史禎琦，房 凱，周佳華，張文娟，佘冬立

（1.河海大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210098；2.江蘇省宿遷市節(jié)約用水管理服務(wù)中心，江蘇 宿遷 223800；3.江蘇省水文水資源勘測局連云港分局，江蘇連云港 222004）

0 引 言

反硝化作用是活化氮循環(huán)的最后一步，其基本過程是：NO3-→NO2-→NO →N2O →N2［1］。微生物主導(dǎo)的反硝化作用能夠?qū)⑸鷳B(tài)系統(tǒng)固定的氮和人為活性氮以N2的形態(tài)返回到大氣氮庫中，因而反硝化過程是濕地生態(tài)系統(tǒng)氮素消納的主要途徑之一。反硝化過程影響因素眾多，目前關(guān)于溫度、pH、Eh、有機(jī)碳與活化氮有效性等環(huán)境因素的影響已開展較為豐富的研究［2，3］，而對于水土界面生物變化影響下反硝化規(guī)律及其機(jī)制研究還有待深入。淹水土壤生態(tài)系統(tǒng)水土界面普遍生長有一層周叢生物，其系統(tǒng)內(nèi)各種生物和非生物物質(zhì)交織在一起，具有很強(qiáng)的生態(tài)穩(wěn)定性，是反硝化發(fā)生的熱點(diǎn)區(qū)域［4］。周叢生物因素在反硝化過程中扮演雙重角色，一方面在新陳代謝過程中直接主導(dǎo)反硝化過程，另外一方面自身對周邊環(huán)境的作用反過來又影響其活性［5］。因此，分析反硝化過程影響因素時(shí)，不僅要考慮環(huán)境因子，還要綜合考慮水土界面周叢生物因子的影響及其共線性關(guān)系，探究反硝化過程主控因子［6］。

由于模型結(jié)構(gòu)簡單、變量間關(guān)系易于說明等特點(diǎn)，多元線性回歸模型被廣泛運(yùn)用于生態(tài)系統(tǒng)過程影響因子的分析。淹水底泥生態(tài)系統(tǒng)各組成部分相互影響、相互作用，導(dǎo)致量化后的環(huán)境因子之間不可避免的存在共線性，導(dǎo)致多元回歸模型穩(wěn)定性不強(qiáng)。伍德與阿巴諾［7］在1983年提出的偏最小二乘回歸分析方法（Partial Least Square Regression）PLSR 模型兼具主成分分析、典型相關(guān)分析和一般最小二乘多元回歸分析等多種傳統(tǒng)多元統(tǒng)計(jì)方法的特點(diǎn)，可提取出對因變量解釋性最強(qiáng)的自變量，預(yù)測精度較高，結(jié)果更為可靠且整體性較強(qiáng)，能較好的解決環(huán)境因子、生物因子之間的共線性問題。因此，本研究通過培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)測定上覆水-周叢生物-底泥界面反硝化特征，運(yùn)用PLSR 模型分析反硝化消納面源氮潛力的影響因子，提取出主控因子，為面源污染防控提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試土壤與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在河海大學(xué)江寧校區(qū)節(jié)水園區(qū)（N31°86′，E118°60′，海拔144 m）進(jìn)行。供試的底泥pH（H2O）為7.6，砂粒（0.02～2 mm）、粉粒（0.002～0.02 mm）、黏粒（0～0.002 mm）的體積分?jǐn)?shù)分別為31.5%、39.6%、28.9%，有機(jī)質(zhì)含量為5.8 g/kg，總氮含量為9.3 mg/kg，總磷含量為79 mg/kg，總鉀含量為201 g/kg。

為研究淹水底泥反硝化消納面源氮潛力的影響因素，對供試底泥進(jìn)行覆水培養(yǎng)。將供試底泥風(fēng)干研磨過4 mm 篩網(wǎng)，去除石塊和大顆粒土塊，并將其充分?jǐn)嚢?，以獲得均勻的底泥樣品。將底泥樣品均分為56 個(gè)子樣品，以1.3 g/cm3的容重，30 cm的深度，填入直徑20 cm、深度40 cm 的培養(yǎng)盆中，加水覆蓋，水層深度5 cm，整個(gè)試驗(yàn)周期中保持水層深度不變，每一培養(yǎng)盆隨機(jī)添加N 營養(yǎng)液（按照0、50、100、200、400、600、900 和1 300 kg/hm2尿素梯度添加，各N 營養(yǎng)液處理設(shè)置7 次重復(fù)隨機(jī)擺設(shè)）。在溫室中（25 ℃）培養(yǎng)60 d 后，水土界面持續(xù)生長形成一層明顯的周叢生物，其生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且由于水土界面N營養(yǎng)水平的差異，周叢生物膜生物量梯度差異明顯。

