石濤 高艷 凡磊 周本正 丁志勇 張大虎

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院 (襄陽市第一人民醫(yī)院) 1泌尿外科，湖北 襄陽 441000；2綜合內(nèi)科)

腎癌(RC)是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～3%，Ⅲ期RC患者5年平均生存率為53%，轉(zhuǎn)移性RC患者5年平均生存率為8%〔1〕。腎切除術(shù)是局部腎癌的重要干預(yù)措施，但對于術(shù)后復(fù)發(fā)或有轉(zhuǎn)移的患者主要采用個(gè)性化靶向治療〔2〕。

研究表明，Micro RNA(miRNA)參與RC的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展，并與患者早期轉(zhuǎn)移的侵襲性腫瘤特征相關(guān)，可能是患者預(yù)后和疾病進(jìn)展的標(biāo)志物〔3〕。腎透明細(xì)胞癌中，miR-139-5p低表達(dá)，并與患者高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)〔4〕。本研究通過StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p與SLC39A7可能存在靶向關(guān)系。SLC39A7在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，miR-15a-3p下調(diào)SLC39A7通過Wnt/β-catenin信號通路抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔5〕。在宮頸癌〔6〕和結(jié)腸癌〔7〕中敲減SLC39A7可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SLC39A7在RC中表達(dá)和作用尚不清楚。根據(jù)預(yù)測結(jié)果和上述研究結(jié)果，本研究以RC細(xì)胞系為主要研究對象，假設(shè)miR-139-5p靶向SLC39A7基因通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)RC細(xì)胞周期和增殖，并對其進(jìn)行驗(yàn)證。以期為RC的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 人正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2及RC細(xì)胞系A(chǔ)498、786-O和SN12C-PM6購自美國ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；引物、miR-139-5p模擬物(miR-139-5p)、miR-139-5p抑制劑(anti-miR-139-5p)、SLC39A7過表達(dá)載體(pcDNA-SLC39A7)、SLC39A7抑制劑(si-SLC39A7)和對照(miR-con、anti-miR-con、si-con和pcDNA-con)及SLC39A7野生型和突變型雙熒光載體購自上海吉瑪制藥有限公司；SLC39A7抗體、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、CyclinE抗體、β-catenin抗體和β-actin抗體購自美國Abcam；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、總RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；光學(xué)顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、發(fā)光儀和qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 在DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)人正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2，在RPMI1640培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)RC細(xì)胞A498、786-O和SN12C-PM6，培養(yǎng)液中均含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，培養(yǎng)條件：在濕度95%，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，消化傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將786-O細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞，胰蛋白酶消化，以1×106個(gè)/ml接種于6孔板培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：miR-139-5p高表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-con和miR-139-5p)；SLC39A7敲減組(轉(zhuǎn)染si-con和si-SLC39A7)；miR-139-5p抑制組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con和anti-miR-139-5p)；miR-139-5p和SLC39A7高表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-139-5p+pcDNA-con和miR-139-5p+pcDNA-SLC39A7)；SLC39A7突變型(MUT，轉(zhuǎn)染miR-con+MUT、miR-139-5p+MUT)和野生型(WT，轉(zhuǎn)染miR-con+WT、miR-139-5p+WT)雙熒光素酶報(bào)告載體組。將載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的786-O細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR檢測RNA的表達(dá) 用Trizol試劑從HK-2、A498、786-O和SN12C-PM6細(xì)胞中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并檢測，然后以cDNA 為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng)，合成miR-139-5p和SLC39A7 mRNA，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 1 min；95℃ 30 s、59℃ 40 s、72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞存活率 將轉(zhuǎn)染后的786-O培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰蛋白酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基重懸并稀釋細(xì)胞，以濃度2×103個(gè)細(xì)胞/孔(200 μl細(xì)胞)接種于96孔板，NC組加入未轉(zhuǎn)染的786-O細(xì)胞，加入20 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 將轉(zhuǎn)染后的786-O培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用胰蛋白消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，清洗細(xì)胞，用70%冷乙醇固定細(xì)胞4℃過夜，離心收集細(xì)胞，加入500 μl配制好的碘化丙啶(PI)染色液，37℃避光孵育30 min，然后上流式細(xì)胞儀488 nm波長處檢測紅色熒光，計(jì)算各組G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞百分比。

