焦紅麗，王珺嬈，胡敏萱，黃 元，丁彥青，冶亞平

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，病死率較高是導(dǎo)致患者死亡的主要癌癥之一[1]。近年來，全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡逐漸年輕化[2-3]。支架附著因子B(scaffold attachment factor-B, SAFB)屬于核蛋白家族成員，其通過直接或者間接與基因啟動(dòng)子相結(jié)合，抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也是穩(wěn)定基因組3D結(jié)構(gòu)的重要因素[4]，在人體組織中廣泛表達(dá)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAFB與結(jié)直腸癌的演進(jìn)密切相關(guān)[5]，SAFB低表達(dá)可通過SAFB-TAK1-NF-κB信號軸發(fā)揮抑制結(jié)直腸癌演進(jìn)的功能，但SAFB是否在結(jié)直腸癌的發(fā)生，尤其是增殖過程中發(fā)揮作用，以及發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制尚不完全清楚。本課題組利用多種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫分析，著重探討SAFB對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，并探討可能的分子機(jī)制，以深化對結(jié)直腸癌發(fā)生與演進(jìn)機(jī)制的系統(tǒng)化研究，并為臨床結(jié)直腸癌的診斷與治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院存檔的結(jié)直腸癌石蠟標(biāo)本175例和手術(shù)切除的新鮮配對結(jié)直腸癌樣本50對，配對樣本包括腫瘤組織和癌旁正常黏膜組織。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌，所有患者均未接受放、化療。

1.2 細(xì)胞及試劑人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116、SW620、SW480和HCT15,均購自美國ATCC模式生物庫；慢病毒包裝質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P公司；逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pSUPER-retro-puro、慢病毒表達(dá)載體psin-EF2-puro及雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒為課題組自存。SAFB抗體購自美國Abcam公司；通用型SP試劑盒(SP-9000)、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物公司；RT-PCR主要試劑：Trizol購自Invitrogen公司，SYBR GREEN MIX購自日本TOYOBO公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TAKARA公司；0.25%胰酶、胎牛血清、DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、無酚紅DMEM培養(yǎng)基，均購自美國Gibco公司。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞長至60%左右匯合度時(shí)洗去含血清的培養(yǎng)基，加入預(yù)先配好的轉(zhuǎn)染液，37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)試劑盒說明書檢測熒光素酶活性，分析信號通路活性情況。

1.4 穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建磷酸鈣法制備慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，建立SAFB過表達(dá)、干擾穩(wěn)定細(xì)胞株，將含有重組質(zhì)粒SAFB/psin-EF2-puro、SAFB shRNA1、SAFB shRNA2及陰性對照質(zhì)粒psin-EF2-puro、pSUPER-retro-puro、慢病毒包裝質(zhì)粒及逆轉(zhuǎn)錄包裝質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染液加入產(chǎn)病毒細(xì)胞293FT中轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染結(jié)束24～48 h后，用含1 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)染成功陽性細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，并收集以上細(xì)胞株的RNA和蛋白，采用RT-PCR和Western blot法進(jìn)行鑒定。

1.5 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗3遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×107個(gè)；1 mL注射器吸取細(xì)胞液用于裸鼠皮下注射接種，每只裸鼠注射200 μL細(xì)胞液(每只約2×106個(gè)細(xì)胞)，每組6只；隔天用游標(biāo)卡尺測量1次腫瘤體積，腫瘤體積計(jì)算公式為體積=長度×寬度×高度/2；處死裸鼠并分離腫瘤組織后，置于10%中性福爾馬林中固定，24 h后進(jìn)行蠟塊制作，切片，行HE及免疫組化染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)學(xué)分析，采用One-way ANOVA檢驗(yàn)分析MTT、平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)時(shí)需要進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，采用Fisher方差分析進(jìn)行整體比較，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，采用Dunnett法進(jìn)行多個(gè)處理組和一個(gè)對照組的比較；若方差不齊，則采用近似F檢驗(yàn)Welch法分析進(jìn)行整體比較，采用DunnettT3檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB的表達(dá)Oncomine(http://www.oncomine.com)及TCGA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)檢測結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中SAFB的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常黏膜組織，且其表達(dá)量隨著臨床分期的增加呈下降趨勢(P<0.01，圖1A)?；蚋患治?gene set enrichment analysis, GSEA)結(jié)果顯示，在SAFB低表達(dá)組中出現(xiàn)結(jié)腸癌相關(guān)基因的顯著富集(P<0.001，圖1B)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中SAFB mRNA表達(dá)水平均低于癌旁正常黏膜組織(圖1C)。

