李 柱， 吳 烜， 彭小丹， 王樹濱

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東省深圳市518000)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最為常見的肺癌種類，雖然其發(fā)病率近年來呈現(xiàn)明顯改善趨勢，但由于缺乏有效的早期鑒別和治療指標(biāo)，導(dǎo)致NSCLC患者5年生存率仍較低[1]。因此，積極尋找有效治療NSCLC的臨床靶標(biāo)具有十分重要的意義。真核生物miRNA屬于內(nèi)源性小非編碼RNA，miRNA表達(dá)異常在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、發(fā)育、凋亡和侵襲等過程中扮演著十分重要的角色[2]，在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中也起到十分重要的作用[3]。近年有研究指出，肝癌、乳腺癌、胃癌、腎癌、喉癌、前列腺癌等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展均與miR-145異常表達(dá)關(guān)系密切[4]，但miR-145在NSCLC中的作用及機(jī)制仍有待研究。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是C羧基端激酶類家族成員，參與細(xì)胞DNA修復(fù)、端粒長度、周期檢查點調(diào)整和細(xì)胞死亡等多種過程，逐漸成為了近年來臨床研究的熱點[5-6]。因此，本研究擬分析miR-145調(diào)控NSCLC A549細(xì)胞生物學(xué)特性及對mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

NSCLC A549細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫。miR-145模擬物、陰性模擬物引物均由上海生工生物工程有限公司提供;miR-145抗體、miRNA陰性對照抗體均由Ambion公司提供。A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%時傳代培養(yǎng)或進(jìn)行干預(yù)。細(xì)胞生長至對數(shù)期時，A549細(xì)胞用胰蛋白酶消化，分為miR-145組、對照組、miR-145抗體組和對照抗體組。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種3.5×105個A549細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)基加入無血清培養(yǎng)基后，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，完成轉(zhuǎn)染后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 qRT-PCR檢測miR-145表達(dá)

抽提各組細(xì)胞總核酸，嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測細(xì)胞中miR-145表達(dá)情況。所用引物及試劑盒均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。miR-145上游引物：5′-CGCGCTCGAGCCCAGAGCAATAAGCCACAT-3′，下游引物：5′-GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG TTGAG-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3 MTT檢測細(xì)胞增殖活性

將細(xì)胞按照5×103個/孔接種于96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后加入20 μL MTT試劑，培養(yǎng)4 h后，采用多功能酶標(biāo)儀檢測光密度(OD490 nm)，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

PBS緩沖液清洗后，調(diào)整細(xì)胞至1×106個/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒處理細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞處理嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 細(xì)胞遷移實驗

取細(xì)胞接種于6孔板中，37 ℃孵育至板底被鋪滿，使用100 μL槍頭劃一條線，保持劃痕寬度一致，拍照并做標(biāo)記，37 ℃孵育24 h。6孔板經(jīng)PBS清洗后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，計算遷移至劃痕區(qū)域中的細(xì)胞數(shù)量。

1.6 細(xì)胞侵襲實驗

使用matrigel膠包被Transwell小室后，調(diào)整細(xì)胞至5×104個/mL，取0.5 mL細(xì)胞懸液加入Transwell小室內(nèi)，培養(yǎng)24 h。取出小室，將上室細(xì)胞擦凈并用PBS洗滌，預(yù)冷甲醇固定下室細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下取6個視野計算下室的細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blotting檢測蛋白表達(dá)

取各組細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA定量試劑盒檢測蛋白水平。采用SDS-PAGE分離蛋白，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。BSA封閉1 h后，分別使用mTOR、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR,p-mTOR)、真核細(xì)胞翻譯起始因子-4E(eukaryotic initiation factor-4E,eIF4E)、磷酸化eIF4E(phosphorylated eIF4E,p-eIF4E)、核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,p70S6K)、磷酸化p70S6K(phosphorylated p70S6K,p-p70S6K)、S6核糖體蛋白(ribosomal protein S6,S6)、磷酸化S6(phosphorylated S6,p-S6)、eIF4E結(jié)合蛋白1(eIF4E-binding protein，4E-BP)、磷酸化4E-BP(phosphorylated 4E-BP,p-4E-BP)、一抗抗體孵育，4 ℃過夜。TBST洗滌3次后，二抗室溫孵育1 h，TBST再次洗滌后，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒檢測各組蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組miR-145表達(dá)水平的比較

對照組和對照抗體組細(xì)胞miR-145表達(dá)水平差異無顯著性(P>0.05)，miR-145組和miR-145抗體組與其比較，細(xì)胞miR-145表達(dá)水平存在明顯差異，其中miR-145組最高，miR-145抗體組最低(P<0.05；圖1)。

圖1 各組miR-145表達(dá)水平的比較。

2.2 各組細(xì)胞增殖活性的比較

對照組和對照抗體組細(xì)胞增殖活性差異無顯著性(P>0.05)，miR-145組和miR-145抗體組與其比較，細(xì)胞增殖活性存在明顯差異，其中miR-145組最低，miR-145抗體組最高(P<0.05；表1)。

表1 各組細(xì)胞增殖活性、凋亡率、遷移活性、侵襲活性的比較(n=5)

