趙歡 王璟璐 張穎 廖生進(jìn) 杜建軍 郭新宇 趙春江

摘要：針對(duì)玉米自交系莖稈不同節(jié)位形態(tài)特征差異大、維管束分布不同等特點(diǎn)，利用Micro-CT掃描技術(shù)及基于區(qū)帶的維管束表型解析方法，對(duì)莖稈基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)節(jié)間進(jìn)行顯微圖像獲取，實(shí)現(xiàn)莖稈不同節(jié)間橫切面、表皮區(qū)、周皮區(qū)、髓區(qū)、維管束相關(guān)表型的精準(zhǔn)解析。研究結(jié)果表明，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法適用于莖稈不同節(jié)間維管束表型解析，可獲得表征莖稈節(jié)間組織和維管束形態(tài)、幾何性狀、分布等共47項(xiàng)指標(biāo)，獲取效率高達(dá)20 s/張圖像。同傳統(tǒng)方法相比，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法效率高、通量大，且可獲取的表型指標(biāo)類型多。描述性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，同莖稈橫切面長(zhǎng)軸長(zhǎng)等傳統(tǒng)指標(biāo)相比，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法獲取的功能區(qū)表型指標(biāo)變異系數(shù)較大，能更好地反映出不同節(jié)間、不同自交系間的差異;且在不同自交系間，基部第3節(jié)的周皮區(qū)維管束數(shù)量（P=7.79×10-29）和穗位節(jié)的周皮區(qū)維管束面積占比（P=1.79×10-26）差異最顯著。此外，從基部到頂部，表征橫切面及各功能區(qū)幾何、形態(tài)性狀以及維管束數(shù)量、面積相關(guān)的表型指標(biāo)呈依次減小的趨勢(shì);表征維管束分布的表型指標(biāo)呈依次增加的趨勢(shì);功能區(qū)面積占比分布趨勢(shì)不同，其中周皮區(qū)面積占比在基部節(jié)間最大，髓區(qū)面積占比在穗位節(jié)最大，表皮區(qū)面積占比在頂位節(jié)最大。本研究實(shí)現(xiàn)了玉米自交系莖稈不同節(jié)間維管束表型的高通量獲取與精準(zhǔn)解析，初步揭示了表型指標(biāo)在不同節(jié)間的分布趨勢(shì)，可為后期莖稈表型遺傳解析和性狀定向改良提供參考。

關(guān)鍵詞：玉米莖稈;Micro-CT;區(qū)帶;維管束表型;高通量獲取;精準(zhǔn)解析

中圖分類號(hào)：S126;S513.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）12-0201-11

收稿日期：2021-12-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31801254）;北京市農(nóng)林科學(xué)院作物表型協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（編號(hào)：KJCX201917）。

作者簡(jiǎn)介：趙 歡（1997—），女，四川廣元人，碩士研究生，主要從事作物表型組學(xué)研究。E-mail：3321621249@qq.com。

通信作者：趙春江，博士，研究員，中國(guó)工程院院士，主要從事農(nóng)業(yè)信息化關(guān)鍵技術(shù)研究。E-mail：zhaocj@nercita.org.cn。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)和信息技術(shù)的飛速發(fā)展，作物科學(xué)研究進(jìn)入了大數(shù)據(jù)、大平臺(tái)、大發(fā)現(xiàn)的新時(shí)代[1-3]。近年來(lái)，以高通量、自動(dòng)化、智能化為主要特征的表型組學(xué)技術(shù)及平臺(tái)系統(tǒng)層出不窮，使得多尺度、高精度、自動(dòng)化的表型檢測(cè)成為可能，為實(shí)現(xiàn)作物多維度表型精準(zhǔn)鑒定奠定了良好基礎(chǔ)。在此背景下，基于組學(xué)的莖稈維管束形態(tài)、分布、關(guān)聯(lián)性等高通量、精準(zhǔn)性、系統(tǒng)性研究對(duì)助力作物莖稈維管束的表型特征分析和遺傳解析具有重要意義[1-2]。

