白東虎，賈宇榮，白春梅，武麗梅，楊芊鈺

(榆林市藥品檢驗所，陜西 榆林 719000)

質量控制一直是中藥應用時需要考慮的核心問題。近年來，中藥質量控制已從化學成分定性定量分析發(fā)展到整體評價階段。不同產地、不同來源等差異和變化都會導致不同批次的藥材在藥用成分上存在顯著的差異，單一檢測手段建立的指紋圖譜也越發(fā)不能滿足中藥質量評價的要求。因此，建立合理、準確、信息豐富的中藥指紋圖譜用以中藥質量控制就顯得尤為重要。近年來，基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用(UPLC-Q-TOF-MS)技術建立的中藥指紋圖譜以靈敏度高、穩(wěn)定性好的特質成為研究人員的又一青睞對象。本文結合文獻，從多方面歸納分析，以期為UPLC-Q-TOF-MS技術在中藥指紋圖譜研究中的應用提供參考。

1 中藥指紋圖譜概述

1.1 中藥指紋圖譜與質量評價的關系

中藥，作為多組分的有機整體，化學成分復雜，若僅以一種或少數幾種指標成分對其質量進行評價，不足以全面體現(xiàn)質量的優(yōu)劣。中藥指紋圖譜法是指，通過對中藥進行提取，采用合適的分析技術或方法對特征化學成分進行表征，進而得到體現(xiàn)中藥整體特征的色譜或光譜圖的分析方法[1]，是一種綜合的、可量化的化學鑒定手段。指紋圖譜所反映的化學成分信息(具體表現(xiàn)為相對保留時間和相對峰面積)具有高度特異性和選擇性，可較充分地反映出中藥復雜混合體系中各種化學成分含量分布的整體狀況。尤其是在現(xiàn)階段有效成分大多數沒有明確的情況下，它能夠結合各種色譜、光譜手段，特征性地鑒定中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，成為中藥自身的“化學條碼”[2]。經過近些年的長足發(fā)展，中藥指紋圖譜研究也已由在方法和技術方面的基礎研究，進入到中藥質量控制和評價的實際應用中[3]。中藥指紋圖譜技術，作為中藥材質量控制的方法，已成為一種國際共識，在中藥檢驗、研究和中藥現(xiàn)代化發(fā)展過程中發(fā)揮著越來越重要的作用。從2010年版開始，歷版《中華人民共和國藥典》的變化也可看出，指紋圖譜的評價指標在不斷完善，它在中藥質量評價中的作用也逐漸增加[4]。

1.2 中藥指紋圖譜分類

中藥指紋圖譜按所用技術可分為化學、生物、代謝指紋圖譜三大類。其中，化學指紋圖譜是依據中藥所含化學成分種類及含量，應用不同的儀器、方法檢測得到的指紋圖譜，它又可分為光譜和色譜指紋圖譜。常用的光譜指紋圖譜有紫外、紅外、熒光、核磁共振、X射線衍射光譜等，由于這些方法能夠給出藥效物質基礎或部分特定化學結構信息，所以它們可以作為輔助手段配合中藥色譜指紋圖譜的研究。得益于現(xiàn)代色譜技術的發(fā)展，色譜指紋圖譜也成為發(fā)展最快速、應用最廣泛的中藥指紋圖譜。常用的色譜指紋圖譜技術有薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、高效毛細管電泳指紋圖譜等[5]。高效液相色譜(HPLC)是指紋圖譜研究中應用最廣泛的方法之一，但是傳統(tǒng)HPLC指紋圖譜操作周期長、工作量大，不能完整地表征藥材內在的化學質量，且多采用UV檢測器，無法體現(xiàn)無紫外吸收的其它類成分。因此，傳統(tǒng)HPLC指紋圖譜技術用于藥材質量的評價，具有一定的片面性。近年來新發(fā)展起來的UPLC-Q-TOF-MS分析技術，集UPLC高效分離能力和Q-TOF-MS/MS高分辨質譜解析能力于一體，能夠快速建立指紋圖譜，并能直觀、綜合地應用于中藥質量評價分析，已逐漸成為中藥活性成分和中藥指紋圖譜研究的最有效的分析手段之一。