1.2.6Western印跡 收集各組轉(zhuǎn)染的786-O細(xì)胞，室溫用放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液裂解細(xì)胞30 min，超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白，檢測蛋白濃度。將蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗，SLC39A7抗體(1∶1 000)、CyclinD1抗體(1∶3 000)、CyclinE抗體(1∶1 500)、β-catenin抗體(1∶6 000)和抗β-actin抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜。洗膜3次，然后加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.2方法培養(yǎng)786-O至細(xì)胞融和度為90%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建SLC39A7的WT和MUT雙熒光素酶報(bào)告載體，分別與miR-con或miR-139-5p共轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，離心收集上清，-20℃保存或直接檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1RC細(xì)胞系SLC39A7和miR-139-5p水平 與正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2組相比，RC細(xì)胞系A(chǔ)498、786-O和SN12C-PM6組細(xì)胞中SLC39A7的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)，miR-139-5p表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，見圖1和表1。SLC39A7和miR-139-5p在A498、786-O和SN12C-PM6腎癌細(xì)胞系中表達(dá)情況一致，采用786-O進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Western印跡檢測SLC39A7表達(dá)

表1 RC細(xì)胞系miR-139-5p和SLC39A7 水平

2.2高表達(dá)miR-139-5p抑制RC細(xì)胞786-O細(xì)胞周期和增殖 與NC組和miR-con組相比，miR-139-5p組miR-139-5p表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，CyclinD1和CyclinE表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.05)，S期細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.05)，見圖2和表2。說明過表達(dá)miR-139-5p可降低RC 786-O細(xì)胞的存活率，抑制細(xì)胞周期。

圖2 Western印跡檢測CyclinD1和CyclinE蛋白

表2 高表達(dá)miR-139-5p抑制RC細(xì)胞786-O細(xì)胞周期和增殖

2.3敲減SLC39A7抑制RC細(xì)胞786-O細(xì)胞周期和增殖 與NC組和si-con組相比，si-SLC39A7組786-O細(xì)胞中SLC39A7、CyclinD1和CyclinE表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.05)，S期細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.05)，見表3和圖3。說明敲減SLC39A7表達(dá)可抑制RC 786-O細(xì)胞周期和增殖。

2.4miR-139-5p靶向調(diào)控SLC39A7的表達(dá) StarBase預(yù)測結(jié)果顯示，SLC39A7的3′UTR序列中含有與miR-139-5p互補(bǔ)的核苷酸序列。見圖4A。構(gòu)建含有miR-139-5p結(jié)合位點(diǎn)的SLC39A7-3′UTR WT及MUT報(bào)告基因載體，在786-O細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-139-5p mimics和SLC39A7 WT及MUT報(bào)告基因載體，結(jié)果如表4所示，與miR-con組相比，miR-139-5p組WT-SLC39A7的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)；而MUT-SLC39A7的熒光素酶相對活性無明顯變化(P>0.05)。Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-con組SLC39A7蛋白表達(dá)量(0.80±0.09)相比，過表達(dá)miR-139-5p組(0.36±0.04)顯著下降(P<0.05)；與anti-miR-con組SLC39A7表達(dá)量(0.81±0.10)相比，anti-miR-139-5p表達(dá)組(1.10±0.15)顯著上升(P<0.05)。見圖4B。說明miR-139-5p靶向負(fù)向調(diào)控SLC39A7的表達(dá)。

表3 敲減SLC39A7抑制腎癌細(xì)胞786-O細(xì)胞周期和增殖

圖3 Western印跡檢測SLC39A7、 CyclinD1、CyclinE蛋白表達(dá)

1～4:miR-con組，miR-139-5p組，anti-miR-con組，anti-miR-139-5p組圖4 miR-139-5p靶向調(diào)控SLC39A7表達(dá)

表4 雙熒光素酶活性檢測

2.5高表達(dá)SLC39A7可部分逆轉(zhuǎn)miR-139-5p對786-O細(xì)胞周期和增殖的影響 與miR-con組SLC39A7水平(0.82±0.13)相比，過表達(dá)miR-139-5p可抑制786-O細(xì)胞中SLC39A7表達(dá)(0.35±0.05，P<0.05)。與miR-139-5p+pcDNA-con組相比，miR-139-5p+pcDNA-SLC39A7組的SLC39A7、CyclinD1和CyclinE表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.05)，S期細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.05)，見圖5和表5。說明過表達(dá)SLC39A7部分逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-139-5p表達(dá)對786-O細(xì)胞周期和增殖的影響。