玉米莖稈維管束是“流”的重要組成部分，由木質(zhì)部和韌皮部構(gòu)成，負(fù)責(zé)水分和有機(jī)養(yǎng)分的運(yùn)輸。由于受限于顯微表型檢測(cè)設(shè)備分辨率和表型解析手段，玉米莖稈維管束研究進(jìn)程緩慢。傳統(tǒng)玉米莖稈維管束表型檢測(cè)主要依賴顯微鏡進(jìn)行局部觀察。顯微鏡雖然分辨率高，但成像視野小，僅能獲取預(yù)先選擇的、特定組織中的維管束數(shù)量、面積等表型指標(biāo)，且無(wú)論是人工測(cè)量還是應(yīng)用商業(yè)軟件，都需要大量人工參與，費(fèi)時(shí)費(fèi)力[4-7]。因此，基于顯微鏡的觀察方法無(wú)法滿足大規(guī)模、系統(tǒng)性的玉米莖稈維管束表型特征分析需求，迫切需要找到一種高通量、自動(dòng)化的維管束表型研究方法來(lái)打破困局。2014年，Legland等利用BlueBox宏觀成像系統(tǒng)對(duì)人為去除表皮和周皮的玉米莖稈橫切面進(jìn)行成像分析，獲得了維管束空間分布相關(guān)性狀[8]。2015年，Heckwolf等通過(guò)平板掃描儀獲得玉米莖稈整個(gè)橫切面圖像，提出一種自定義圖像處理程序?qū)D像進(jìn)行自動(dòng)化解析，成功實(shí)現(xiàn)在樣品無(wú)損的情況下對(duì)髓組織內(nèi)部維管束表型指標(biāo)的提取，但并未實(shí)現(xiàn)對(duì)周皮維管束的表型獲取[9]。2017年，Legland等基于玻片掃描儀對(duì)Fasga染色后的整個(gè)莖稈橫切面進(jìn)行成像，量化各組織區(qū)塊成色單元，為莖稈外圍維管束相關(guān)表型測(cè)量提供了可能[10]。

鑒于傳統(tǒng)成像系統(tǒng)及表型提取手段的諸多不足，通過(guò)二維成像技術(shù)提取玉米莖稈維管束表型仍存在較大困難。如今，顯微計(jì)算機(jī)χ射線斷層掃描（Micro-CT）等三維成像技術(shù)在作物表型研究領(lǐng)域得到越來(lái)越多的關(guān)注[11-15]，為玉米維管束性狀的提取提供了新的技術(shù)途徑。Micro-CT系統(tǒng)作為一種高分辨率、高精度儀器，不僅能對(duì)植株內(nèi)部顯微表型進(jìn)行精準(zhǔn)獲取，還能最大程度地保留樣品的完整性?；贛icro-CT掃描技術(shù)，可以精準(zhǔn)定量玉米莖稈在伸長(zhǎng)期和抽雄期的顯微指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)不同生長(zhǎng)階段的實(shí)時(shí)觀測(cè)[16];還可以獲取不同品種玉米莖稈不同節(jié)間的解剖特征，進(jìn)行解剖表型與抗倒伏性的關(guān)系研究[17]?；贑T圖像，Zhang等研發(fā)出專用于維管束表型分析的圖像處理軟件VesselParser 4.0，該軟件根據(jù)莖稈內(nèi)物質(zhì)分布（CT值），將莖稈橫切面精準(zhǔn)劃分為表皮區(qū)、周皮區(qū)和髓區(qū)，并提出了基于區(qū)帶的表型解析方法。該方法的提出與應(yīng)用不僅實(shí)現(xiàn)了莖稈橫切面的組織劃分，還實(shí)現(xiàn)了維管束分類以及維管束數(shù)量、面積和空間分布等顯微表型特征的自動(dòng)化獲取[18]。目前，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法已成功應(yīng)用于玉米莖稈基部第3節(jié)維管束的表型研究及遺傳解析，而尚無(wú)在莖稈其他節(jié)間的應(yīng)用報(bào)道。

本研究針對(duì)玉米自交系莖稈不同節(jié)間形態(tài)特征差異大、維管束分布不同等特點(diǎn)，利用Micro-CT掃描技術(shù)和基于區(qū)帶的維管束解析方法，對(duì)玉米自交系莖稈基部第3節(jié)、穗位節(jié)和頂位節(jié)進(jìn)行維管束表型高通量獲取及精準(zhǔn)解析，并基于獲取的莖稈橫切面及各區(qū)帶幾何形態(tài)性狀和維管束數(shù)量、面積及分布等47項(xiàng)表型指標(biāo)，開展玉米不同節(jié)間的差異分析，以期為進(jìn)一步的遺傳學(xué)研究和性狀定向改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料4FC70124-2524-41CF-BEF5-849E79D3D36F

