孫京宇，蔡振林，錢 永

（1. 海南醫(yī)學(xué)院口腔學(xué)院2019級碩士研究生；2. 海南醫(yī)學(xué)院口腔學(xué)院2020級碩士研究生；3. 海南醫(yī)學(xué)院附屬海南省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，海南 ?？?570311）

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，主要包括鼻咽癌、口腔癌、喉癌、下咽癌及頭頸部皮膚的鱗狀細(xì)胞癌。在全球范圍內(nèi)，頭頸部鱗癌約占成人全身惡性腫瘤的8%［1］，但在海南地區(qū)，由于鼻咽癌、口腔癌、皮膚鱗癌的高發(fā)，致使頭頸部鱗癌在全身惡性腫瘤中的占比顯著上升［2］。

維甲酸相關(guān)孤核受體α（Retinoid orphan nuclear receptor α，RORα）是一種具有多種生理功能的核受體，廣泛分布于機體各組織，在器官發(fā)育、機體免疫、慢性炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等一系列病理生理過程中發(fā)揮重要作用［3］。近年來大量研究證實，RORα 是一種腫瘤抑制因子，在乳腺癌、肝癌、結(jié)/直腸癌等多種惡性腫瘤中不表達(dá)或呈顯著的低表達(dá)［4］。本研究通過觀察RORα 在頭頸部鱗癌組織中的表達(dá)及對體外培養(yǎng)的頭頸部鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，探討RORα 參與頭頸部鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料頭頸部鱗癌細(xì)胞系（SCC4、Hep-2）均為我院實驗中心留存；高糖DMEM 培養(yǎng)液、鼠抗人RORα 抗 體、Transwell 小 室、Matrigel 等 購 自GIBCO 公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素購自HYCLONE 公司；UltraSentive TMSP 超敏試劑盒購自天津三箭生物試劑公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化檢測免疫組化染色采用鏈霉素-生物素（LSAB）免疫酶標(biāo)法，采用UltrasSentive TMSP 超敏試劑盒。染色前，切片置于60 ℃烤箱中烤片20 min，脫蠟水化后，置枸櫞酸緩沖液（0.01 mol·L-1，pH 6.0）中，微波加熱至沸騰，10 min×2 次。其余均遵循試劑盒說明書操作。以正?？谇火つ?biāo)本切片作陽性對照，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)人舌鱗癌細(xì)胞株SCC4 和人喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2 在37 ℃、5%（V/V）CO2、飽和濕度的條件下，在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U·mL-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至約80%～90%匯合時，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.3 RORα 過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的建立根據(jù)GenBank 中 的RORα 基 因 序 列（Accession：NC_000015.10），設(shè)計RORα cDNA，構(gòu)建靶向RORα cDNA 慢病毒載體，轉(zhuǎn)化、擴增、包裝后收集病毒顆粒，而后感染SCC4、Hep-2 細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后建立RORα 過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，熒光顯微鏡下觀察驗證轉(zhuǎn)染效率，Western Blot 驗證轉(zhuǎn)染后RORα 的表達(dá)情況。

1.2.4 RORα激活試驗（SR1078干預(yù)試驗）收集體外培養(yǎng)的人舌鱗癌細(xì)胞株SCC4 和人喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2，待細(xì)胞生長至約80%～90% 匯合時，0.25%胰酶消化、傳代，并分為兩組：SR1078（-）組和SR1078（+）組，分別加入0μmol·L-1和20μmol·L-1的SR1078（20 μmol·L-1的SR1078 干預(yù)濃度是預(yù)實驗篩選出的最佳效果濃度），連續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，Western Blot檢測RORα表達(dá)水平。

1.2.5 細(xì)胞集落形成試驗收集對數(shù)生長期的SCC4、Hep-2 細(xì)胞，DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，濃度為1×105～5×105個·mL-1，取細(xì)胞懸液5 mL 接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿中；接種后預(yù)培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液；換液時按0 μmol·L-1（Control 組）、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1和20 μmol·L-1四個濃度梯度加入SR1078，繼續(xù)培養(yǎng)，每48 h 更換培養(yǎng)液；連續(xù)培養(yǎng)96 h 后，吸棄培養(yǎng)液后以PBS輕洗3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。去固定液后PBS 輕洗2 次，加入適量GIMSA 染色液染15 min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥后，顯微鏡下觀察并計數(shù)細(xì)胞集落。同樣，將RORα cDNA組、空載組（Emtpy vector組）及對照組（Control組）的SCC4、Hep-2 細(xì)胞按1×106·mL-1的濃度接種于培養(yǎng)皿中，每48 h 更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)96 h 后，經(jīng)過同樣的清洗、固定、染色等步驟，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.6 Western Blot收集細(xì)胞，提取蛋白后依次經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗及二抗孵育、化學(xué)增強發(fā)光系統(tǒng)（ECL）顯色。設(shè)β-actin 為內(nèi)參。

