較低，麥芽酮糖和曲二糖僅在個別油菜蜜樣品中檢出，且含量相對較低；異麥芽糖在15個油菜蜜中全部未檢出。麥芽酮糖、曲二糖和異麥芽糖在其余4種蜂蜜中全部檢出，其中棗花蜜中這3種糖的含量相對較高。

松三糖、蜜三糖和麥芽三糖在72個蜂蜜樣品中檢出率極低，蜜三糖和麥芽三糖全部未檢出，松三糖在72個蜂蜜樣品中有9個樣品達到檢出限，其平均含量為（0.23±0.03）g/100 g。

3 結(jié) 論

本研究采用超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（UPLC-ELSD）對蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖、松二糖、麥芽酮糖、麥芽糖、曲二糖、異麥芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麥芽三糖含量進行測定。在優(yōu)化實驗條件下，本方法可實現(xiàn)上述12種糖組分的良好分離和定性定量檢測，其中果糖和葡萄糖的結(jié)果與液相色譜-示差檢測法無顯著性差異，其余10 種糖的平均回收率為90.0%～105%，相對標準偏差為0.70%～5.8%。該方法操作簡便，靈敏度高，準確度和精密度良好，可同時準確定量蜂蜜中12種糖組分。將本法初步用于72批不同蜜種蜂蜜檢測，發(fā)現(xiàn)松二糖、麥芽糖、麥芽酮糖等糖組分在蜂蜜中普遍檢出，檢測結(jié)果可為蜂蜜品質(zhì)和質(zhì)量評價提供重要支撐。