試驗(yàn)材料為玉米關(guān)聯(lián)分析群體[19]中莖稈粗細(xì)不同的36個(gè)自交系，材料來(lái)源地涵蓋了熱帶、亞熱帶及溫帶等多氣候帶。具體材料信息如下，非堅(jiān)稈綜合種（non-stiff stalk，NSS）：MO113、GEMS58、By4839、M153、By813、BEM、Dan360、Zheng28、P138;堅(jiān)稈綜合種（Stiff Stalk，SS）：GEMS14、832、Tie7922、U8112、GEMS52、B110、Zheng32、GEMS13、GEMS4;熱帶種質(zhì)材料（Tropical-subtropical，TST）：GEMS31、CIMBL55、CIMBL50、CIMBL69、CIMBL63、CIMBL90、CML69、CML170、CML171;混合材料（Mixed）：SK、CIMBL154、Ye515、Zheng22、TY2、TY7、Ye107、Zhong69、3H-2。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品制備

供試材料于2018年4月28日在北京市農(nóng)林科學(xué)院通州試驗(yàn)基地（116°E，39.69°N）種植，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，8次重復(fù)，每個(gè)自交系種植4行，行長(zhǎng)2.1 m，行距0.6 m。種植密度和水肥管理均參照當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)模式。

在玉米吐絲期（種植73 d后）選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行取樣，每個(gè)小區(qū)取3株作為重復(fù)。獲取各自交系基部第3節(jié)、穗位節(jié)（最大果穗著生處）和頂位節(jié)的節(jié)間中部切片，獲取長(zhǎng)度2 cm以上，取樣后及時(shí)放置在甲醛-乙酸-乙醇（FAA）固定液（70%乙醇、100%甲醛、100%乙酸體積比為90 ∶5 ∶5）中進(jìn)行固定。

1.3 莖稈樣本前處理及CT掃描

（1）樣本脫水。樣本固定完成后，從固定液中取出，進(jìn)行系列脫水處理，具體流程為：70%乙醇 4 h→100%乙醇 4 h→100%乙醇 4 h→100%叔丁醇 4 h→100%叔丁醇 4 h。（2）樣本超低溫冷凍。叔丁醇代替完成后，將樣品從叔丁醇中取出，放置 -80 ℃ 超低溫箱中冷凍24 h以上。（3）超低溫冷凍干燥。將經(jīng)超低溫冷凍的樣品放置于超低溫冷凍干燥儀（LGJ-10E，中國(guó)）的樣品倉(cāng)中，-30 ℃ 干燥3～4 h。（4）固態(tài)碘染色。將干燥后的樣品加固態(tài)碘進(jìn)行染色，每個(gè)樣品中大致放3～5顆固態(tài)碘珠，待染色均勻后進(jìn)行CT掃描。（5）CT掃描。使用Skyscan 1172 X射線計(jì)算機(jī)斷層攝影系統(tǒng)（Bruker Corporation）進(jìn)行樣品掃描，掃描參數(shù)設(shè)置參照Z(yǔ)hang等設(shè)置的CT掃描參數(shù)[17]。（6）圖像重構(gòu)。利用Skyscan NRecon軟件（Bruker Corporation）進(jìn)行重構(gòu)，亨氏單位（HU）統(tǒng)一設(shè)置為-500～9 40，獲得一系列玉米穗位節(jié)橫截面為8位（8-bit）的圖像文件格式（bmp），用于后期表型特征提取與分析。（7）表型指標(biāo)提取。使用VesselParser 4.0對(duì)莖稈CT圖像進(jìn)行處理，自動(dòng)獲取表型指標(biāo)。

1.4 表型數(shù)據(jù)分析

利用R語(yǔ)言（https：//cran.r-project.org/）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。首先，采用“l(fā)m”函數(shù)進(jìn)行線性回歸分析，建立實(shí)測(cè)值與VesselParser 4.0軟件提取值之間的線性模型;然后，利用psych包對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)合CT圖像進(jìn)行莖稈不同節(jié)間形態(tài)及表型指標(biāo)對(duì)比分析;最后，對(duì)表型指標(biāo)進(jìn)行不同自交系間或不同節(jié)間的單因素方差分析。數(shù)據(jù)分析結(jié)果的可視化由ggplot2包呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同節(jié)間顯微成像及基于區(qū)帶的維管束表型特征解析

