王喜春，梁遠(yuǎn)鋒，林展翼，3

［1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 510006；2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510080；3.廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所，廣州510080］

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）材料作為一種生物材料來(lái)源于哺乳動(dòng)物的組織，可以用來(lái)修復(fù)或替代各種受損器官和組織，例如心臟、食管、肌腱、真皮等［1-2］。ECM 的獲得是通過(guò)對(duì)天然組織進(jìn)行有效的脫細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)完全去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片等抗原成分，同時(shí)保留ECM 的生化組成、生物活性、三維結(jié)構(gòu)以及ECM 的完整性，從而降低植入體內(nèi)的免疫原性［3］。對(duì)于血管這樣一種對(duì)力學(xué)性能要求比較高的移植支架材料來(lái)說(shuō)，如何選擇合理的評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)洗脫效果尤其重要。既往研究已經(jīng)表明，巨噬細(xì)胞是宿主應(yīng)對(duì)植入材料的第一效應(yīng)細(xì)胞，通常分為促炎型的M1 表型和促重構(gòu)的M2 表型［4］。M1 表型產(chǎn)生大量的促炎信號(hào)和細(xì)胞因子介導(dǎo)慢性炎癥的持續(xù)，損害組織再生和傷口愈合。M2 表型分泌抗炎因子發(fā)揮抗炎癥能力，可以減輕急、慢性炎癥的發(fā)生，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)祖細(xì)胞和干細(xì)胞的增殖分化，協(xié)調(diào)ECM 的再組裝和重構(gòu)［5］。未完全洗脫細(xì)胞的材料將含有殘存DNA，勢(shì)必對(duì)巨噬細(xì)胞的極化產(chǎn)生影響。本研究擬通過(guò)建立巨噬細(xì)胞極化影響的體外實(shí)驗(yàn)研究，評(píng)價(jià)血管ECM 材料內(nèi)DNA 濃度是否超“閾值”，評(píng)判材料植入體內(nèi)的長(zhǎng)期效果。

1 材料和方法

本研究已經(jīng)由南方醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審查號(hào)L2019225），所有程序都遵循其操作規(guī)范及指導(dǎo)原則進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1 脫細(xì)胞血管的制備

獲取成年牛新鮮主動(dòng)脈，保存在含有1%青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH7.4）中。脫細(xì)胞方法參考之前文獻(xiàn)的方法［6］。簡(jiǎn)言之，將牛主動(dòng)脈放入3-［（3-膽酰胺基丙基）二甲氨基］-1-丙磺酸內(nèi)鹽［3-（3-Cholamidopropyl）dimethylammonium-1-propanesulfonate，CHAPS］和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）脫細(xì)胞溶液中進(jìn)行洗滌。最后用含10%胎牛血清的PBS 中漂洗。其中SDS 脫細(xì)胞時(shí)間設(shè)置為36 h 和24 h 兩組，將制備好的脫細(xì)胞血管放入PBS 緩沖液中4 ℃保存。

1.2 蘇木素-伊紅染色及DNA 定量

將脫細(xì)胞前后的血管用4%多聚甲醛固定2 d，石蠟包埋，切成5 μm 切片。切片用蘇木精-伊紅染料染色。同時(shí)進(jìn)行DNA 定量，將脫細(xì)胞前后的牛主動(dòng)脈（n=6）冷凍保存后，凍干稱重，再用木瓜蛋白酶溶液（125 μg/mL 木瓜蛋白酶，5 mmol/L 半胱氨酸及5 mmol/L 乙二胺四乙酸）常溫下消化過(guò)夜。消化后的溶液用TE 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl 及1 mmol/L 乙二胺四乙酸，pH7.5）稀釋，用等體積的QuantiTTM PicoGreen dsDNA 試劑孵育，在485 nm 激發(fā)波長(zhǎng)和530 nm 發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)的熒光值畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，最后計(jì)算樣本濃度。

1.3 溶解性細(xì)胞外基質(zhì)的制備

脫細(xì)胞牛主動(dòng)脈ECM 溶液的制備參考之前的方法［7］。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將脫細(xì)胞ECM 凍干后研磨成粉末狀，然后用10 mg/mL 胃蛋白酶將粉末消化成溶液狀態(tài)，消化過(guò)程在37 ℃條件下進(jìn)行。接著將可 溶性 的ECM 用1/10 體積0.1 mol/L 的NaOH 和1/9 體積的10×PBS 中和至pH 為7.4，放在4 ℃條件下備用。