1.2 反硝化速率與環(huán)境因子測定

影響反硝化速率的因素主要從上覆水、周叢生物和底泥3部分考慮。試驗(yàn)培養(yǎng)60 d 后，采用無擾動(dòng)沉積物采樣器（有機(jī)樹脂玻璃管，內(nèi)徑8 cm，外徑9 cm，高30 cm）采取各個(gè)處理上覆水5 cm、土層30 cm的土柱，柱底用黑色橡膠塞密封。將柱樣帶回實(shí)驗(yàn)室后，沿玻璃棒緩慢加入與上覆水氮素含量一致的硝酸鉀溶液直至柱體內(nèi)充滿液體，擰好蓋子，調(diào)整直至柱體中沒有任何氣泡。垂直放置于模擬原位淹水環(huán)境的培養(yǎng)裝置中，液面高出柱子約4～5 cm，然后連接進(jìn)水管和出水管。采用膜進(jìn)樣質(zhì)譜法［8］測定柱樣反硝化速率，具體方法示意見圖1。

圖1 膜進(jìn)樣質(zhì)譜法測定反硝化速率示意圖Fig.1 Schematic diagram of measuring of denitrification rates by Membrane Inlet Mass Spectrometry

反硝化測定后，采用便攜式多參數(shù)測試儀（Hach Company，Loveland）測定上覆水中pH、溶解氧（DO）；將水樣過濾后采用流動(dòng)分析儀（Skalar Analytical，Breda，The Netherlands）測定上覆水體氨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮（NO3--N）含量；采用液態(tài)碳氮元素分析儀（Vario Toc）測定可溶性有機(jī)碳（DOC）和總氮（TN（W））。將上覆水緩慢傾倒，收集水土界面周叢生物，測定參數(shù)包括群落結(jié)構(gòu)比例、葉綠素（CHI）含量。利用消毒后的薄刀片將一定面積（3×3 cm 大小，約2 mm 厚）的周叢生物從載體表面剝離，放置于烘箱105 度烘干至恒重即為生物量（BIO）［9］。通過測序分析發(fā)現(xiàn)在前10 種優(yōu)勢物種中，假單胞菌（Pseudomonas）與反硝化速率成顯著相關(guān)關(guān)系，因此將其納入上覆水影響因子中。輕輕刮取0.5 g 周叢生物膜樣品，采用FastDNA?SPIN Kit For Soil（MP Biomedicals，Santa Ana，CA）試劑盒提取土壤微生物總DNA，并采用高通量測序儀Miseq對其進(jìn)行測序，使用16sr DNA進(jìn)行高通量測序分析，測定底泥土壤反硝化細(xì)菌基因豐度（NIRK、NOSZ）、氨氧化古菌（AOA）、氨氧化細(xì)菌（AOB）；取底泥土樣20 g，用2 mol/L KCl 溶液浸提后，采用流動(dòng)分析儀（Skalar Analytical，Breda，The Netherlands）測定氨態(tài)氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3

--N）。將土樣風(fēng)干后研磨，過100 目篩網(wǎng)，使用CNS 元素分析儀（型號Vario MAX）測定全氮［TN（S）］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在構(gòu)建PLSR 模型之前，運(yùn)用SPSS statistics 25.0 進(jìn)行Zscore 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、皮爾遜相關(guān)性分析，滿足模型的建立要求。在偏最小二乘回歸運(yùn)算過程中，將交叉驗(yàn)證作為確定PLSR 組分的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行如下計(jì)算。

式中：Q2為每一成分可解釋的因變量方差比；Q2cum為偏最小二乘回歸中所有成分可解釋的因變量方差比；PRESS為預(yù)測誤差平方和；SS為剩余平方和；a為偏最小二乘回歸成分?jǐn)?shù)量。

