周佳明,陳 岡,司伏生,于瑞嵩,陳冰清,謝春芳,李 震,董世娟?

(1 上海市金山區(qū)動物疫病預防控制中心,上海 201540;2 上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室,上海市種豬育種工程中心,上海 201106)

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的通過消化道感染的急性病毒性肝炎,主要通過污染的水和食物經(jīng)糞-口傳播,也可經(jīng)血液、母嬰傳播[1-2]。 人群中戊型肝炎的病死率較甲型、乙型、丙型和丁型肝炎高,青壯年戊肝病死率可達1%—2%,患病孕婦的病死率高達21%[3],給人類健康造成了嚴重威脅。 研究證實,HE 是人畜共患傳染病[4],HEV 可跨種間傳播[5-7],多種動物是HEV 的重要宿主[8-9],且豬是公認的HEV 重要儲存宿主和傳染源,國內(nèi)外均有豬HEV 傳染人類的報道[10]。 HEV 有1 個血清型和4 個基因型。 基因1 型、2 型只感染人,而3 型、4 型為人畜共患型,可感染人和多種動物。 基因1 型主要流行于西亞、我國新疆等地區(qū)及非洲的部分地區(qū);基因2 型流行于中美洲墨西哥等國,基因3 型最初流行于歐洲、北美以及新西蘭,近年來也開始在亞洲的國家和地區(qū)流行,如日本、韓國、中國等。 基因4 型主要在亞洲各國和地區(qū)流行。 在我國,人感染的HEV 基因型包括1 型、3 型和4型[11],豬場流行的HEV 主要為3 型和4 型[12]。

HEV 在我國豬群中廣泛存在,Zhou 等[13]對我國不同地區(qū)的1 768 頭商品豬血清樣本進行流行病學分析,發(fā)現(xiàn)HEV 抗體總陽性率達到67.14%(四川62.75%、福建67.03%、湖北62.50%、安徽62.81%、江西73.73%、寧夏73.1%、甘肅70.81%)。 Ning 等[12]對上海郊區(qū)豬場糞便樣本進行HEV 分子流行病學調查,發(fā)現(xiàn)26%的樣本為HEV 陽性。 紀方曉等[14]對廣東不同豬場的豬膽汁樣本進行分析,發(fā)現(xiàn)HEV 的陽性率為6.8%。 為了解上海郊區(qū)豬場豬戊型肝炎的最新流行狀況,本研究對上海郊區(qū)部分豬場進行HEV 分子流行病學調查和流行毒株的遺傳進化分析,以期為HEV 的防控和公共衛(wèi)生安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

采集上海郊區(qū)3 個豬場豬糞便樣本共180 份,其中2 月齡仔豬糞便樣本60 份,5—6 月齡育肥豬糞便樣本60 份,母豬糞便樣本60 份。 糞便樣品用滅菌的PBS 制成10% 糞便懸液,震蕩混勻,于4 ℃、12 000 r∕min 離心10 min,收集上清,置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2 主要試劑

病毒RNA 提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品;一步法高效RT-PCR 試劑盒為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠DNA 回收試劑盒為愛思進生物技術(杭州)有限公司產(chǎn)品;E.coli DH5α 感受態(tài)細胞為實驗室制備保存;Clone JET PCR Cloning Kit 載體為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物

利用巢氏PCR 引物擴增ORF2 基因的部分片段,長度為189 bp。 所用引物序列為外側引物:H1(5’-CTGTTTAAYCTTGCTGACAC-3’) 和 H2 (5’-WGARAGCCAAAGCACATC-3’); 內(nèi) 側 引 物 H3 (5’-GACAGAATTGATTTCGTCG-3’)和H4(5’-TGYTGGTTRTCRTAATCCTG-3’)。

