劉永飛，蘇偉，梁琪琪，李青云，2，劉幽燕，2，唐愛星，2

（1 廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2 廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530007）

-蒎烯（-pinene，CH）是我國的優(yōu)勢資源松節(jié)油的主要成分，是自然界中存在量最多的單萜烯烴之一。-蒎烯可以通過化學法、生物法和化學酶法等方法合成-蒎烯環(huán)氧化物（也叫2,3-環(huán)氧蒎烷），這是一種具有清涼氣息的重要香料中間體，可進一步合成兩百多種香料或有生理活性的精細化學品。當前工業(yè)化的-蒎烯環(huán)氧化反應用強酸作為催化劑，反應速度快，但常伴隨著許多副反應的發(fā)生，而且酸易造成設備腐蝕。酶催化具有反應條件溫和、選擇性高的特點，但直接使用酶催化烯烴環(huán)氧化往往需要使用相對昂貴的單加氧酶類，如細胞色素P450、葡萄糖單加氧酶等。而化學酶法環(huán)氧化使用相對廉價的脂肪酶做催化劑，反應一共分為兩步：首先?；w（脂肪酸或脂肪酸酯）和過氧化氫在脂肪酶的催化下生成過氧羧酸，然后依據(jù)Prileshajev 反應原理，過氧羧酸自催化烯烴生成環(huán)氧化物（如圖1）。由于化學酶法環(huán)氧化結合了化學法和生物法的優(yōu)點，得到了研究者的廣泛關注。

圖1 脂肪酶催化α-蒎烯環(huán)氧化反應的機理

目前，化學酶法蒎烯環(huán)氧化的研究基本都是在兩相體系中進行的，-蒎烯、?；w等疏水性底物溶解在有機溶劑（例如甲苯）中，與氧化劑過氧化氫水溶液構成有機-水“雙相”反應體系。但雙相反應體系受制于兩相間的傳質(zhì)速率影響，導致環(huán)氧化反應速率低，而且還存在著酶與高濃度的水相過氧化氫直接接觸易失活的問題。一些研究者通過改變反應物濃度、?；w類型等因素，可以部分優(yōu)化環(huán)氧化反應性能；而Bhalerao 等在研究脂肪酶催化大豆油環(huán)氧化反應時，為了加快環(huán)氧化反應速度，運用超聲輔助的方法來強化界面處過氧化氫的物質(zhì)傳輸。然而，由于水相高濃度過氧化氫的存在，雙相體系中固定化脂肪酶的穩(wěn)定性仍然面臨挑戰(zhàn)。有研究人員采用尿素-過氧化氫（UHP）取代含水的過氧化氫水溶液，通過過氧化氫的緩慢釋放降低對酶的毒害作用，提高了脂肪酶的穩(wěn)定性。此外，Meyer 等還設計了一種蒎烯環(huán)氧化的連續(xù)攪拌釜式反應器，以預飽和過氧化氫的乙酸乙酯作為反應器的流動相。由于沒有水性過氧化氫，反應器可以穩(wěn)定運行17 天，轉(zhuǎn)化率約為60%。這些實驗成功地提高了固定化脂肪酶的穩(wěn)定性，但犧牲了環(huán)氧化反應效率。周鵬飛等報道了一種天然低共熔溶劑（DES）體系，可以將烯烴、酰基供體和過氧化氫融在一起形成單相體系，以Novozym435催化環(huán)氧化時轉(zhuǎn)化率最高為72.4%。雖然DES 體系中也存在著脂肪酶易失活和流動性低的問題，但是構建單相體系的方法提供了一個解決問題的思路。

水互溶性有機溶劑，如醇類、乙腈、丙酮等，既可以與水互溶，也能溶解疏水性有機物，可以使烯烴環(huán)氧化反應的疏水性底物與水性過氧化氫較好地融為一體，構建單相反應體系。雖然過去通常認為親水性有機溶劑易于奪取酶的結合水從而使酶失活，但是近年來的研究表明，帶羥基官能團的溶劑可以導致酶的活化，而且酶的穩(wěn)定性與羥基的數(shù)量和位置有關。Zhao等觀察到南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）在叔丁醇溶液中高效的催化活性，而且叔丁醇對酶的抑制性較小，作為酯化反應底物的反應性也較低。分子動力學模擬表明，CALB在叔丁醇中的高相容性是由幾個原因造成的，例如叔丁醇中蛋白質(zhì)的高彈性、維持良好的底物入口大小和酶的結合口袋大小，以及酶活性中心Ser105的氫鍵保護。本文嘗試采用叔丁醇為溶劑，構建蒎烯環(huán)氧化的單相體系，以期消除界面影響，降低水性過氧化氫對酶的失活，提高蒎烯環(huán)氧化的效率，再根據(jù)單相體系脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化的特性，設計適用于單相體系的-蒎烯環(huán)氧化的反應器，探索其工業(yè)化應用的潛力。