運(yùn)用均方根誤差（Root Mean of Squared Error，RMSE）來對模型進(jìn)行校正。PLSR 模型的建立和計(jì)算均在SIMCA 14.1 軟件中進(jìn)行，將整理好的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 中，設(shè)定反硝化速率為因變量，環(huán)境影響因子為自變量。應(yīng)用Autofit 對模型進(jìn)行自動(dòng)擬合，擬合過程中軟件會自動(dòng)進(jìn)行交叉驗(yàn)證，使最佳解釋能力（R2）與模型預(yù)測能力（Q2）相平衡。偏最小二乘回歸建模過程中使用變量投影重要性指標(biāo)（VIP）表示自變量對因變量預(yù)測的重要程度。回歸系數(shù)（RCs）是反映偏最小二乘回歸模型中自變量對因變量影響的方向和程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 反硝化速率與環(huán)境因子變異特征

淹水底泥添加N 營養(yǎng)液且經(jīng)過60 d 培養(yǎng)后，水土界面環(huán)境與生物因子均發(fā)生了顯著變化（p＜0.05）（表1）。上覆水和底泥中氮含量（NO3--N、NH4+-N 和總氮TN）隨添加N 營養(yǎng)液梯度呈顯著遞增趨勢（p＜0.05），且各氮含量因子均呈中等變異強(qiáng)度。在N 營養(yǎng)激化作用下，底泥中參與氮素循環(huán)過程的微生物群落同樣發(fā)生顯著變化，底泥反硝化細(xì)菌（NIRK 亞硝酸鹽還原酶基因和NOSZ 氧化亞氮還原酶基因）變化范圍分別為0.53～47.63×105copies/ug 和2.58～389.33×105copies/μg，氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）變化范圍分別為0.03～1.05×105copies/μg和0.47～10.48×105copies/μg。與此同時(shí)，淹水底泥在經(jīng)過60 d培養(yǎng)后，水土界面生長有一層穩(wěn)定的生物聚集體，即周叢生物，其系統(tǒng)內(nèi)各種生物，如微生物（包括細(xì)菌和真菌）和小型動(dòng)植物等生物群與非生物物質(zhì)（如鐵錳氧化物等）交織形成自然的一層生物膜。通過對周叢生物生物量（BIO）、假單胞菌（PSE）和葉綠素（CHI）含量的分析表明，周叢生物的生長受水土界面氮營養(yǎng)狀況影響顯著，隨初始添加氮營養(yǎng)濃度增大，周叢生物各指標(biāo)均顯著增大。

表1 反硝化速率和環(huán)境影響因子數(shù)據(jù)特征Tab.1 Statistical summary of denitrification loss and associated factors

淹水底泥氮素營養(yǎng)狀況及周叢生物的變化顯著影響土柱水土界面的反硝化速率（p＜0.05）。反硝化速率的變化范圍為93.1～380.42 μmol/（m2·h），平均值為185.26 μmol/（m2·h），屬于中等變異強(qiáng)度。相關(guān)分析結(jié)果表明，反硝化速率與氮營養(yǎng)梯度和周叢生物各指標(biāo)均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.05）。不同于對傳統(tǒng)“上覆水-沉積物”兩相界面脫氮過程的認(rèn)識，本研究也進(jìn)一步表明，水土界面的周叢生物也是淹水底泥反硝化發(fā)生的熱點(diǎn)區(qū)域。

2.2 反硝化速率變異PLSR模型構(gòu)建

根據(jù)培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建了反硝化速率與水土界面各環(huán)境因子間的PLSR 模型（表2）。模型提取了2 個(gè)偏最小二乘回歸成分，第一成分解釋反硝化速率75.86%變異，第二成分解釋10.97%變異，模型累計(jì)變異性解釋度為86.83%，表明該模型能夠反映反硝化速率變異整體信息，Qcum2＞0.5，模型能較好的對數(shù)據(jù)集進(jìn)行模擬和預(yù)測。PLSR 權(quán)重圖展示了反硝化速率和環(huán)境影響因子之間的關(guān)系，權(quán)重越大的因子與反硝化速率相關(guān)度越高（圖2）。將2 個(gè)主成分權(quán)重綜合分析，得出各因子對反硝化過程的影響作用。上覆水中pH、DOC、NO3--N 和NH4+-N 對反硝化過程起促進(jìn)作用且與反硝化速率相關(guān)度較高，DO 則抑制反硝化過程；周叢生物各指標(biāo)均在第一主成分系統(tǒng)中表現(xiàn)出對反硝化速率的促進(jìn)作用，而底泥中NIRK、NO3--N 和TN（S）在兩個(gè)主成分系統(tǒng)中均表現(xiàn)出對反硝化速率顯著正向貢獻(xiàn)作用。