參照Z(yǔ)hang等已有的基部第3節(jié)維管束表型解析結(jié)果[18]，利用Micro-CT掃描技術(shù)同時(shí)對(duì)玉米莖稈上中下關(guān)鍵的基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)進(jìn)行顯微圖像獲取。從圖1中原始圖像可以看出，在外部形態(tài)上，從基部第3節(jié)到穗位節(jié)再到頂位節(jié)，玉米橫切面呈橢圓—扇形—圓形變化，橫切面面積依次減小。維管束分布在周皮和髓組織，其中周皮維管束較大，分布密集，髓組織維管束較小，分布松散。在基部第3節(jié)中，周皮維管束有3～4層，維管束間分布緊密;穗位節(jié)的周皮維管束有1～2層，但分布不均勻，其中凹面分布著1層維管束，凸面分布著2層維管束;在頂位節(jié)中，周皮分布著1層間距稀疏的維管束。

采用基于區(qū)帶的維管束表型解析方法對(duì)不同節(jié)間顯微圖像進(jìn)行解析，可將莖稈橫切面分割為3個(gè)功能區(qū)，分別為表皮區(qū)、周皮區(qū)和髓區(qū)。結(jié)果表明，針對(duì)基部第3節(jié)內(nèi)部物質(zhì)分布（CT值）提出的基于區(qū)帶的維管束表型解析新方法不受莖稈外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的影響，在莖稈穗位節(jié)和頂位節(jié)間表型解析均具有較好的適用性。對(duì)玉米莖稈不同節(jié)間橫切面進(jìn)行功能區(qū)劃分后，維管束根據(jù)分布位置差異，分為周皮區(qū)維管束和髓區(qū)維管束。按照傳統(tǒng)維管束分類標(biāo)準(zhǔn)[20]，即根據(jù)維管束面積和結(jié)構(gòu)將其分為大維管束和小維管束，本研究使用的基于區(qū)帶的維管束表型解析方法除維管束面積外，還參考了維管束內(nèi)部空腔大小、CT值和分布密度，因而能夠反映莖稈不同節(jié)間內(nèi)部物質(zhì)含量、維管束結(jié)構(gòu)特征和分布變化。利用該方法處理單張CT圖像，可一次性自動(dòng)獲取47項(xiàng)表型指標(biāo)（表1），可分為莖稈橫切面類（8項(xiàng)）、表皮區(qū)類（3項(xiàng)）、周皮區(qū)類（10項(xiàng)）、髓區(qū)類（10項(xiàng)）和維管束類（13項(xiàng)）。其中橫切面類、維管束類歸類于傳統(tǒng)表型指標(biāo)，表皮區(qū)類、周皮區(qū)類、髓區(qū)類表型指標(biāo)歸類于功能區(qū)表型指標(biāo)。

為評(píng)價(jià)采用VesselParser 4.0獲取的穗位節(jié)和頂位節(jié)表型指標(biāo)精度，利用ImageJ軟件手動(dòng)統(tǒng)計(jì)穗位節(jié)和頂位節(jié)節(jié)間的維管束總數(shù)量（VB_N），然后與VesselParser 4.0自動(dòng)解析的VB_N進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖2所示。在穗位節(jié)中，線性回歸模型的決定系數(shù)r2為0.98;在頂位節(jié)中，線性回歸模型的決定系數(shù)r2為0.95。兩節(jié)位的模型決定系數(shù)均接近 表明基于VesselParser 4.0軟件獲取的 VB_N 與實(shí)測(cè)值吻合程度高，說(shuō)明本研究采用VesselParser 4.0獲取的莖稈節(jié)間表型指標(biāo)精度高，可用于后續(xù)不同節(jié)間的特征分析。4FC70124-2524-41CF-BEF5-849E79D3D36F