1.4 巨噬細(xì)胞的極化

雄性2～3 個(gè)月齡的SD 大鼠通過(guò)頸椎脫臼實(shí)施安樂(lè)死。在無(wú)菌條件下，切除后肢皮膚，分離出脛骨和股骨。剪開(kāi)骨的一端，并用巨噬細(xì)胞完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔并收集骨髓，該培養(yǎng)基包括DMEM、10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL 的鏈霉素。無(wú)菌PBS洗滌骨髓細(xì)胞，并以106個(gè)/mL 的密度接種在六孔板上。將六孔板置于37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱在中，每48 h換液一次，培養(yǎng)7 d。7 d 后使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基加刺激因素進(jìn)行極化原始巨噬細(xì)胞：（1）20 ng/mL γ 干擾素（γ-IFN）和100 ng/mL的脂多糖（LPS）刺激形成M1型巨噬細(xì)胞；（2）20 ng/mL白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4刺激形成M2型巨噬細(xì)胞；（3）SDS脫細(xì)胞時(shí)間為24 h的血管基質(zhì)材料刺激形成M24hSDS表型；（4）SDS 脫細(xì)胞時(shí)間為36 h 的血管基質(zhì)材料刺激形成M36hSDS表型。在37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

1.5 巨噬細(xì)胞表型及分泌細(xì)胞因子鑒定

刺激24 h 后，細(xì)胞使用TRIzol 試劑分離總RNA。總RNA 使用PrimeScript?RT Master Mix 試劑盒（Taraka）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）定量基因表達(dá)，最終反應(yīng)體積為10 μL，包括TB Green（Taraka）、10 μmol/L 正向和反向引物和4 ng cDNA（引物序列見(jiàn)表1），在qPCR 儀器上運(yùn)行。使用GraphPad Prism8.3 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCT。

表1 基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prizm 8.3 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有的數(shù)據(jù)均以（）表示，以單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同方法脫細(xì)胞后血管表征比較

對(duì)原生動(dòng)脈以及兩種方法脫細(xì)胞的牛主動(dòng)脈進(jìn)行蘇木素-伊紅染色（圖1 A-C）。結(jié)果可見(jiàn)新鮮原生動(dòng)脈結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)大量完整細(xì)胞核。牛主動(dòng)脈24 h SDS 脫細(xì)胞后，蘇木素-伊紅染色未見(jiàn)明顯完整的細(xì)胞核，但可看到較多的殘存細(xì)胞碎片。牛主動(dòng)脈36 h SDS 脫細(xì)胞后可見(jiàn)血管結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)殘留核。Picogreen 法DNA 定量可見(jiàn)24 h SDS 脫細(xì)胞后DNA 濃度為（121.01±4.09）ng/mg，＞50 ng/mg干重（圖1D）。36 h SDS 脫細(xì)胞的牛主動(dòng)脈DNA 濃度為（9.46±0.75）ng/mg，小于＜50 ng/mg干重（圖1D），符合脫細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 不同方法脫細(xì)胞后血管表征光學(xué)顯微鏡下圖像（標(biāo)尺：50 μm；A：原生牛主動(dòng)脈蘇木素-伊紅染色顯微鏡下圖像；B：SDS 脫細(xì)胞為24 h 的牛主動(dòng)脈蘇木素-伊紅染色顯微鏡下圖像；C：SDS 脫細(xì)胞為36 h 的牛主動(dòng)脈蘇木素-伊紅染色顯微鏡下圖像；D：Picogreen 法DNA 定量）

2.2 不同表型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記基因表達(dá)比較

利用qPCR 法對(duì)不同刺激因素所得的巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行分析。M1 表型iNOS 和CD80 的表達(dá)明顯增加，M2 表型CD206 和CD163 的表達(dá)升高。與24 h 脫細(xì)胞表型M24hSDS促炎性巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物iNOS 和CD80 的表達(dá)量相比，SDS 脫細(xì)胞時(shí)間為36 h 的脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料刺激獲得的巨噬細(xì)胞M36hSDS表達(dá)量要明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而對(duì)促重構(gòu)巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記物CD206 和CD163，M36hSDS表型較M24hSDS表型表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)圖2。

圖2 不同表型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記基因表達(dá)比較（A：M1 表型表面標(biāo)記物iNOS 的表達(dá)；B：M1 表型表面標(biāo)記物CD80 的表達(dá)；C：M2 表型表面標(biāo)記物CD206 表達(dá)；D：M2 表型表面標(biāo)記物CD163 表達(dá)）

2.3 不同表型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子基因表達(dá)比較

不同表型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子基因分析比較，見(jiàn)圖3。IL-1B 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在M1 表型表達(dá)增加。M36hSDS表型與M24hSDS表型相比，IL-1β和TNF-α的表達(dá)明顯較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。M36hSDS表型與M24hSDS表型相比，TNF-α 的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。IL-10 在M1 表型表達(dá)較M2 表型增加。M36hSDS表型與M24hSDS表型相比，IL-10 的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。

圖3 不同表型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子基因表達(dá)分析（A：細(xì)胞因子IL-1β 基因表達(dá)；B：細(xì)胞因子TNF-α 表達(dá)；C：細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)）