1.2.7 劃痕試驗收集對數(shù)生長期的SCC4、Hep-2細(xì)胞，按1×106/孔的密度種植于6 孔板中；培養(yǎng)至大約80%～90%匯合時，以10μL 槍頭作劃痕，PBS 輕洗3 次以去除脫落細(xì)胞；而后將細(xì)胞分為SR1078（-）組和SR1078（+）組，分別加入含有0 μmol·L-1SR1078+5%FBS 和20 μmol·L-1SR1078+5%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)48 h 后觀察結(jié)果。同樣，將RORα cDNA 組、空載組（Empty vector 組）及對照組（Control 組）的SCC4、Hep-2 細(xì)胞按照1×106/孔的密度種植于6 孔板中，培養(yǎng)至大約80%～90%匯合時，相同方法作劃痕后，加入含有5%FBS 的DMEM培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。

1.2.8 細(xì)胞體外侵襲試驗（Transwell法）細(xì)胞體外侵襲試驗采用Transwell 法。收集SCC4、Hep-2 細(xì)胞，并將其各分為兩組：SR1078（-）組和SR1078（+）組；分別給予0 μmol·L-1和20 μmol·L-1的SR1078 進(jìn)行干預(yù)處理，連續(xù)培養(yǎng)48 h 后備用。Matrigel 4 ℃溶膠過夜，并預(yù)冷槍頭；將液化的Matrigel 與無血清DMEM 按1∶5 稀釋，吸取50 μL 稀釋液鋪于24 孔板之Transwell 小室（上室），37 ℃孵育4 h 后以無血清DMEM 水化上室內(nèi)凝膠30 min；收集備用的兩組SCC4 和Hep-2 細(xì)胞，以無血清DMEM 洗滌3 次；以5%FBS 的DMEM 制成濃度為5×105·mL-1的細(xì)胞懸液，吸取200 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 上室；下室中加入含有20%FBS 的DMEM 600μL，培養(yǎng)48 h 后取出Transwell 小室，拭凈小室上面的細(xì)胞及Matrigel，PBS 輕洗2 次，4%多聚甲醛固定10 min，1%結(jié)晶紫染色30 min；鏡下觀察及拍照，10 倍物鏡下任選5 個視野，計數(shù)穿膜細(xì)胞。同樣方法制備Transwell 上室后，將RORα cDNA 組、空載組（Empty vector 組）及對照組（Control 組）的SCC4、Hep-2 細(xì)胞以同樣方法制備成細(xì)胞懸液，接種于Transwell 上室中，其他步驟同上，連續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RORα 在頭頸部鱗癌組織呈低表達(dá)或不表達(dá)在舌癌及喉癌組織標(biāo)本中，癌細(xì)胞的RORα 呈陰性或弱陽性，而在癌旁正常黏膜組織中，RORα 的表達(dá)呈強陽性，RORα主要表達(dá)于細(xì)胞核（圖1）。

圖1 RORα在頭頸部鱗癌及癌旁正常黏膜中的表達(dá)（HE×20）

2.2 SR1078 激活頭頸部鱗癌細(xì)胞中RORα 的表達(dá)本研究所選擇的人舌鱗癌細(xì)胞系SCC4 和喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2 中，Western Blot 檢測結(jié)果均顯示，RORα 不表達(dá)或僅為極低水平表達(dá)；在以RORα 激活劑（SR1078，干預(yù)濃度：20 mmol·L-1）對兩種鱗癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理48 h 后，細(xì)胞中RORα 的表達(dá)水平顯著升高（圖2）。

圖2 SR1078干預(yù)激活頭頸部鱗癌細(xì)胞中RORα的表達(dá)