1 實驗

1.1 實驗材料

-蒎烯和十二烷，分析純，阿拉?。籒ovozym435 購自諾維信生物技術有限公司；-蒎烯環(huán)氧化物，GC 標準品，Extrasynthese（法國）；過氧化氫（30%），分析試劑級，上海麥克林生化科技有限公司；乙酸乙酯，分析純，中國大茂化學試劑廠；檸檬酸三鈉二水合物（NaCHO），分析純，西隴科學股份有限公司；碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 叔丁醇體系脂肪酶催化α-蒎烯環(huán)氧化的條件優(yōu)化

配制含-蒎烯0.3mol/L、乙酸乙酯3.5mol/L 和0.5mol/L 過氧化氫（30%）的2mL 叔丁醇溶液，再在溶液中加入0.6mmol 束酸劑（檸檬酸三鈉）和40mg Novozym435，置于平行合成儀中，40℃、150r/min 下反應90min 后取樣，同時設置不含酶的空白組。將樣品在14000下離心5min，加入內(nèi)標液進行氣相分析測定轉(zhuǎn)化率和收率。

（1）乙酸乙酯濃度的影響 調(diào)整乙酸乙酯濃度分別為1～4mol/L，其余條件不變，考察?；w乙酸乙酯對蒎烯環(huán)氧化的影響。

（2）過氧化氫濃度的影響 調(diào)整過氧化氫濃度分別為0.2～1mol/L，其余條件不變，考察氧化劑過氧化氫對蒎烯環(huán)氧化的影響。

（3）束酸劑種類的影響 調(diào)整束酸劑種類分別為碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸三鈉和磷酸二氫鈉，其余條件不變，考察束酸劑對蒎烯環(huán)氧化的影響。

1.3 單相和雙相體系的環(huán)氧化反應比較

單相體系：9mL 叔丁醇中含有-蒎烯（0.3mol/L）、乙酸乙酯（3.5mol/L），然后添加0.49mL 過 氧 化 氫（30%）， 隨 后 加 入180mg Novozym435和0.6mmol 檸檬酸三鈉，40℃置于平行合成儀中催化反應，間隔取樣，氣相分析測定轉(zhuǎn)化率和收率。

甲苯-水雙相體系：9mL 甲苯中含有-蒎烯（0.3mol/L）、乙酸乙酯（3.5mol/L），然后添加0.49mL 過氧化氫（質(zhì)量分數(shù)30%），隨后加入180mg Novozym435 和0.6mmol 檸檬酸三鈉，40℃置于平行合成儀中催化反應，間隔取樣，氣相分析測定轉(zhuǎn)化率和收率。

1.4 單相體系中脂肪酶的可重用性

按照1.2 節(jié)的反應條件進行蒎烯環(huán)氧化反應，反應結束后，在14000下離心5min，取100μL 溶液進行氣相分析，并分離固定化酶。在下一批次反應之前，固定化脂肪酶按水-水-叔丁醇的順序洗滌。相對活力被定義為每批次使用的環(huán)氧化轉(zhuǎn)化率與第一次轉(zhuǎn)化率的比率。

1.5 CSTR反應器工藝條件優(yōu)化

在釜式反應器中配制含0.3mol/L-蒎烯、適量過氧化氫（0.1～1.5mol/L）、適量乙酸乙酯（2～4mol/L）的叔丁醇溶液，加入適量固定化酶（0.5～3g）和1g 檸檬酸三鈉，水浴40℃，開攪拌運行反應器，每隔半小時取反應器內(nèi)的溶液200μL 待測，3h 后，泵運行，開始補充與初始相同濃度的底物溶液，產(chǎn)物從上口流出，保持進料和出料速度一致，繼續(xù)每隔0.5h取出口物料200μL待測。以反應器達到穩(wěn)定狀態(tài)時的轉(zhuǎn)化率和收率數(shù)據(jù)作為該實驗條件下的實驗結果。

空白組對照：不加酶，其他條件不變，每隔0.5h測定進料和出料的-蒎烯濃度。

1.6 CSTR反應器的長期運行性能

配制含0.3mol/L-蒎烯、0.5mol/L 過氧化氫、3.5mol/L 乙酸乙酯的叔丁醇溶液作為反應器流動相，在釜式反應器中加入2.0g 固定化酶和1g 檸檬酸三鈉，設定物料流率為0.27mL/min（即物料平均停留時間3h），水浴40℃，啟動反應器運行，間隔取出口物料200μL 待測，直至轉(zhuǎn)化率和收率開始下降。