由表2可知，同石蠟切片與人工測(cè)量等傳統(tǒng)維管束表型獲取方法相比[21-22]，Micro-CT掃描技術(shù)簡(jiǎn)化了前期制樣流程，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法可在 0 s 左右完成單張圖像的表型解析，且支持批處理，大大提高了莖稈維管束表型的獲取效率，適合大群體維管束表型指標(biāo)高通量獲取。此外，傳統(tǒng)方法獲取的維管束表型指標(biāo)（如大、小維管束數(shù)量和面積）是在顯微圖像的局部區(qū)域中獲取;而本研究是基于完整的橫切面圖像提取到表征莖稈橫切面及各區(qū)帶幾何、形態(tài)性狀，以及維管束數(shù)量、形狀、面積、分布等幾大類重要表型指標(biāo)，獲取的表型指標(biāo)類型豐富，且數(shù)量多達(dá)傳統(tǒng)研究方法的5倍以上。以上結(jié)果表明，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法不僅能實(shí)現(xiàn)玉米不同節(jié)位莖稈維管束表型指標(biāo)的高通量獲取，還能實(shí)現(xiàn)表型指標(biāo)的精準(zhǔn)解析。

2.2 玉米莖稈不同節(jié)間表型指標(biāo)描述性統(tǒng)計(jì)分析

分別對(duì)玉米莖稈基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)的47項(xiàng)表型指標(biāo)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，進(jìn)而分析不同節(jié)間表型特征。以表征玉米莖粗的表型指標(biāo)SZ_LA作為參照，對(duì)比分析各項(xiàng)表型指標(biāo)的變異情況。

由表3可知，基部第3節(jié)的SZ_LA變異系數(shù)（CV）為16.35%，其余指標(biāo)中有26項(xiàng)表型指標(biāo)的變異系數(shù)大于16.35%，其中功能區(qū)表型指標(biāo)占一半以上（表皮區(qū)3項(xiàng)，周皮區(qū)6項(xiàng)，髓區(qū)6項(xiàng)）。在基部第3節(jié)中，變異系數(shù)最大的表型指標(biāo)為IZ_VB_CA（CV=42.25%），是SZ_LA的2.6倍左右。在穗位節(jié)中，有28項(xiàng)表型指標(biāo)的變異系數(shù)大于SZ_LA的變異系數(shù)（CV=15.42%），其中功能區(qū)表型指標(biāo)有16項(xiàng)（表皮區(qū)3項(xiàng)，周皮區(qū)7項(xiàng)，髓區(qū)6項(xiàng)）。穗位節(jié)的VB_LWR變異系數(shù)（CV=33.75%）最大，是 SZ_LA 的變異系數(shù)的2.2倍左右。頂位節(jié)的 SZ_LA 變異系數(shù)為19.71%，其余指標(biāo)中有25項(xiàng)表型指標(biāo)的變異系數(shù)大于19.71%，其中表皮區(qū)3項(xiàng)，周皮區(qū)5項(xiàng)，髓區(qū)6項(xiàng)。而且IZ_VB_CA在頂位節(jié)中變異系數(shù)（CV=43.36%）最大，是SZ_LA變異系數(shù)的2.2倍。

描述統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，SZ_LA在不同節(jié)間的變異系數(shù)不同，尤其是在穗位節(jié)時(shí)最小，這可能與穗位節(jié)外部形態(tài)結(jié)構(gòu)相關(guān)。此外，以SZ_LA為變異系數(shù)分界線，高于該分界線的表型指標(biāo)中，至少有一半指標(biāo)為功能區(qū)表型指標(biāo)，特別是基部第3節(jié)和頂位節(jié)表型變異系數(shù)最大的表型指標(biāo)均來(lái)自功能區(qū)類（IZ_VB_CA）。結(jié)果表明，同傳統(tǒng)指標(biāo)相比，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法獲取的功能區(qū)表型指標(biāo)能更好地反映出不同自交系間的差異。

2.3 玉米莖稈不同節(jié)間表型指標(biāo)方差分析

分別對(duì)基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)的47項(xiàng)表型指標(biāo)進(jìn)行不同自交系間的差異分析。方差分析結(jié)果（表4）顯示，基部第3節(jié)的47項(xiàng)表型指標(biāo)在不同自交系間均存在顯著差異（P<0.05），其中 SZ_LA 在不同自交系間的P=5.11×10-18，與顯著性最高的PZ_VB_N（P=7.79×10-29）相差11個(gè)數(shù)量級(jí)。在穗位節(jié)中，47項(xiàng)表型指標(biāo)均在不同自交系間存在顯著差異（P<0.05）。SZ_LA在不同自交系間的顯著性為P=5.96×10-2 與顯著性最高的 PZ_VB_AR（P=1.79×10-26）相差5個(gè)數(shù)量級(jí)。在頂位節(jié)中，除SRVB外，其余46項(xiàng)表型指標(biāo)在不同自交系間均存在顯著差異（P<0.05）。其中，差異性最高的表型指標(biāo)為VB_N（P=1.25×10-21），與 SZ_LA（P=8.20×10-14）相差7個(gè)數(shù)量級(jí)。