2 UPLC-Q-TOF-MS技術特征

2.1 UPLC-Q-TOF-MS技術工作流程

UPLC-Q-TOF-MS技術是將超高效液相色譜(UPLC)作為色譜分離系統(tǒng)，將四級桿(Q)和飛行時間質譜(TOF-MS)作為質量分析器，串聯(lián)而成的一種質譜技術。它的工作流程如圖1所示。

圖1 UPLC-Q-TOF-MS工作流程

樣品經超高效液相色譜系統(tǒng)進樣，色譜柱分離。分離流出的組分依次通過接口進入離子源(常用電噴霧電離ESI和大氣壓化學電離APCI兩種離子源)，經由離子化形成離子，經過四級桿離子光學系統(tǒng)的調節(jié)形成可控離子束進入飛行時間質量分析器。離子束被垂直引入加速區(qū)加速，進入漂移區(qū)，經過二級反射鏡后再返回。在第二級質量分析器進行質譜分離后，分別在檢測器上產生信號，然后經過信號轉換輸出色譜-質譜二維譜圖[6]。最后經過數據處理系統(tǒng)分析所采集的數據信息，根據產生并收集到的離子特征對化合物進行定性和定量分析。

2.2 UPLC技術特點

UPLC是質譜檢測器的最佳液相色譜入口之一。UPLC系統(tǒng)達到最佳線速度時(一般在0.25～0.50 mL/min)，與質譜能承受的流速(API接口 0.20 mL/min)更加匹配，使得離子化效率提高。此外，UPLC是應小粒徑填料(粒徑<2 μm)和超高壓(壓力> 105kPa)要求而專門設計的[7]，保持了傳統(tǒng)HPLC的基本原理(理論依據仍源于范迪姆特(VanDeemter)經驗方程)，但其分離效能和分離速度得到極大提高,可以顯著改善色譜峰的分離度、檢測靈敏度，并縮短分析周期，同時減少了流動相用量從而降低分析成本。

2.3 Q-TOF-MS技術特點

四級桿質量分析器(Q)，由直流和射頻交流電壓疊加的四極電場構成，通過設定參數可使特定質荷比(m/z)的離子穩(wěn)定通過，其它離子則以不穩(wěn)定的運動碰到四級桿上被吸濾掉。四級桿具有優(yōu)良的離子過濾能力，因此又叫四級桿濾質器[8]。

飛行時間質量分析器(TOF-MS)主要由一個離子漂移管構成，工作原理是基于動能相同而質荷比(m/z)不同的離子在恒定電場中經過恒定距離所需時間不同，進行質譜分離。進行二級質譜分析時，第一重四級桿選擇母離子。加速至一定能量后進入只有射頻的四級碰撞室與惰性氣體碰撞而碎裂成子離子。這些子離子再經過加速和聚焦進入飛行時間質量分析器，按照質核比大小進行分離[9]。飛行時間質譜的優(yōu)勢在于掃描范圍寬(50～40000 m/z)，能得到物質準確相對分子質量，并通過精確質量數和同位素峰形進行數據庫檢索比對，可快速地對目標化合物和未知化合物實現(xiàn)精確定性[10]。

總之，UPLC-Q-TOF-MS技術極大的發(fā)揮了兩種高性能分析儀器的優(yōu)點。UPLC的特點是分離效果好、分析速度快，而Q-TOF-MS選擇性強、靈敏度高，且有正負離子兩種模式，可以將無法色譜分離的組分實現(xiàn)質譜分離，還可以精確檢測相對分子質量，其產生的二級質譜能提示特征離子碎片信息[11]，這些信息結合已知結構化合物的裂解等規(guī)律，能對未知成分進行定性、定量分析，這恰好能滿足中藥指紋圖譜研究的需要。

3 UPLC-Q-TOF-MS技術在中藥材指紋圖譜研究和質量評價中的應用

結合近期文獻發(fā)現(xiàn)，UPLC-Q-TOF-MS技術在中藥材指紋圖譜研究和質量評價中的作用主要體現(xiàn)在指紋圖譜中共有峰的指認及鑒定上，包括鑒別已知和未知化學成分。文獻多應用UPLC或HPLC建立中藥材指紋圖譜，并利用相似度評價技術或主成分分析技術(PCA)快速辨別主成分峰和差異峰；然后利用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜采集總離子流色譜圖；接著對色譜圖中的各個色譜峰進行精確質量數識別，并結合保留時間表征中藥材中的化學成分；然后通過對照品比對指認、文獻比對，以及高分辨質譜數據解析等方法，根據精確質量數及同位素推算出分子式，進而結合二級質譜及文獻資料分析鑒定中藥材化學成分；最后給出分析結論以指導中藥材質量控制。