1.7 氣相檢測方法

使用氣相色譜（GC-FID）進行分析。毛細管柱 的 型 號 為 HP-1 （Αgilent， 30m×0.25mm×0.25μm），注射室和檢測器的溫度分別為220℃和230℃，分流比為1∶20。升溫程序為100℃時保持3min，然后以20℃/min 到160℃，然后保持1min。產(chǎn)物通過與標準品對比進行鑒定。十二烷作為內(nèi)標物，以內(nèi)標法來測定-蒎烯和-蒎烯環(huán)氧化物的含量。首先制備了含有十二烷的參考溶液（RS），取100μL 待測樣品與100μL RS 充分混合，然后取1μL注入氣相色譜。

1.8 實驗裝置

該裝置包括一個帶磁力攪拌子的連續(xù)攪拌釜式反應器（運行體積=50mL）、磁力攪拌恒溫水浴鍋、恒流泵和兩個密封的溶液罐，反應器的進出口由軟管連接，反應器與原料罐和產(chǎn)品罐之間各裝有一個恒流泵。反應器的進出口處，各有一個不銹鋼網(wǎng)篩，以防止酶顆粒進入軟管。CSTR 反應器裝置如圖2所示。

圖2 CSTR裝置示意圖

2 結果與討論

2.1 乙酸乙酯濃度的影響

在不同乙酸乙酯濃度下，叔丁醇單相體系環(huán)氧化轉(zhuǎn)化率和收率如圖3。隨著乙酸乙酯濃度的增大，轉(zhuǎn)化率和收率都在逐漸提高，當濃度為3.5mol/L時，環(huán)氧化轉(zhuǎn)化率和收率達到最高，分別為93%和86%。脂肪酶催化的過酸生成反應的機理已經(jīng)被研究和報道，?；w是化學-酶法環(huán)氧化的重要媒介，貫穿于兩步反應當中，其不僅影響著過酸的生成同時影響著催化烯烴環(huán)氧化的效率。如Xu 等發(fā)現(xiàn)使用內(nèi)酯作為酰基供體可能有助于維持酶的活力和穩(wěn)定性，而且通過調(diào)節(jié)?；w的量，可以促進過酸的形成，從而提高環(huán)氧化的性能。乙酸乙酯作為?；w，其濃度越高，催化產(chǎn)生的過氧乙酸越多，環(huán)氧化反應的轉(zhuǎn)化率就越高；而當?；w達到一定量時，酶催化也達到飽和，其環(huán)氧化轉(zhuǎn)化率和收率都不再提高，基于資源合理化利用考慮，在單相體系脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化中選擇乙酸乙酯的最適濃度為3.5mol/L。

圖3 不同乙酸乙酯濃度對α-蒎烯環(huán)氧化反應的影響

2.2 過氧化氫濃度的影響

過氧化氫由于價格相對便宜，副產(chǎn)物是水從而具有無污染、原子經(jīng)濟性高的優(yōu)點，是蒎烯環(huán)氧化中使用最普遍的一種氧化劑，但過氧化氫即作為底物又作為酶失活劑，其濃度對環(huán)氧化反應的最終轉(zhuǎn)化率和收率都有重要的影響。在叔丁醇體系中，不同濃度過氧化氫中進行脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化的結果如圖4所示。在低濃度下，隨著過氧化氫濃度的升高，環(huán)氧化反應的轉(zhuǎn)化率和收率迅速升高，直至0.5mol/L時，轉(zhuǎn)化率和收率達到最大，分別為92%和88%。繼續(xù)升高過氧化氫濃度，轉(zhuǎn)化率和收率不再增加并開始緩慢減弱。通常過氧化氫濃度決定脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化的反應速率，但是高濃度的過氧化氫會使酶失活，從而會限制酶促反應。Skouridou等研究了過氧化氫的濃度對蒎烯環(huán)氧化反應的影響，發(fā)現(xiàn)隨著過氧化氫加入量的增加，脂肪酶的穩(wěn)定性變差。Aouf等報道了一項過氧化氫失活青梅脂肪酶的機理研究，結論表明過氧化氫與脂肪酶中心之間通過氫鍵的結合是限制脂肪酶過水解能力，從而導致了脂肪酶失活的原因。因此，適合叔丁醇單相體系脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化的過氧化氫濃度為0.5mol/L。