圖1 SAFB在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)水平：A.TCGA數(shù)據(jù)庫中SAFB表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床分期的關(guān)系；B.GSEA分析SAFB表達(dá)下調(diào)后結(jié)直腸癌相關(guān)基因富集情況；C.RT-PCR定量分析結(jié)直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB mRNA的表達(dá)

2.2 不同分期結(jié)直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB的表達(dá)免疫組化檢測結(jié)果顯示，SAFB表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，呈棕紅色或黃褐色。SAFB蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常黏膜組織，并且隨著Dukes分期的升高，SAFB的表達(dá)水平明顯下降(表1，圖2)。

圖2 不同分期結(jié)直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB的表達(dá)，SP法

表1 SAFB表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 體內(nèi)、體外過表達(dá)SAFB對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)表明，SAFB過表達(dá)可抑制HCT116和SW620細(xì)胞的增殖能力(圖3)。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAFB過表達(dá)明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長速度(P<0.01，圖4A、B)；免疫組化結(jié)果顯示，SAFB過表達(dá)組腫瘤細(xì)胞的Ki-67增殖指數(shù)明顯低于對照組(圖4C)。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，SAFB過表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡(圖5)。以上體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，SAFB通過促進(jìn)細(xì)胞的凋亡抑制腫瘤的生長和增殖。

圖3 過表達(dá)SAFB對體外結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響：A.MTT實(shí)驗(yàn)；B.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

圖4 過表達(dá)SAFB對體內(nèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響：A.裸鼠皮下瘤；B.皮下瘤增殖速度；C.皮下瘤HE染色與Ki-67增殖指數(shù)

圖5 過表達(dá)SAFB對細(xì)胞凋亡的影響

2.4 體內(nèi)外干擾SAFB表達(dá)對結(jié)直腸細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆及裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)均顯示，干擾內(nèi)源性SAFB表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖能力(圖6、7)。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，SAFB過表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡(圖8)。以上體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，SAFB低表達(dá)通過抑制細(xì)胞的凋亡促進(jìn)腫瘤的生長和增殖。

圖6 干擾SAFB表達(dá)對體外結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響：A.MTT實(shí)驗(yàn)；B.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

圖7 干擾SAFB表達(dá)對體內(nèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響：A.裸鼠皮下成瘤大體圖；B.皮下瘤增殖速度；C.皮下瘤HE染色與Ki-67增殖指數(shù)

圖8 干擾SAFB表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響

2.5 公共數(shù)據(jù)庫分析SAFB相關(guān)信號通路GSEA分析結(jié)果顯示，在SAFB低表達(dá)組中均出現(xiàn)Wnt信號通路相關(guān)基因的顯著富集(圖9)。

圖9 GSEA分析SAFB表達(dá)下調(diào)后相關(guān)基因富集情況

2.6 SAFB下調(diào)對Wnt信號通路的影響雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，干擾SAFB表達(dá)后Wnt熒光素酶活性升高(P<0.001，圖10A)。Western blot結(jié)果顯示，干擾SAFB表達(dá)后，Wnt信號通路下游關(guān)鍵基因Cyclin D1、non-p-β-catenin和LEF1表達(dá)明顯上調(diào)，而p21、p27表達(dá)明顯下調(diào)。相反，過表達(dá)SAFB后Cyclin D1、non-p-β-catenin和LEF1表達(dá)明顯下調(diào)，p21、p27表達(dá)明顯上調(diào)(圖10B)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，干擾SW480細(xì)胞中SAFB表達(dá)后，β-catenin入核明顯增加(圖10C)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，SAFB下調(diào)后可激活Wnt信號通路。

圖10 SAFB表達(dá)下調(diào)對Wnt信號通路的影響：A.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)；B.Western blot法分析Wnt信號通路下游相關(guān)基因表達(dá)；C.免疫熒光顯示β-catenin入核情況