3.1 建立中藥材指紋圖譜并分析化學成分

張玉等[12]建立了合歡花藥材的UPLC特征指紋圖譜，并基于UPLC-Q-TOF-MS技術快速鑒別了合歡花中的主要化學成分，共標示出5個共有峰，各共有峰相對保留時間，RSD均<2%，經過質譜指認、定性分析共鑒定出多個化合物。劉宏等[13]基于UPLC-Q-TOF-MS技術建立了23批不同產地胡桃楸根藥材指紋圖譜，通過相似度評價和主成分分析，并根據化合物的精確分子量和碎片信息，結合文獻數據鑒定了其中的化學成分，為胡桃楸根的質量評價奠定了基礎。吳惠勤等[14]采用UPLC-Q-TOF-MS技術，構建了沉香數字化色譜-質譜指紋圖譜，共鑒定出沉香中30個化學成分。趙倩等[15]建立了掌葉大黃UPLC指紋圖譜采集方法，并基于UPLC-Q-TOF-MS技術通過對照品指認、文獻比對及高分辨質譜數據解析對掌葉大黃的化學成分進行全面定性分析。曹瑞等[16]利用類似技術方法建立了35批大黃飲片指紋圖譜，并生成對照指紋圖譜，標定共有峰45個，結合相似度評價技術建立了大黃飲片質量評價方法。

3.2 評價不同來源不同產地中藥材質量

葉耀輝等[17]采用UPLC-Q-TOF-MS技術在 35 min內建立了不同產地北柴胡藥材的指紋圖譜，并通過質譜數據處理軟件、代謝組學分析軟件對其進行主成分分析，該法能快速全面地區(qū)分不同產地北柴胡藥材中化學成分的差異，評價北柴胡藥材質量的優(yōu)劣。李丹丹等[18]采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件建立了30批大黃藥材(掌葉大黃20批、唐古特大黃和藥用大黃各5批)的HPLC指紋圖譜并進行相似度評價，采用偏最小二乘判別法結合UPLC-Q-TOF-MS技術定性鑒別3種來源大黃的差異性成分，該法可有效區(qū)分3種不同來源大黃藥材，為多來源藥材的鑒別和質量評價提供了參考。張藏蔓等[19]建立了野生、組織培養(yǎng)和種植等14批不同來源金線蓮藥材超高效液相色譜-飛行時間質譜指紋圖譜，并基于UPLC-Q-TOF-MS含量測定方法，從中指認出36個化學成分，結合指紋圖譜相似度考察、聚類分析及含量測定表明對藥材中化學成分種類及含量產生顯著影響的因素為產地和栽培時間。

此外，何席呈等[20]運用UPLC-Q-TOF-MS技術，建立了土茯苓基于內標校正的質譜指紋圖譜共有模式，反映了貴州產地域性藥材土茯苓的內在質量。馮光維等[21]采用UPLC-Q-TOF-MS技術，建立了不同產地12批地錦草的UPLC指紋圖譜，通過對照品比對指認了16個共有峰中的6個共有峰，表明地錦草在同一地域中的品質差異較小，質量穩(wěn)定。陳菲、芮雯等分別運用UPLC-Q-TOF-MS技術建立指紋圖譜，完成了對不同批次樟芝菌粉和7個產地黃芪藥材的質量評價[22-23]。

3.3 評價炮制機制對中藥材化學成分的影響

崔美娜等[24]應用UPLC-Q-TOF-MS技術，對半夏多物料多流程不同階段炮制品進行了研究分析，通過對總離子流指紋圖譜進行分析，根據色譜保留時間、一級精確質荷比、二級的碎片數據，同時結合相關文獻、數據庫以及質譜裂解規(guī)律，對主要色譜峰的來源進行了歸屬，發(fā)現(xiàn)半夏炮制前后化學成分存在明顯差異，為探究半夏多物料多流程炮制機制提供一種新的策略。蔡萍等[25]采用指紋圖譜結合化學計量學對23批不同來源蜜炙百合與生百合質量進行評價，基于UPLC-Q-TOF-MS技術和隨機森林算法對差異峰進行鑒別，發(fā)現(xiàn)王百合苷D和B對準確分辨炮制過的蜜炙百合和生百合具有重要貢獻。