圖4 不同過氧化氫濃度對α-蒎烯環(huán)氧化反應的影響

2.3 束酸劑種類的影響

化學酶法催化蒎烯環(huán)氧化反應產(chǎn)生的酸性副產(chǎn)物會導致環(huán)氧蒎烷發(fā)生水解或者異構等現(xiàn)象，從而降低反應的收率，通常加入束酸劑來降低酸性副產(chǎn)物的影響。本實驗考察了碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸三鈉和磷酸二氫鈉等五種無機鹽作為束酸劑的影響，結果如圖5所示。與無束酸劑體系相比，添加束酸劑后環(huán)氧化反應的收率明顯更高，表明束酸劑可抑制產(chǎn)物分解，從而可提高蒎烯環(huán)氧化的收率。其中，當添加碳酸氫鈉和碳酸鈉時，環(huán)氧化反應的轉(zhuǎn)化率有明顯降低，其原因可能與碳酸鈉為高堿性（高p）的鹽，易使酶失活，不利于環(huán)氧化反應有關。而添加磷酸氫二鈉、檸檬酸三鈉和磷酸二氫鈉作為束酸劑時，轉(zhuǎn)化率基本維持不變，收率都有明顯提升，其中檸檬酸三鈉的收率最高，可達88%，所以后續(xù)實驗選用檸檬酸三鈉作為束酸劑。

圖5 束酸劑種類對α-蒎烯環(huán)氧化的影響

2.4 雙相體系和單相體系蒎烯環(huán)氧化的比較

圖6為甲苯-水雙相體系的脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化反應進程，在甲苯-水雙相體系中，隨著反應時間的增加，環(huán)氧化反應的轉(zhuǎn)化率、收率先是快速升高，90min時分別達到65%和62%，然后轉(zhuǎn)化率基本保持穩(wěn)定而收率開始下降，表明隨著反應的進行，副產(chǎn)物有機酸積累導致產(chǎn)物部分分解。另外，有機相中的過氧化氫濃度隨反應時間緩慢增加，到60min 后，增加至0.27mol/L 并保持不變，這是由于相界面的傳質(zhì)阻力使得過氧化氫從水相擴散到有機相需要一定時間，同時由于過氧化氫在甲苯中的溶解度不高，使得參與環(huán)氧化反應的過氧化氫濃度低，這也是導致雙相體系環(huán)氧化反應轉(zhuǎn)化率和收率較低的原因。圖7展示了叔丁醇單相體系中脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化反應進程，隨著反應時間增加，轉(zhuǎn)化率和收率也逐漸增大，90min時轉(zhuǎn)化率和收率分別可達到93%和88%，環(huán)氧化效果明顯高于雙相（甲苯-水）體系。另外，過氧化氫濃度從開始的0.5mol/L 降為最后的0.2mol/L，表明反應始終在較高的過氧化氫濃度下進行，這可能是單相體系轉(zhuǎn)化率和收率更高的原因。而且在叔丁醇單相體系中環(huán)氧化產(chǎn)物沒有明顯的分解現(xiàn)象，表明叔丁醇體系對抑制酸分解作用也是有利的。

圖6 甲苯-水相中α-蒎烯環(huán)氧化反應

圖7 叔丁醇中α-蒎烯環(huán)氧化反應

2.5 叔丁醇體系中脂肪酶的可重用性

可重用性也是評價固定化脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化體系優(yōu)越性的一項重要指標。由圖8 可知，當過氧化氫濃度為0.5mol/L 時，Novozym435 經(jīng)過6批次重用，其相對活力仍有64%，這個結果要明顯高于文獻報道的雙相反應體系，如Ankudey 等以乙酸乙酯為溶劑，過氧化氫水溶液為氧化劑構建雙相反應體系，以Novozym435 催化蒎烯環(huán)氧化時，固定化酶的活性在第二次使用后就完全消失。Skouridou 等在 甲 苯- 水 兩 相 體 系 中 以Novozym435 催化-蒎烯環(huán)氧化，產(chǎn)率最高僅為65%，且固定化酶重復使用5 批次后活力僅剩40%?？梢?，在雙相體系中，脂肪酶由于接觸水相中高濃度的過氧化氫從而極易失活。而在叔丁醇單相體系中，過氧化氫分散在醇溶劑中，降低了初始濃度，減弱了對酶的失活作用。因此，在叔丁醇體系中，固定化脂肪酶Novozym435 具有良好的穩(wěn)定性，從而具有進一步工業(yè)開發(fā)利用的潛力。