2.3 RORα 過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的驗證將RORA cDNA 轉(zhuǎn)染頭頸部鱗癌細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率后，Western Blot 檢測細(xì)胞中RORα 的表達(dá)，與對照組（Control 組）及空載組（Empty vector組）相比RORA cDNA 組RORα 蛋白表達(dá)增加，RORα過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立成功（圖3）。

圖3 頭頸部鱗癌RORα過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的驗證

2.4 SR1078 干預(yù)及RORα 過表達(dá)對頭頸部鱗癌細(xì)胞的增殖活性的影響與對照組相比，SR1078干預(yù)組的細(xì)胞集落隨SR1078 的濃度（5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1）升高而明顯減少，顯示細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，且抑制作用在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而RORα cDNA 組的細(xì)胞集落較對照組和空載組同樣明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）（圖4、圖5）。

圖4 SR1078干預(yù)顯著抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞的體外增殖

圖5 RORα過表達(dá)顯著抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞的體外增殖

2.5 SR1078 干預(yù)及RORα 過表達(dá)對頭頸部鱗癌細(xì)胞體外遷移的影響與SR1078（-）組細(xì)胞相比，SR1078（+）組的細(xì)胞遷移能力受到明顯抑制，劃痕兩側(cè)的細(xì)胞向劃痕區(qū)遷移較少。而將RORα cDNA組、空載組（Empty vector組）及對照組（Control組）的頭頸部鱗癌細(xì)胞進(jìn)行劃痕試驗時，RORα cDNA組細(xì)胞向劃痕區(qū)的遷移幅度明顯降低（圖6）。

圖6 SR1078干預(yù)及RORα過表達(dá)均顯著抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞的體外遷移能力

2.6 SR1078 干預(yù)及RORα 過表達(dá)對頭頸部鱗癌細(xì)胞體外侵襲的影響與SR1078（-）相比，SR1078（+）組的細(xì)胞侵襲能力明顯受到抑制，侵入Transwell 下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而RORα cDNA 組、空載組（Empty vector 組）及對照組（Control 組）的三組癌細(xì)胞進(jìn)行體外侵襲試驗時，侵入Transwell 下室的RORα cDNA組細(xì)胞數(shù)較另外兩組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖7、圖8）。

圖7 SR1078干預(yù)顯著抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞的體外侵襲能力

圖8 RORα過表達(dá)顯著抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞的體外侵襲能力

2.7 SR1078 干預(yù)及RORα 過表達(dá)對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的影響收集對照組（Control組）、空載組（Empty vector組）、RORα cDNA組及經(jīng)過20μmol·L-1SR1078 干預(yù)后的SCC4、Hep-2 細(xì)胞，分別提取蛋白，Western Blot 檢測多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子（E-cadherin、MTA-1、β-catenin、MMP-2、MMP-9）的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對照組及空載組細(xì)胞相比，在RORα 表達(dá)激活的RORα cDNA 組和SR1078（+）組兩組細(xì)胞中，E-cadherin（E-鈣黏素）表達(dá)顯著上調(diào)，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子1（MTA-1）、β 連環(huán)蛋白（β-catenin）表達(dá)水平稍有下調(diào)，MMP-2 和MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶2和9）表達(dá)顯著下調(diào)（圖9）。

圖9 SR1078 干預(yù)和RORα 過表達(dá)對多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)的影響

3 討 論

孤核受體（Orphan Nuclear Receptor，ONR）是20世紀(jì)80 年代末發(fā)現(xiàn)的一類無天然配體或尚未發(fā)現(xiàn)配體的核受體，是核受體超家族中較為獨特的成員［3-5］。目前已發(fā)現(xiàn)的孤核受體超過150 種，其中包括維甲酸相關(guān)孤核受體（Retinoid Orphan Nuclear Receptors，RORs）亞家族。RORα 是RORs 亞家族中最早發(fā)現(xiàn)的受體，因其序列與視黃酸受體類X 受體相似而得名。RORα 廣泛分布于機體各組織，能與體內(nèi)其他生物活性因子協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化與凋亡，對多種組織器官的發(fā)育特別是神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起關(guān)鍵作用［3-6］。此外，RORα 還參與多種物質(zhì)代謝的調(diào)控，在慢性炎癥、機體免疫及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等一系列病理生理過程中發(fā)揮重要作用［3-6］。