方差分析結(jié)果還顯示，盡管基部第3節(jié)、穗位節(jié)和頂位節(jié)的47項(xiàng)表型指標(biāo)大多在P<0.05水平上存在顯著差異，但是不同節(jié)間差異最顯著的表型指標(biāo)卻各不相同。其中，基部第3節(jié)和穗位節(jié)差異最顯著的指標(biāo)均為功能區(qū)的周皮區(qū)類表型指標(biāo)，進(jìn)一步表明基于區(qū)帶進(jìn)行維管束解析更有助于莖稈維管束表型精準(zhǔn)鑒定。此外，同描述統(tǒng)計(jì)結(jié)果相似，穗位節(jié)的SZ_LA在不同自交系間的差異顯著性水平高于其他節(jié)間，可能與穗位節(jié)外部形態(tài)結(jié)構(gòu)相關(guān)。

2.4 玉米不同節(jié)間維管束表型指標(biāo)隨葉序分布趨勢(shì)研究

為研究表型指標(biāo)在單株尺度內(nèi)的分布情況，對(duì)47項(xiàng)表型指標(biāo)做關(guān)于不同節(jié)間的方差分析。結(jié)果顯示，除SZ_LWR外，其余46項(xiàng)表型指標(biāo)在基部第3節(jié)、穗位節(jié)和頂位節(jié)間均存在顯著差異（P<0.05）。隨后，對(duì)差異顯著的46項(xiàng)表型指標(biāo)進(jìn)行3個(gè)節(jié)間的多重比較分析，進(jìn)一步探究各表型指標(biāo)在基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)的具體分布，并將結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

由圖3可知，除莖稈橫切面類表型指標(biāo)和維管束類表型指標(biāo)等傳統(tǒng)表型指標(biāo)，基于區(qū)帶獲取的新表型指標(biāo)在3個(gè)節(jié)間具有明顯的分布規(guī)律。首先是橫切面類（SZ_A、SZ_CA、SZ_CCA、SZ_P、SZ_LA、SZ_SA）和維管束類（VB_N、VB_A、VB_Aave、VB_CAave、VB_CCAave、VB_LAave、VB_SAave、VB_Pave、ARIVB）等傳統(tǒng)表型指標(biāo)，從基部第3節(jié)到穗位節(jié)再到頂位節(jié)呈依次減小的趨勢(shì)，并且兩兩節(jié)間差異顯著。其次是基于區(qū)帶獲得的新表型指標(biāo)，功能區(qū)面積（EZ_A、IZ_A、PZ_A）、功能區(qū)厚度（IZ_T、PZ_T）以及功能區(qū)維管束數(shù)量（IZ_VB_N、PZ_VB_N）、面積（IZ_VB_A、PZ_VB_A）和凸包面積（IZ_VB_CA、PZ_VB_CA），從基部到頂部呈依次減小的趨勢(shì)，并且兩兩節(jié)間差異顯著。

同VB_D分布一樣，PZ_VB_D和IZ_VB_D從基部第3節(jié)到穗位節(jié)再到頂位節(jié)呈依次增加趨勢(shì)。此外，表型指標(biāo)EZ_AR、PZ_VB_AA、VB_LWR也呈現(xiàn)同樣的分布趨勢(shì)，并且兩兩節(jié)間差異顯著。

此外，IZ_AR、IZ_VB_CAR從基部第3節(jié)到穗位節(jié)再到頂位節(jié)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，且在穗位節(jié)時(shí)顯著大于其他2個(gè)節(jié)間。而PZ_AR、SZ_CAR呈現(xiàn)相反的分布趨勢(shì)，且在穗位節(jié)時(shí)顯著小于基部第3節(jié)和頂位節(jié)。4FC70124-2524-41CF-BEF5-849E79D3D36F