圖2 反硝化速率PLSR模型第一、第二主成分權(quán)重圖Fig.2 Weight plots of the first and second PLSR components for denitrification rate

表2 反硝化速率變異的PLSR模型Tab.2 PLSR model of Denitrification Loss

2.3 反硝化速率的影響因子分析

在PLSR 模型中，VIP值表示自變量對因變量預(yù)測的重要程度（圖3）。根據(jù)VIP值將各變量分為高影響因子（VIP值＞1）、中影響因子（0.8＜VIP值＜1）和低影響因子（VIP值＜0.8）?！吧细菜?周叢生物-沉積物”三相界面中，各界面影響反硝化速率的主要因素不同。上覆水中，高影響因子主要有酸堿度（pH，VIP=1.531，回歸系數(shù)=0.261）、氨根離子濃度（NH4+-N，VIP=1.378，回歸系數(shù)=0.212）、硝酸根離子濃度（NO3--N，VIP=1.146，回歸系數(shù)=0.135）和溶解性有機(jī)碳（DOC，VIP=1.014，回歸系數(shù)=0.124），上覆水中高影響因子皆對反硝化過程起促進(jìn)作用；周叢生物中影響反硝化速率的高影響因子為葉綠素含量（CHI，VIP=1.219，回歸系數(shù)=-0.014）；底泥沉積物中各環(huán)境因子VIP值均＜1，其中5個(gè)因子屬于中等影響因子，包括底泥氨態(tài)氮（NH4-N，VIP=0.989，回歸系數(shù)=0.026）、全氮［TN（S），VIP=0.951，回歸系數(shù)=0.036］、硝態(tài)氮（NO3-N，VIP=0.949，回歸系數(shù)=0.085）、反硝化細(xì)菌（亞硝酸鹽還原酶基因）（NIRK，VIP=0.91，回歸系數(shù)=0.197）、氨氧化細(xì)菌（AOB，VIP=0.9，回歸系數(shù)=-0.019）和氧化亞古菌（AOA，VIP=0.809，回歸系數(shù)=0.085），底泥中各影響因子對反硝化過程主要為正向影響。

圖3 反硝化速率PLSR模型中各因子VIP及RCs圖Fig.3 Variable importance for the projection and regression coefficient of each predictor of PLSR for denitrification rate

3 討 論

上覆水中，pH、DOC、NO3--N 和NH4+-N 濃度對反硝化過程有正向影響，DO 對反硝化有負(fù)向影響。DO 的平均值為7.99 mg/L（變異系數(shù)24%），屬于富氧環(huán)境，而反硝化細(xì)菌是化能異養(yǎng)兼性菌，當(dāng)水環(huán)境中DO＞6.4 mg/L 時(shí)，會使得分子氧直接供氧［10］，從而導(dǎo)致反硝化速率降低；Cho 等［11］發(fā)現(xiàn)在淹水土壤中，當(dāng)O2消耗完全后，才會產(chǎn)生N2O。Fillery 等［12］發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH 上升時(shí)，N2O 還原酶活性降低，而Aamer 等［13］則認(rèn)為當(dāng)pH＞6.6 時(shí)，對N2O 還原酶的影響會減弱；陳曦等［2］研究認(rèn)為當(dāng)pH 在7.80 左右時(shí)，厭氧氨氧化速率最高；本研究培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)pH 變化幅度較?。ň禐?），進(jìn)一步驗(yàn)證了當(dāng)pH 趨于穩(wěn)定后（大于6.6），對N2O還原酶的抑制減弱促進(jìn)了反硝化作用［14］。絕大多數(shù)反硝化細(xì)菌是化能異養(yǎng)型，Lescure等［15］發(fā)現(xiàn)單糖對反硝化細(xì)菌的刺激更強(qiáng)，DOC 則為反硝化細(xì)菌同時(shí)提供了電子受體及能量來源，而易分解的DOC又刺激了土壤微生物呼吸作用，加速了厭氧環(huán)境的形成。因此，DOC 從提供能量和創(chuàng)造厭氧環(huán)境兩個(gè)方面促進(jìn)反硝化速率［16］。NO3--N和NH4+-N直接參與反硝化過程，NO3--N濃度的提高激發(fā)了微生物活性，加速底泥土壤的反硝化進(jìn)程，驗(yàn)證了佘冬立等［6］研究結(jié)果，同時(shí)二者作為反應(yīng)物和氧源影響著化學(xué)反應(yīng)方向及微生物的呼吸作用［17］。底泥沉積物中，NO3--N 對反硝化過程有較大的正向影響。NO3--N 作為反應(yīng)電子受體及反應(yīng)產(chǎn)物，直接影響土壤反硝化速率；而在pH 值較高的環(huán)境中，NO3--N 含量過高則會抑制N2O 還原酶（此抑制作用可逆）［18］，提高反硝化氣體產(chǎn)物的N2O/N2的比率。底泥NIRK、AOA、AOB 屬于中影響因子，其中NIRK 對反硝化速率具有顯著的正向作用。

