李麗，楊樣，孫姍姍，王文強，錢凱，鄒潔

（江蘇省產品質量監(jiān)督研究院，江蘇南京 210007）

目前文獻報道的染發(fā)劑檢測方法主要有高效液相色譜法[1]、液質聯用法[2，3]、氣相色譜 法[4]、氣質聯用法[5]及毛細管電泳法[9]等。其中液相色譜-質譜法應用最為廣泛，但質譜儀器成本較高，且在分析復雜樣品及成分含量未知的樣品時， 易造成離子源污染；氣相色譜、氣質聯用和毛細管電泳法在分析復雜樣品時易造成對毛細管柱和儀器污染，定性和定量不準確； 而高效液相色譜法具有儀器普及率較高、靈敏度高以及分析速度快等特點。由于染料成分具有極性強，不易揮發(fā)，不穩(wěn)定等特點，因此高效液相色譜法是目前優(yōu)先選擇的檢測手段。染發(fā)劑中2,6-二羥乙氨基甲苯、3-硝基對羥乙氨基酚、2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚、5-氨基-4-氯鄰甲酚4 種限用物質的檢測方法， 目前國家暫未出臺統一的檢測標準，文獻報道也不多見，存在檢測方法缺失、職能部門無法監(jiān)管的現象，因此本研究采用高效液相色譜法檢測染發(fā)劑中4 種限用物質，并利用此方法對市售染發(fā)劑產品進行檢測，為化妝品的市場監(jiān)督提供技術支持[6～9]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC1260 高效液相色譜儀 （Agilent 公司，美國）；電子分析天平（賽多利斯，德國）；超純水機（Millipore，美國）；超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，中國）；高速冷凍離心機（Thermo Fisher，美國）；渦旋振蕩器（其林貝爾，中國）；4 種限用物質：2,6-二羥乙氨基甲苯（CAS：149330-25-6）、3-硝基對羥乙氨基酚（CAS：65235-31-6）、2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚（CAS：6538-09-4）、5-氨基-4-氯鄰甲酚（CAS：110102-86-8），標準品均購于上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈（色譜純，Merk，德國），樣品為市售染發(fā)劑。

1.2 標準溶液的配制

精確稱取2,6-二羥乙氨基甲苯、3-硝基對羥乙氨基酚、5-氨基-4-氯鄰甲酚2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚4 種標準品各100mg（精確到0.1mg）分別置于10mL 棕色容量瓶中，加入1mL 亞硫酸氫鈉（2g/L）和40%乙腈-水溶液使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質量分數為1.0g/L 的標準儲備溶液。將標準儲備溶液依次稀釋成質量分數為5mg/L、10mg/L、20 mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L 的 系列混合標準溶液。

1.3 樣品處理

稱取樣品0.5g（精確至0.001g），置25.0mL 離心管中，加入1mL 亞硫酸氫鈉（2g/L），少量40%乙腈-水溶液，混勻樣品后定容至刻度，渦旋30s 并冰浴超聲提取15min 后，以10000rpm/min 轉速離心8min，經0.45μm 微孔濾膜過濾后，待測備用。

1.4 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipseplusC18 （250mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈和20mmol/L 磷酸二氫鉀水溶液，4 種限用物質混合標準溶液色譜圖見圖1；梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；流速：1.0mL/min；檢測波長：250nm；柱溫：25℃；進樣量：10μL，采用外標法定量。

圖1 4 種限用物質混合標準溶液的高效液相色譜圖

表1 4 種限用物質的梯度洗脫程序

2 結果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

標準方法中規(guī)定取樣量為0.5g， 提取溶劑為10mL50%乙醇水溶液。 按照標準方法在日常檢驗中發(fā)現：部分樣品提取液會乳化或凝結，離心后的上層液較混濁，難以通過0.45μm 微孔濾膜；此外，在部分樣品配方中未見加入亞硫酸氫鈉或異抗壞血酸，制得的供試溶液容易氧化分解，影響測定結果。 為了消除染發(fā)劑中增稠劑和凝膠劑的影響，防止供試溶液被氧化，本方法加入硅藻土吸附增稠劑和凝膠劑， 并在提取溶液中加入1mL亞硫酸氫鈉（2g/L），提取溶液體積改為25mL 并在冰浴環(huán)境中超聲提取。 優(yōu)化后的前處理方法乳化凝結現象明顯減少，便于離心后取得上層清液。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動相選擇 本實驗以20mmol/L 磷酸二氫鉀水溶液（pH=4.0）作為流動相A 相，考察以甲醇或乙腈（B 相）作為有機相在相同梯度洗脫條件下4 種目標化合物的色譜行為。 結果表明：當以甲醇為有機相時，4 種目標化合物出現出峰時間緩慢、出峰延遲的現象，而以乙腈為有機相出峰時間快并能很好的分離各目標組分，且峰形尖銳對稱，故本方法選擇乙腈作為有機相。

2.2.2 測定波長的選擇 分別對4 種限用物質標準溶液進行紫外-可見光全波長掃描分析 （190～400nm）。 根據所測結果4 種目標物在250nm 左右區(qū)域都有吸收峰，因此本方法最終確定定量檢測波長為250nm。

2.2.3 色譜柱溫度的選擇 色譜柱的溫度對于4種染發(fā)劑限用物質的色譜保留行為及分離效果都具有一定的影響。 本研究考察了當色譜柱溫度在10～40℃范圍對色譜行為的影響。 實驗結果表明：當色譜柱溫度為25℃時，既保證了保留時間的穩(wěn)定性， 同時也避免溫度過高引起目標化合物成分的變化， 因此本方法最終確定25℃為色譜柱溫。

2.3 方法的線性關系和定量限

將混合標準儲備溶液逐級稀釋得到的質量分數為5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的混合標準工作溶液，按測定條件質量分數由低到高依次進樣分析，以4 種染發(fā)劑限用物質的峰面積作為縱坐標， 質量分數作為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程。 4 種限用物質的線性回歸方程、線性回歸系數、檢出限(S/N＞3)及定量下限(S/N＞10)結果見表2。 結果表明：在5～200mg/L 質量分數范圍內，各染發(fā)劑限用物質的峰面積和對應的質量分數具有良好的線性關系，相關系數均大于0.999，且本方法的檢出限完全滿足實際樣品的分析要求。

表2 4 種限用物質的線性方程、線性相關系數、檢出限及定量限

2.4 方法的回收率和精密度

利用空白基質進行回收率和精密度的考察。在低、中、高3 個加標水平下，每個加標水平平行測定6 次，結果表明4 種限用物質的平均回收率范圍在87.6%～97.5%，相對標準偏差范圍在1.18%～4.64%，RSD 均小于5%（見表3），說明該方法的準確度、精密度均好。

表3 4 種限用物質的加標回收率和精密度結果(n=6)

2.5 樣品的測定

本次實驗共購買10 種染發(fā)劑，利用本文建立的方法進行檢測，10 種樣品中均未檢出4 種限用物質染料，符合《化妝品安全技術規(guī)范》（2015 年版）規(guī)定。

3 結論

本研究建立了高效液相色譜法測定染發(fā)劑中4種限用物質的檢測方法。 該方法前處理簡單、重現性好、靈敏度高，可用于染發(fā)產品中常用染料成分的測定，為市場監(jiān)管提供強有力的技術手段支撐。