1～4:miR-con組，miR-139-5p組，miR-139-5p+pcDNA-con組，miR-139-5p+pcDNA-SLC39A7組圖5 Western印跡檢測SLC39A7、 CyclinD1和CyclinE蛋白

2.6Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 與miR-con組786-O細(xì)胞中β-catenin表達(dá)水平(1.00±0.12)相比，過表達(dá)miR-139-5p組(0.45±0.05)顯著降低(P<0.05)；與miR-139-5p+pcDNA-con組786-O細(xì)胞中β-catenin表達(dá)水平(0.40±0.07)相比，miR-139-5p+pcDNA-SLC39A7組(0.86±0.09)顯著升高(P<0.05)，見圖6。說明過表達(dá)miR-139-5p可抑制Wnt/β-catenin信號通路，而過表達(dá)SLC39A7可激活Wnt/β-catenin信號通路并部分逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-139-5p表達(dá)對786-O細(xì)胞周期和增殖的影響。

表5 高表達(dá)SLC39A7可部分逆轉(zhuǎn)miR-139-5p對786-O細(xì)胞周期和增殖的影響

1～4：miR-con組，miR-139-5p組，miR-139-5p+pcDNA-con組，miR-139-5p+pcDNA-SLC39A7組圖6 Western印跡檢測β-catenin蛋白

3 討 論

RC是一種多基因突變的復(fù)雜疾病，盡管酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)是晚期RC的主要一線治療選擇，但最終所有患者都將對TKIs產(chǎn)生耐藥性〔8〕。發(fā)現(xiàn)新的抑制靶點(diǎn)，對RC的個(gè)性化靶向治療至關(guān)重要。miR-139-5p在多種癌癥包括乳腺癌、胃癌、子宮內(nèi)膜漿膜腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)、甲狀腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等中均出現(xiàn)差異表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著重要作用，提示它可能作為一種腫瘤診斷、預(yù)后和治療的生物標(biāo)志物〔9〕。在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)中，miR-139-5p表達(dá)下調(diào)〔10〕。miR-139-5p在肝癌細(xì)胞中也表達(dá)下調(diào)，抑制其表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖〔11〕。miR-139-5p在轉(zhuǎn)移性RC中表達(dá)下調(diào)，與miR-10b、miR-130b、和miR-199b-5p一起可作為RC標(biāo)志物〔12〕。本研究結(jié)果表明，miR-139-5p在RC發(fā)展中具有重要作用。SLC39A7又稱ZIP7，是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)載體39家族第7成員，在細(xì)胞生物過程中控制鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)，SLC39A7定位在鋅介導(dǎo)的酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)上，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鋅，可能是酪氨酸激酶激活所必需的〔13〕，SLC39A7可能通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-AKT等途徑發(fā)揮作用，這些途徑參與細(xì)胞存活和增殖，并且在癌癥中經(jīng)常被過度激活〔14〕。研究表明，SLC39家族中的14個(gè)基因包括SLC39A7在胃癌組織中均顯著上調(diào)，SLC39A7與患者總生存率顯著相關(guān)〔15〕。SLC39A7在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，主要是為了滿足癌細(xì)胞對鋅的需求〔16〕。SLC39A7在前列腺癌中也表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其Wnt/β-Catenin信號通路抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔5〕。SLC39A7在RC中的表達(dá)尚不清楚。本研究結(jié)果說明SLC39A7在RC細(xì)胞的增殖中具有重要作用。Wnt/β-catenin信號通路是一種進(jìn)化上保守的發(fā)育信號事件，在調(diào)節(jié)組織發(fā)育和維持體內(nèi)平衡中起著關(guān)鍵作用，Wnt/β-catenin通路失調(diào)與癌癥、腎臟疾病、神經(jīng)退行性疾病和骨疾病等多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)〔17〕。在人RC中，不同Wnt、Wnt受體(Fzds)和Wnt拮抗劑和β-catenin出現(xiàn)異常表達(dá)，Wnt受體Fzd5和Fzd8的mRNA水平升高，導(dǎo)致下游靶基因CyclinD1增加，胞質(zhì)β-catenin高水平與患者具有腫瘤直徑大、晚期和血管侵犯等特點(diǎn)相關(guān)〔18〕。綜上，本研究闡述了在RC 786-O細(xì)胞中，miR-139-5p靶向SLC39A7可能通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控RC細(xì)胞周期和增殖。miR-139-5p可能是RC的潛在分子靶點(diǎn)。