3.4 中藥材真?zhèn)舞b別方面的應用

鐘惠嫻等[26]應用UPLC-Q-TOF-MS技術快速、準確地鑒別了防風和水防風的差異化合物，改法可用于防風指紋圖譜數據的快速分析，在防風和水防風性狀極易混淆的情況下，該技術結合薄層色譜鑒別法能判別防風藥材的真?zhèn)巍?/p>

4 UPLC-Q-TOF-MS技術在中藥復方制劑指紋圖譜研究和質量評價中的應用

復方制劑質量評價一般遵循整體的概念?；赨PLC-Q-TOF-MS技術，對中藥復方制劑的化學成分進行分析鑒別，原理上類似于對中藥材化學成分的分析，區(qū)別是分析鑒別完成后對主要化學成分進行藥材歸屬，從而闡明不同藥材對復方化學成分的貢獻。近年來，應用UPLC-Q-TOF-MS技術建立并分析中藥復方制劑指紋圖譜，結合天然產物化合物-高分辨質譜數據庫，并運用大數據對比分析，可以快速指認出中藥復方制劑化學成分及其藥材的歸屬，成為一種重要的中成藥制劑質量評價方法。

黃廣偉等[27]采用UPLC-Q-TOF-MS在正、負兩種離子模式掃描下，建立指紋圖譜，通過天然產物高分辨質譜數據庫結合對照品比對，從芩蘇膠囊中共檢測到68個化學成分，鑒定出22個化學成分，并分析出芩蘇膠囊中6個黃酮類成分來源于黃芩，3個酚酸和3個二萜醌類成分來源于丹參，3個黃酮和5個生物堿類成分來源于苦參，1個酚酸類成分來源于紫蘇子；發(fā)現(xiàn)黃酮、酚酸、二萜醌及生物堿4類成分構成了芩蘇膠囊的物質基礎。崔璐等[28]基于UPLC-Q-TOF-MS技術研究了不同廠家前列癃閉通片指紋圖譜，并對各樣品的指紋圖譜進行相似度評價，結合聚類分析評價了9個廠家58批樣品的質量，指認了指紋圖譜中主要共有峰的化學成分并確定了其藥材歸屬。吳琦等[29]基于該技術鑒定抱龍丸中的化學成分并建立指紋圖譜，最終通過軟件預測及文獻數據,從抱龍丸中鑒定出46個成分，為抱龍丸的質量標志物篩選、藥效物質基礎和質量控制研究提供了參考。馬瑩等[30]運用該技術建立指紋圖譜并分析發(fā)現(xiàn)桂枝茯苓膠囊中三萜酸類成分主要來自于茯苓藥材。李睿等[31]采用UPLC-Q-TOF-MS技術分析了復方湯劑麻黃湯水提取部分的化學成分。羅藝等[32]運用UPLC-Q-TOF-MS技術對治咳川貝枇杷滴丸的醇提物分析表征并建立指紋圖譜，通過相似度分析，表明不同批次滴丸的質量差異較小。

5 UPLC-Q-TOF-MS技術在譜效關系研究中的應用

將中藥指紋圖譜與藥效學試驗有機結合，研究譜效關系，能揭示出中藥發(fā)揮藥效的物質基礎以及建立中藥質量評價標準。譜效關系是指紋圖譜研究的高級階段，中藥譜效關系研究常采用化學計量學的方法，建立中藥指紋圖譜與藥效作用之間的相關性，通過相關性分析可以更加全面地對中藥質量進行控制與評價。整體思路是采用一定的分析方法建立中藥指紋圖譜，并研究其中的化學成分，建立適宜的藥效評估模型，并獲得相應藥理數據，通過適宜的數據處理技術對相應的指紋圖譜數據及藥理結果進行相關性分析從而建立起譜效關系模型[33]。近年來，已有不少文獻報道借助UPLC-Q-TOF-MS技術建立中藥指紋圖譜，然后選擇合適方法對指紋圖譜中各共有峰與藥效指標的相關性進行分析，進而揭示中藥發(fā)揮藥效的物質基礎以及建立中藥質量評價標準。