綜合差異分析結(jié)果可知，47項(xiàng)表型指標(biāo)中有36項(xiàng)在基部第3節(jié)、穗位節(jié)和頂位節(jié)具有明顯的分布趨勢(shì)，其中有18項(xiàng)表型指標(biāo)來(lái)自各功能區(qū)。此外，從基部到頂部分布趨勢(shì)并非依次減小的表型指標(biāo)主要來(lái)自各功能區(qū)，如IZ_AR、PZ_AR，這些表型指標(biāo)可為后期進(jìn)行節(jié)間功能研究和性狀定向改良提供參考。

3 討論與結(jié)論

3.1 基于區(qū)帶的玉米不同節(jié)間維管束表型特征精準(zhǔn)解析

基于區(qū)帶的維管束表型解析方法于2021年由Zhang等首次提出[18]。該團(tuán)隊(duì)通過(guò)Micro-CT掃描技術(shù)和圖像處理軟件VesselParser 4.0對(duì)玉米基部第3節(jié)的維管束表型進(jìn)行研究，并根據(jù)莖稈內(nèi)物質(zhì)分布將橫切面分割為3個(gè)功能區(qū)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)玉米莖稈基部第3節(jié)橫切面的精準(zhǔn)分割以及維管束結(jié)構(gòu)及分布變化的特征提取。本研究基于Zhang等的研究結(jié)果[18]，首次將基于區(qū)帶的維管束表型解析新方法應(yīng)用于穗位節(jié)和頂位節(jié)，獲取效率高達(dá)20 s/張圖像，相較傳統(tǒng)手段一次性可獲得的表型指標(biāo)增至5倍以上，實(shí)現(xiàn)了表型指標(biāo)的高通量獲取。最終在3個(gè)節(jié)間均獲取了包括莖稈橫切面及各區(qū)帶幾何形態(tài)性狀和維管束數(shù)量、面積及分布等在內(nèi)的47項(xiàng)表型指標(biāo)。對(duì)比分析不同節(jié)間CT圖像，結(jié)果表明，雖然穗位節(jié)和頂位節(jié)在外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)上與基部第3節(jié)存在明顯差異，但是應(yīng)用于基部第3節(jié)橫切面的功能區(qū)分割方法同樣適用于穗位節(jié)和頂位節(jié)的研究，表明基于區(qū)帶的維管束表型解析方法對(duì)玉米莖稈不同節(jié)位均具有較好的適用性。此外，穗位節(jié)和頂位節(jié)的VB_N線性回歸模型的決定系數(shù)均高于0.95，表明通過(guò)VesselParser 4.0軟件自動(dòng)解析的表型指標(biāo)精度較高。

3.2 玉米不同節(jié)間維管束表型特征差異分析

玉米莖稈不同節(jié)間維管束表型特征不同。47項(xiàng)表型指標(biāo)在不同自交系間的差異分析結(jié)果表明，盡管多項(xiàng)表型指標(biāo)在基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)間存在顯著差異，但是不同節(jié)間差異最顯著的表型指標(biāo)卻并不相同。其中，不同節(jié)間維管束表型差異最顯著的表型指標(biāo)分別為基部第3節(jié)的PZ_VB_N（P=7.79×10-29）、穗位節(jié)的PZ_VB_AR（P=1.79×10-26）和頂位節(jié)的VB_N（P=1.25×10-21），其中前2項(xiàng)指標(biāo)均為功能區(qū)表型指標(biāo)，進(jìn)一步表明基于區(qū)帶進(jìn)行維管束解析更有助于莖稈維管束表型精準(zhǔn)鑒定。