近年來已有大量關(guān)于RORα與腫瘤密切相關(guān)的文獻(xiàn)報道，認(rèn)為RORα 是一種腫瘤抑制因子［3-4，7］。RORα 廣泛存在于機體各類組織，但在多數(shù)惡性腫瘤中不表達(dá)或呈顯著的低表達(dá)，包括口腔鱗癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)/直腸癌、前列腺癌及黑色素瘤等常見腫瘤［8-11］。YAMASHITA S 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞中，RORα基因出現(xiàn)甲基化而表達(dá)沉默；在利用RORα 激活劑（SR1078）干預(yù)后，RORα 表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞的體外增殖及侵襲能力均受到明顯抑制。DAI J 等［13］報道，RORα 在正常角化上皮細(xì)胞中呈恒定的高表達(dá)，而在包括口腔癌在內(nèi)的口腔鱗癌組織及細(xì)胞系中卻呈顯著低表達(dá)，且RORα 可通過調(diào)控FOXN1 的表達(dá)促進(jìn)角化上皮細(xì)胞的分化；而FOXN1是一個公認(rèn)的促進(jìn)細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，在鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［14］。ZHENG X 等［15］則在研究中發(fā)現(xiàn)，RORα 表達(dá)升高可顯著抑制口腔癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)增殖，而RORα 表達(dá)下降則明顯抑制P53 蛋白的表達(dá)及磷酸化。裴大兵等［16］發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用SR1078（RORα 激活劑）對體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖和體外遷移、侵襲能力。本研究中，我們通過免疫組化檢測頭頸部鱗癌及癌旁正常黏膜中RORα 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在癌組織中RORα 表達(dá)水平極低或完全呈陰性表達(dá)，而癌旁正常黏膜中則呈陽性表達(dá)，且多呈強陽性；而篩選出兩種RORα 表達(dá)陰性的頭頸部鱗癌細(xì)胞株后，采用RORα 激活劑——SR1078 對其進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，SR1078 能激活RORα 在兩種頭頸部鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)，并且抑制細(xì)胞的增殖，抑制效果在一定范圍內(nèi)隨濃度升高而增強。此結(jié)果與ZHENG X 等［15］及裴大兵等［16］的研究結(jié)果基本一致。隨后的劃痕試驗及細(xì)胞侵襲試驗中，我們同樣發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過SR1078預(yù)處理的癌細(xì)胞，遷移及侵襲能力均受到顯著抑制，與對照組之間存在顯著差異；此結(jié)果亦與裴大兵等［16］在胃癌細(xì)胞的研究結(jié)果完全一致。為了進(jìn)一步驗證RORα 在頭頸部鱗癌中的作用，我們根據(jù)GenBank 中RORα 基因序列設(shè)計RORα cDNA，并通過一系列步驟成功構(gòu)建RORα過表達(dá)的頭頸部鱗癌細(xì)胞株，并收集RORα 過表達(dá)的癌細(xì)胞進(jìn)行了相同的細(xì)胞實驗，結(jié)果顯示，RORα 過表達(dá)癌細(xì)胞的體外增殖活性、遷移及侵襲能力均明顯下降，與SR1078 激活RORα 表達(dá)的頭頸部鱗癌細(xì)胞的實驗結(jié)果基本一致，只是程度稍有差異。

E-鈣黏素（E-cadherin）是上皮細(xì)胞最重要的表型標(biāo)記分子，其表達(dá)水平下降或喪失是上皮間質(zhì)化（EMT）或惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性事件［17］。β 連環(huán)蛋白（β-catenin）是Wnt/β-catenin 信號通路的核心分子，Wnt/β-catenin信號通路的異常活化在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［18］。而基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，為一類Zn2+依賴肽鏈內(nèi)切酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），而細(xì)胞外基質(zhì)的降解被公認(rèn)為惡性腫瘤早期侵襲轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志［19］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活頭頸部鱗癌細(xì)胞中RORα 表達(dá)后，癌細(xì)胞中的上皮表型分子-E-鈣黏素表達(dá)顯著增強，而MMP-2和MMP-9表達(dá)卻顯著下調(diào)，提示RORα 表達(dá)喪失可能是通過EMT 機制參與頭頸部鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述，RORα 表達(dá)失活是頭頸部鱗癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要事件。RORα激活劑（SR1078）能激活RORα 在頭頸部鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)，并顯著抑制兩種癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力。但RORα 的表達(dá)與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力抑制之間是否有直接的因果關(guān)系，仍需進(jìn)一步研究證實。