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生與演進(jìn)是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，其常常伴有癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡調(diào)節(jié)基因和DNA修復(fù)基因的改變等。SAFB是一種在人體組織中廣泛表達(dá)的核蛋白家族成員，作為一種核基質(zhì)結(jié)合因子，通過N端DNA結(jié)合域(SAP/SAF-BOX)和C-端的轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)直接或者間接與基因啟動(dòng)子相結(jié)合，抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[4]。目前已知SAFB相關(guān)的生物學(xué)功能主要有：Xist調(diào)控的X染色體失活(Xist是X染色體失活的重要lncRNA)、細(xì)胞凋亡、DNA損傷反應(yīng)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞增殖、RNA轉(zhuǎn)錄和加工[4,6-7]等。有研究表明，SAFB的基因改變與乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)及預(yù)后密切相關(guān)。SAFB通過抑制雌激素受體α(estrogen receptor alpha, ERα)和雄激素受體(androgen receptor, AR)的表達(dá)和活性，對乳腺癌和前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展起重要的抑制作用[8-9]。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAFB可以通過直接靶向TAK1抑制NF-κB信號通路的活性，從而抑制結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，SAFB高表達(dá)后不僅抑制腫瘤的侵襲能力，同時(shí)也顯著抑制腫瘤的生長[5]。SAFB抑制腫瘤生長的具體機(jī)制、是否與NF-κB信號通路相關(guān)及是否有其他相關(guān)的分子機(jī)制參與的問題，需要我們開展后續(xù)的研究深入探究。

通過公共數(shù)據(jù)庫預(yù)測并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量檢測，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SAFB在結(jié)直腸癌中的表達(dá)顯著低于正常黏膜組織，且表達(dá)水平與腫瘤分期和分化等臨床病理特征密切相關(guān)，說明其很可能是結(jié)直腸癌發(fā)生與演進(jìn)的重要預(yù)后標(biāo)志物。此外，大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SAFB可以明顯抑制腫瘤的增殖能力，促進(jìn)其凋亡，但具體機(jī)制仍需深入探究。

Wnt/β-catenin信號能夠控制發(fā)育、維持干性以及通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化決定影響成體組織的穩(wěn)態(tài)平衡，該信號通路發(fā)生失調(diào)與多種腫瘤密切相關(guān)[10-11]。90%以上的結(jié)直腸癌患者攜帶Wnt信號途徑的體細(xì)胞突變，如APC腫瘤抑制基因失活等[12]，導(dǎo)致Wnt信號通路的持續(xù)性激活。本課題組通過前期生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Wnt信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)等證實(shí)SAFB下調(diào)激活Wnt信號通路。免疫熒光檢測結(jié)果顯示SAFB下調(diào)可以促進(jìn)β-catenin入核，表明SAFB低表達(dá)可以通過增強(qiáng)Wnt通路活性影響結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。結(jié)合本組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者認(rèn)為在結(jié)直腸癌中SAFB低表達(dá)可以顯著影響NF-κB及Wnt等重要腫瘤相關(guān)信號通路的活性，NF-κB及Wnt信號通路也可能通過“交叉對話”的方式共同影響腫瘤發(fā)生與演進(jìn)。同時(shí)，鑒于SAFB的重要功能，我們可以嘗試通過改變細(xì)胞內(nèi)SAFB表達(dá)水平或結(jié)合相應(yīng)受體來調(diào)控相關(guān)信號通路，最終達(dá)到腫瘤控制與治療的目的。

長期以來，抑制RAS的膜結(jié)合被認(rèn)為是一種合理的抗癌治療方法，因此可以通過應(yīng)用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑進(jìn)行抗癌治療。最近有研究表明，SAFB通過控制FNTA(由兩種異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶共享的亞基)表達(dá)促進(jìn)RAS膜結(jié)合。沉默SAFB來降低FNTA的水平，從而使KRAS和NRAS突變細(xì)胞對FTI抑制劑更敏感[13]，這為我們的研究工作提供了新的思路，當(dāng)結(jié)直腸癌中SAFB表達(dá)降低時(shí)，應(yīng)用FTI進(jìn)行抗癌治療有望顯著提高治療效果。最近，一項(xiàng)關(guān)于黑色素瘤的相關(guān)研究表明，腫瘤細(xì)胞通過分泌大量的β-catenin阻止T細(xì)胞浸潤到腫瘤微環(huán)境中，從而減弱臨床免疫治療的效果[14]。在結(jié)直腸癌的聯(lián)合免疫治療中，我們可以嘗試通過調(diào)節(jié)SAFB的表達(dá)來改善晚期結(jié)直腸癌患者的腫瘤免疫微環(huán)境，以期提高聯(lián)合免疫治療的效果。

綜上所述，SAFB在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，SAFB可能通過影響Wnt及NF-κB信號通路活性來影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖與侵襲能力，這使得SAFB成為結(jié)直腸癌治療研究中的新目標(biāo)。深入認(rèn)識SAFB在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，充分了解其作用機(jī)制，可以為結(jié)直腸癌早期診斷及治療提供新思路。