2.6 CSTR反應器中α-蒎烯環(huán)氧化工藝條件優(yōu)化

連續(xù)攪拌釜式反應器具有操作溫度和底物濃度易控制、反應釜中物料濃度處處相等并且等于反應器出口低濃度的特點，有利于降低反應體系過氧化氫濃度，減少對酶的失活作用，有利于反應器長期穩(wěn)定運行。本實驗在確定進料蒎烯濃度基礎上，對CSTR 反應器的給酶量和停留時間以及進料的過氧化氫濃度進行了優(yōu)化，結果如圖8所示。反應器的轉(zhuǎn)化率和收率先是隨酶量增大而提高[圖9(a)]，當酶量為2.5g，轉(zhuǎn)化率達到最高值，但此時選擇性低于2.0g；當酶量升至3.0g時，平衡轉(zhuǎn)化率并不能繼續(xù)提高，表明環(huán)氧化反應能力已達到飽和，繼續(xù)增加酶量并不能提高環(huán)氧化能力；當酶量2.0g時收率為最高79%，其選擇性也達到最高為96%，所以選用2.0g酶量為最佳反應酶量。由圖9(b)，叔丁醇單相體系中過氧化氫濃度小于1mol/L 時，反應器的轉(zhuǎn)化率隨過氧化氫濃度上升而上升，而在過氧化氫為1.5mol/L時，轉(zhuǎn)化率和收率發(fā)生了急速下降，表明高濃度的過氧化氫已經(jīng)導致脂肪酶的失活。在過氧化氫為1mol/L時，轉(zhuǎn)化率達到最高95%，但其收率（70%）和選擇性（74%）不如過氧化氫濃度為0.5mol/L 時（收率78%、選擇性94%），而且考慮到過氧化氫對酶的失活作用影響反應器長期運行的穩(wěn)定性，所以選用0.5mol/L 為最適過氧化氫濃度。圖9(c)展示了停留時間對CSTR 反應器中叔丁醇單相體系-蒎烯環(huán)氧化的影響，結果表明轉(zhuǎn)化率隨停留時間的增大而增大，但是收率和選擇性在停留時間小于3h 前是增大，但當停留時間超過3h 后，收率和選擇性出現(xiàn)了下降，因為過長的停留時間會導致環(huán)氧化產(chǎn)物環(huán)氧蒎烷在體系中分解，引起收率下降，所以釜式反應器的停留時間不宜過長。因此釜式反應器的最佳工藝條件為酶量為2.0g、最佳過氧化氫濃度為0.5mol/L、最佳停留時間為3h，此時反應器的轉(zhuǎn)化率可達83%，收率可達79%。

圖8 Novozym435在異丙醇系統(tǒng)中脂肪酶介導的環(huán)氧化反應中的重復使用穩(wěn)定性

圖9 CSTR反應器中酶量、過氧化氫濃度及停留時間對叔丁醇單相體系α-蒎烯環(huán)氧化的影響

2.7 CSTR反應器中α-蒎烯環(huán)氧化的長期運行

在最優(yōu)工藝條件下進行釜式反應器的長期運行，結果如圖10所示。結果表明CSTR反應器能夠穩(wěn)定運行10 天左右，在此期間轉(zhuǎn)化率可以保持70%以上，收率維持在55%以上，但在10 天后，轉(zhuǎn)化率和收率開始下降，15天后，收率僅有35%，表明此時酶開始失活。Meyer 等也設計一種-蒎烯環(huán)氧化CSTR 工藝，反應條件為溫度30℃、CALB 酶濃度11g/L、停留時間1.5h、氧化氫濃度0.7mol/L，最高收率為62%，在運行4 天后，其收率已為0，通過間歇式補加酶的方式，反應器可穩(wěn)定運行17天，收率穩(wěn)定在60%左右。

圖10 CSTR反應器中單相體系脂肪酶催化α-蒎烯環(huán)氧化的長期運行

3 結論

以叔丁醇為溶劑進行化學酶法催化-蒎烯環(huán)氧化，最優(yōu)工藝條件為乙酸乙酯濃度3.5mol/L，過氧化氫濃度0.5mol/L，束酸劑為0.6mmol 檸檬酸三鈉，蒎烯環(huán)氧化最高轉(zhuǎn)化率為92%、最高收率為88%。在此單相體系中，Novozym435 重用6 次后，仍保持64%的相對活力，表明該體系有利于保護酶的活性。利用自主設計的連續(xù)攪拌釜式反應器用于脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化，反應器運行體積為50mL，進料-蒎烯濃度為0.3mol/L 時，乙酸乙酯濃度為3.5mol/L 時，最優(yōu)工藝條件為酶量為2.0g、過氧化氫濃度為0.5mol/L、停留時間為3h。在此條件下反應器連續(xù)穩(wěn)定運行10 天，轉(zhuǎn)化率可以保持70%以上，收率維持在55%以上。