程斌等[34]借助UPLC-Q-TOF-MS，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》建立了10批不同產地浙貝母的指紋圖譜，以小鼠耳腫脹度和血清中丙二醛、一氧化氮水平為藥效指標，采用雙變量相關分析法和灰色關聯(lián)度分析法對UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜中各共有峰與抗炎藥效指標的相關性進行分析，從而篩選出貝母素乙、貝母素甲、環(huán)巴胺等可能是浙貝母具有抗炎作用的質量標志物。周姣姣等[35]利用UPLC-Q-TOF-MS，通過標準品比對和文獻檢索對美洲大蠊提取物CⅡ-3所含化合物進行分析鑒定，以CⅡ-3對人肝癌細胞HepG2的半抑制濃度為抗肝癌活性指標，采用灰色關聯(lián)度分析法和正交偏最小二乘法聯(lián)合建立指紋圖譜與抗肝癌活性之間的譜效關系，初步闡明了美洲大蠊提取物CⅡ-3體外抗肝癌的活性物質，為該藥的物質基礎研究和臨床應用提供了實驗依據。

6 UPLC-Q-TOF-MS技術應用建議

UPLC-Q-TOF-MS技術的出現(xiàn)使得中藥指紋圖譜的研究更加便捷、高效，也使得中藥的嚴格質量把控逐漸成為可能，依靠現(xiàn)代數據處理軟件和工具，極大地方便了分離組分質譜的解析，使推測物質成分和結構特征變得相對容易。未來中藥分析技術必將是相互交叉、配合使用的，所以筆者認為，未來該技術應用著眼于以下幾方面會更加凸顯優(yōu)勢。

1)結合新興的前處理技術和其他分析技術

作為對待測組分提取、富集和純化的樣品前處理步驟，關系著整個分析方法的優(yōu)劣，還決定著分析結果的準確性和重現(xiàn)性[36]，未來UPLC-Q-TOF-MS技術只有結合適當的中藥前處理技術使用，才能發(fā)揮出更大優(yōu)勢。近年來出現(xiàn)的許多高效、快速和微量化的前處理技術，如固相微萃取、超臨界流體萃取等，必將在與UPLC-Q-TOF-MS技術的配合應用中起關鍵作用。此外，未來UPLC-Q-TOF-MS技術結合核磁共振、X射線衍射、圓二色譜等輔助分析技術，更能發(fā)揮該技術在中藥分析中的定性定量優(yōu)勢。

2)結合質譜大數據庫配合軟件分析

中藥的液質數據庫信息量大，包含非常多的化學成分信息，并且質譜解析需輔以一定的專業(yè)知識，這些導致了液質的數據信息不能被很好地挖掘[37]。如果將UPLC-Q-TOF-MS技術與數據庫技術結合，并配合先進分析軟件輔助中藥成分鑒定，便可以更充分地挖掘液質數據信息，進一步提高定性鑒別效率，這將是該技術未來應用的一大趨勢。這點在近些年的中藥分析研究中也常有體現(xiàn)，借助UPLC-Q-TOF-MS技術建立一級精確質量數以及二級碎片離子質譜圖數據庫，實現(xiàn)一次進樣，便可以對多種已知和未知化合物進行全面篩查分析。

3)中藥指紋圖譜譜效關系有待進一步深入研究

目前，常用的相似度等評價方法所評價的化學成分并非完全是活性成分或與藥效相關的成分，僅能鑒定中藥材的真實性，而不能對中藥材的有效性進行評價[38]。將化學指紋圖譜所體現(xiàn)的化學成分與藥效信息建立相關性的譜效關系研究，是傳統(tǒng)化學指紋圖譜的有效補充，目前這方面研究略顯欠缺。未來期望有更多的研究者利用UPLC-Q-TOF-MS技術開展這方面的研究工作，以期更好的推動中藥譜效關系研究。

總之，相信隨著UPLC-Q-TOF-MS技術應用的深入和現(xiàn)代分析技術的更新發(fā)展，未來必然會出現(xiàn)更多元、更多級的串聯(lián)質譜法。該類技術也會朝著更高效、更準確、更智能化方向發(fā)展，該類技術在中藥指紋圖譜研究和中藥質量評價中也將發(fā)揮越來越重要的作用。