已有研究表明，基部第3節(jié)是植株抗倒伏研究的重要對(duì)象[23]。蔣傲男等的研究表明，維管束數(shù)量與基部第3節(jié)穿刺強(qiáng)度呈顯著負(fù)相關(guān)[24];李波等研究發(fā)現(xiàn)，小維管束數(shù)量在莖稈穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用[25]。在本研究的方差分析結(jié)果中，基部第3節(jié)的PZ_VB_N和VB_N在不同自交系間差異最顯著，據(jù)此推斷這2項(xiàng)表型指標(biāo)可能與玉米莖稈抗倒伏性的相關(guān)程度較高。在穗位節(jié)相關(guān)的研究中，何啟平等研究發(fā)現(xiàn)由莖節(jié)維管束等橫向分支組成的穗部維管束系統(tǒng)是養(yǎng)分從植株運(yùn)輸?shù)阶蚜Ｖ械闹匾Ｕ蟍26]。Ren等研究發(fā)現(xiàn)，穗位節(jié)間大維管束面積占總維管束面積比例的均值小于小維管束面積占總維管束面積的比例，而增施氮肥有利于增加小維管束面積占總維管束面積的比例，提高物質(zhì)運(yùn)輸速率，加快光合產(chǎn)物向庫(kù)運(yùn)輸[5]。侯彥龍等也指出維管束面積大有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸[27]。而本研究在穗位節(jié)間表型指標(biāo)關(guān)于不同自交系間的差異分析結(jié)果表明，PZ_VB_AR、IZ_VB_AR、IZ_VB_N在不同自交系間差異最顯著。相較前人的研究，本研究獲取的表型指標(biāo)更精細(xì)，分區(qū)特征更明顯，可為穗位節(jié)的物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)研究提供參考。在玉米莖稈上部節(jié)間維管束的研究中，王越等利用198份玉米自交系對(duì)雄穗中部維管束性狀開展不同雜種優(yōu)勢(shì)群的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大、小維管束數(shù)量和單個(gè)大、小維管束面積在不同自交系間的差異均達(dá)到極顯著水平[28]。楊碩等利用172份玉米自交系對(duì)莖稈上部維管束數(shù)量進(jìn)行差異分析，結(jié)果同樣表明大、小維管束數(shù)量在不同自交系間呈極顯著差異[7]。而在本研究中，不同自交系在頂位節(jié)的差異分析結(jié)果顯示，除頂位節(jié)的VB_N、IZ_VB_N外，VB_AR也在0.05水平上存在顯著差異。

3.3 玉米不同節(jié)間維管束表型指標(biāo)隨葉序分布趨勢(shì)

莖稈維管束表型指標(biāo)在單株尺度內(nèi)莖稈不同節(jié)間分布趨勢(shì)明顯。對(duì)獲取的47項(xiàng)表型指標(biāo)進(jìn)行不同節(jié)間分布趨勢(shì)研究發(fā)現(xiàn)，表征橫切面及各功能區(qū)幾何、形態(tài)，以及維管束數(shù)量、面積相關(guān)的表型指標(biāo)從基部到頂部呈依次減小的趨勢(shì)。這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，如Ren等指出大、小維管束數(shù)量從基部節(jié)、穗位節(jié)、穗柄到穗軸呈減小趨勢(shì)[5];趙雪等指出玉米莖稈維管束數(shù)量從基部向上逐漸減小[29]。而表征維管束分布的表型指標(biāo)從基部到頂部呈依次增加的趨勢(shì)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)功能區(qū)面積占比從基部第3節(jié)到穗位節(jié)再到頂位節(jié)的分布趨勢(shì)不同，其中EZ_AR呈依次增加的趨勢(shì)，IZ_AR呈先增加后減小的趨勢(shì)，PZ_AR呈先減小后增加的趨勢(shì)。

綜上所述，本研究利用Micro-CT掃描技術(shù)及基于區(qū)帶的維管束表型解析方法，實(shí)現(xiàn)了玉米自交系不同節(jié)間維管束表型的高通量獲取與精準(zhǔn)解析，并首次證明基于區(qū)帶的維管束表型解析方法對(duì)不同節(jié)位均具有較好的適用性。方差分析結(jié)果顯示，47項(xiàng)表型指標(biāo)中，基部第3節(jié)和穗位節(jié)在不同自交系中差異最顯著的指標(biāo)均為周皮區(qū)類表型指標(biāo)，進(jìn)一步表明基于區(qū)帶的維管束解析方法相較傳統(tǒng)手段更有助于玉米莖稈維管束表型的精準(zhǔn)鑒定。表型指標(biāo)從基部到頂部的分布趨勢(shì)研究表明，大部分表型指標(biāo)分布趨勢(shì)一致，均呈依次減小的趨勢(shì)，但功能區(qū)（表皮區(qū)/周皮區(qū)/髓區(qū)）面積占比卻不一致，表明基于區(qū)帶的維管束解析方法獲取的表型指標(biāo)更能突顯出不同節(jié)間差異，進(jìn)而為后續(xù)遺傳學(xué)分析和性狀定向改良提供表型參考。

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