3 討論

自體血管來(lái)源的局限性以及取血管帶給患者二次創(chuàng)傷等問(wèn)題，使得異種來(lái)源血管或者異種細(xì)胞構(gòu)建的組織工程血管成為必然趨勢(shì)，而美國(guó)Niklason團(tuán)隊(duì)已經(jīng)使用來(lái)源于牛的平滑肌細(xì)胞成功構(gòu)建出組織工程血管并進(jìn)入到Ⅲ期臨床試驗(yàn)［8-9］。但是，由于這些材料中存在完整的異體或異種DNA 物質(zhì)，必須有效去除其抗原表位和細(xì)胞成分，才能降低植入后宿主的不良免疫反應(yīng)。目前脫細(xì)胞的方法各式各樣，如何選擇理想的方法進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南疵摲浅Ｖ匾?，特別是對(duì)于血管組織這種移植之后馬上就要承受一定壓力血液沖刷的材料。

異種脫細(xì)胞基質(zhì)材料制備的多個(gè)過(guò)程，包括脫細(xì)胞的有效性及脫細(xì)胞后的修飾，均會(huì)影響植入體內(nèi)材料-宿主相互作用過(guò)程，進(jìn)一步?jīng)Q定遠(yuǎn)期重構(gòu)反應(yīng)和功能結(jié)果。之前有研究顯示CHAPS 聯(lián)合SDS 的脫細(xì)胞方案中經(jīng)過(guò)24 h SDS 脫細(xì)胞處理，可以去除人臍動(dòng)脈及大鼠主動(dòng)脈細(xì)胞及殘留細(xì)胞碎片，使得DNA 濃度低于50 ng/mg，達(dá)到公認(rèn)的脫細(xì)胞純度［10-11］。但是正如本研究所發(fā)現(xiàn)，24 h SDS脫細(xì)胞后牛主動(dòng)脈仍然有殘留細(xì)胞核及細(xì)胞碎片，并不能達(dá)到像其他動(dòng)脈同樣的脫細(xì)胞純度，將SDS 脫細(xì)胞時(shí)間延長(zhǎng)至36 h 才可使得DNA 濃度低于50 ng/mg。這也說(shuō)明了盡管脫細(xì)胞的原則是簡(jiǎn)單的，但具體操作過(guò)程比較復(fù)雜，必須考慮到種屬來(lái)源、組織來(lái)源等因素［3］。

既往研究一般是選擇免疫熒光的方法測(cè)定組織殘余DNA 濃度，但是如何進(jìn)一步評(píng)價(jià)材料未來(lái)移植進(jìn)入體內(nèi)可能引起的免疫反應(yīng)，一直沒(méi)有很好的方法。近年來(lái)隨著對(duì)巨噬細(xì)胞相關(guān)表型研究的深入，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞存在M1 和M2 兩種不同表型，它可以隨著環(huán)境變化在這兩種表型之間轉(zhuǎn)化，即巨噬細(xì)胞極化現(xiàn)象。M1 型巨噬細(xì)胞與急性炎癥相關(guān)，而M2 型巨噬細(xì)胞與組織再生相關(guān)。之前Badylak［12］團(tuán)隊(duì)所開(kāi)展的研究結(jié)果顯示，充分去細(xì)胞化的小腸黏膜將促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型從M1 向M2的轉(zhuǎn)化有關(guān)。而在靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)，支架內(nèi)細(xì)胞的存在及促炎細(xì)胞因子數(shù)量的增加可以帶來(lái)巨噬細(xì)胞M1 表型的增加，與不良重構(gòu)結(jié)果有關(guān)。植入含有細(xì)胞成分的異種ECM 支架會(huì)導(dǎo)致單核細(xì)胞浸潤(rùn)的經(jīng)典炎癥過(guò)程級(jí)聯(lián)，包括植入后3 d 主要為M1 表型的巨噬細(xì)胞［13］。因此，通過(guò)體外巨噬細(xì)胞極化結(jié)果，將可以提前預(yù)知材料移植后的中遠(yuǎn)期效果。

巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是其發(fā)揮生物功能的關(guān)鍵成分。本研究結(jié)果顯示異種血管組織經(jīng)過(guò)36 h 洗脫后，誘導(dǎo)的M36hSDS表型對(duì)促炎型細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α 的表達(dá)量要明顯減少。IL-10 是抗炎型細(xì)胞因子，既往認(rèn)為在人和小鼠體內(nèi)是由M2型巨噬細(xì)胞分泌，而本研究中在M1 型巨噬細(xì)胞及M24hSDS表型表達(dá)增加，與之前大鼠巨噬細(xì)胞極化的研究結(jié)果一致［14］。

本研究的結(jié)果表明，生物支架材料的脫細(xì)胞化效果是巨噬細(xì)胞表型反應(yīng)的一個(gè)重要因素。除了測(cè)定殘存DNA 之外，體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的方法是對(duì)異種或異體組織脫細(xì)胞處理效果的客觀評(píng)價(jià)手段之一。