2.3 各組細(xì)胞凋亡率的比較

對照組和對照抗體組細(xì)胞凋亡水平差異無顯著性(P>0.05)，miR-145組和miR-145抗體組與其比較，細(xì)胞凋亡水平存在明顯差異，其中miR-145組最高，miR-145抗體組最低(P<0.05；表1和圖2)。

圖2 各組細(xì)胞凋亡率的比較(流式細(xì)胞術(shù))

2.4 各組細(xì)胞遷移活性的比較

對照組和對照抗體組細(xì)胞遷移活性差異無顯著性(P>0.05)，miR-145組和miR-145抗體組與其比較，細(xì)胞遷移活性存在明顯差異，其中miR-145組最低，miR-145抗體組最高(P<0.05；表1和圖3)。

圖3 各組細(xì)胞遷移結(jié)果的比較

2.5 各組細(xì)胞侵襲活性的比較

對照組和對照抗體組細(xì)胞侵襲差異無顯著性(P>0.05)，miR-145組和miR-145抗體組與其比較，細(xì)胞侵襲存在明顯差異，其中miR-145組最低，miR-145抗體組最高(P<0.05；表1和圖4)。

圖4 各組細(xì)胞侵襲活性的比較(結(jié)晶紫染色，200×)

2.6 各組細(xì)胞mTOR信號通路蛋白表達(dá)的比較

對照組和對照抗體組細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-eIF4E/eIF4E、p-p70S6K/p70S6K、p-S6/S6、p-4E-BP/4E-BP表達(dá)水平差異無顯著性(P>0.05)，miR-145組和miR-145抗體組與其比較，細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-eIF4E/eIF4E、p-p70S6K/p70S6K、p-S6/S6、p-4E-BP/4E-BP表達(dá)水平存在明顯差異，其中miR-145組各指標(biāo)表達(dá)水平最低，miR-145抗體組最高(P<0.05；圖5)。

圖5 Western blotting檢測各組細(xì)胞mTOR信號通路蛋白的表達(dá)

3 討 論

miRNA是人體內(nèi)重要的生物活性分子，可靶向mRNA的3′-UTR區(qū)，起到抑制mRNA翻譯或降解mRNA的作用，可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移。有報道指出，miRNA的表達(dá)異常在腫瘤發(fā)生的各階段均可檢測到，并扮演一定的癌基因和抑癌基因的作用[7]。有學(xué)者指出，肝外膽管癌中miR-143處于低表達(dá)狀態(tài)，miR-143表達(dá)水平升高可顯著抑制膽管癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。膽管癌細(xì)胞中miR-26a表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞大量增殖[9]。miRNA具有十分重要的生物學(xué)功能，但其作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究和分析。miR-145在基因組中位于5號染色體，常被認(rèn)為屬于抑癌基因。有研究指出，miR-145可作用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1、人表皮生長因子受體2、表皮生長因子受體等基因，對細(xì)胞多種生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控[10]。此外，miR-145在胃癌、前列腺癌、宮頸癌等腫瘤組織中均處于低表達(dá)狀態(tài)，miR-145表達(dá)增加會抑制腫瘤擴(kuò)散，具有一定的抑制腫瘤作用[11]。本研究選擇miR-145，分析其在肺癌細(xì)胞A549中的生物學(xué)特征及其作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，A549細(xì)胞高表達(dá)miR-145后，細(xì)胞增殖活性、遷移能力及侵襲能力均顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，說明miR-145表達(dá)增加后可顯著降低A549細(xì)胞的增殖活性、遷移能力及侵襲能力，并有效升高細(xì)胞凋亡率。

mTOR是調(diào)控和聯(lián)系細(xì)胞代謝上下游的關(guān)鍵分子，可通過脂肪合成、蛋白翻譯等系統(tǒng)抑制細(xì)胞自噬，發(fā)揮生物學(xué)活性。有研究指出，非磷酸化4E-BP1結(jié)合在eIF4E上可有效抑制其生物學(xué)活性，而mTOR可調(diào)控蛋白翻譯促進(jìn)S6K1和4E-BP1磷酸化，當(dāng)4E-BP1磷酸化后，會與eIF4E解離，使eIF4E招募翻譯起始因子復(fù)合體[12]。當(dāng)mTOR促進(jìn)S6K1磷酸化后，會促進(jìn)其底物翻譯，此外S6K1可增強(qiáng)RnAPI轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)核糖體生物合成，mTOR可通過SREBP1間接上調(diào)脂肪酸合成酶表達(dá)水平和活性，調(diào)控脂肪酸代謝進(jìn)程，因而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中mTOR信號通路扮演著十分重要角色[13]。本研究進(jìn)一步分析miR-145潛在的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，miR-145高表達(dá)會顯著抑制mTOR、eIF4E、p70S6K、S6、4E-BP蛋白磷酸化。本研究結(jié)果提示，miR-145通過mTOR信號通路實現(xiàn)對A549細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)控。

綜上所述，miR-145可通過mTOR途徑調(diào)控NSCLC A549細(xì)胞生物學(xué)特性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖活性、遷移能力及侵襲能力。但本研究并未就miR-145的基因作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深入探討，有待后續(xù)研究分析。