相對于單一微生物群落，周從生物具有多種特殊的“集體功能”，如具有多種酶促協(xié)同作用，周叢生物含有多種酶蛋白如堿性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶等［19］，這些酶活性能直接或間接影響反硝化速率。周叢生物中CHI 為影響反硝化速率的主要因子。CHI 是衡量藻類數(shù)量的指標(biāo)，日間藻類的光合作用造成水體富氧以及pH 的升高，夜間藻類自身及其他微生物的呼吸作用又會降低DO，DO 的具體數(shù)值實(shí)際上是生態(tài)系統(tǒng)中藻類光合作用與其他微生物生命活動(dòng)耗氧平衡的結(jié)果。其生長過程中產(chǎn)生的胞外多糖［20］為反硝化細(xì)菌提供了好氧—缺氧界層，在它大量凋亡分解的過程中又需要較多的氧氣甚至?xí)纬扇毖醐h(huán)境［21］，同時(shí)還會提高DOC 和氨氮濃度［22］，促進(jìn)反硝化反應(yīng)。此外，Thind 和Rowell 的研究表明［3］，藻類所吸收的氮素的40%會在體內(nèi)迅速礦化，最后釋放到環(huán)境中刺激作物生長，這意味著藻類保護(hù)了部分氮素阻止其參與反硝化過程。同時(shí)，周叢生物可以通過影響上覆水和底泥環(huán)境因子而導(dǎo)致反硝化速率發(fā)生變化。例如，周叢生物光合作用釋放大量氧氣［4］，提高上覆水和表層沉積物氧化還原電位，從而有利于硝化反應(yīng)；硝態(tài)氮擴(kuò)散到毗鄰的厭氧層，在反硝化細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化成氮?dú)猓?3］，最終損失到大氣中。

4 結(jié) 論

（1）淹水底泥水土界面氮素營養(yǎng)狀況及周叢生物的變化顯著影響沉積物反硝化速率（p＜0.05）。上覆水各因子的影響作用顯著，其中，pH、NH4+-N 、NO3--N 和DOC 對反硝化過程起促進(jìn)作用且與反硝化速率相關(guān)度較高，DO 則抑制反硝化過程；周叢生物各指標(biāo)均在第一主成分系統(tǒng)中表現(xiàn)出對反硝化速率的促進(jìn)作用，而底泥中NIRK、NO3--N 和TN（S）在兩個(gè)主成分系統(tǒng)中均表現(xiàn)出對反硝化速率顯著正向貢獻(xiàn)作用。

（2）“上覆水-周叢生物-沉積物”三相界面中影響反硝化速率的主要因素和程度不同。上覆水整體對反硝化過程的影響程度較大，周叢生物次之，底泥沉積物影響程度相對較小。主成分分析表明各因子之間互相影響，其中周叢生物同時(shí)影響上覆水和底泥土壤，因此在淹水底泥反硝化消納氮素的研究過程中，應(yīng)重視并厘清生物界面的影響機(jī)制及方式。