1.4 病毒總RNA 抽提

按照病毒RNA 快速純化試劑盒說明書進行操作,抽提的RNA 溶解在30 μL RNase-free 的DEPC 水中,并保存于-80 ℃冰箱。

1.5 ORF2 基因擴增

ORF2 基因擴增采用巢氏RT-PCR 反應進行,首先利用一步法高效RT-PCR 試劑盒擴增HEV ORF2 基因。 一步法總反應體系為25 μL:2 ×One Step Mix 12.5 μL,One Step Enzyme Mix 1.25 μL,外側引物H1、H2 各1 μL,RNA 9.25 μL。 反應條件為:50 ℃30 min,94 ℃3 min;94 ℃30 s,53 ℃30 s,72 ℃50 s,34個循環(huán);72 ℃延伸5 min。 利用第一輪PCR 產(chǎn)物進行第二輪擴增,反應體系為:2 ×Taq PCR Mix 6.25 μL,內(nèi)側H3、H4 各0.5 μL,DEPC 水2.25 μL,cDNA 3 μL。 反應條件為:94 ℃3 min;94 ℃30 s,53 ℃30 s,72 ℃40 s,35 個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.6 PCR 產(chǎn)物克隆、序列測定和比較分析

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,克隆至pJET 1.2∕blunt 載體中,轉化后挑取陽性克隆進行PCR 鑒定,提取質粒,送鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。 將測定結果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析,鑒定基因型;分別在經(jīng)鑒定為基因3 型和4 型的樣本中選擇序列有差異的代表性樣本(樣本按照豬場所在區(qū)名的首字母+陽性樣本的順序號命名)與GenBank 中登錄的34 條HEV 的ORF2 基因的核苷酸序列進行同源性分析,并利用DNAstar 軟件進行遺傳進化分析。

2 結果與分析

2.1 糞便樣品HEV ORF2 基因檢測

180 份糞便樣本經(jīng)PCR 擴增后,28 份樣本擴增出189 bp 的特異性條帶,與預期目的片段大小相符。將28 份陽性樣本的ORF2 基因進行序列分析,經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 比對發(fā)現(xiàn),23 份樣本為基因4 型,5份為基因3 型。 圖1 為3 份代表性樣品(從基因3 型和基因4 型的樣本中選取)的電泳分析。 180 份糞便樣本的HEV 總陽性率為15.6%(表1),其中50—60 日齡豬糞便中檢測到19 份陽性,陽性率為31.7%;5—6 月齡豬糞便中檢測到9 份陽性,陽性率為15.0%;母豬糞便樣本中未檢測到HEV 陽性。

表1 豬糞便中HEV RNA 的PCR 檢測結果Table 1 PCR detection results of HEV RNA in pig feces

2.2 ORF2 部分基因序列測定及進化樹分析

從28 份陽性樣本中選取4 份基因4 型的樣本(FX01、FX03、JS01、FX04 毒株)、1 份基因3 型的樣本(FX06 毒株)擴增的ORF2 序列與GenBank 中參考毒株序列(表2)構建系統(tǒng)進化樹(圖2)。 結果表明:本試驗所檢測的FX01、FX03、JS01、FX04 毒株與基因4 型參考毒株SAAS-FX17 的序列同源性高達96.3%;FX06 毒株與基因3 型參考毒株SAAS-JDY5 的序列同源性高達97.9%。

表2 HEV 參考毒株的信息Table 2 Information of HEV reference strains

2.3 ORF2 基因的同源性分析

圖2 HEV ORF2 基因部分毒株的遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ORF2 gene of some HEV strains

同源性分析發(fā)現(xiàn),5 個毒株(FX01、FX03、FX04、FX06、JS01)的核苷酸同源性為80.9%—98.4%,其中基因4 型的4 個毒株(FX01、FX03、FX04、JS01)核苷酸同源性為96.3%—98.4%,與基因4 型參考毒株的核苷酸同源性為91.5%—96.3%;基因3 型毒株FX06 與其他4 個基因4 型毒株的核苷酸同源性為80.9%—83%,與基因3 型參考毒株的核苷酸同源性為90.4%—97.9%。

對本試驗的參考毒株序列與代表性毒株序列進行核苷酸同源性分析表明:1 型組內(nèi)毒株的核苷酸同源性為95.8%—100%,與2 型、3 型、4 型毒株的核苷酸同源性分別為83.6%—87.8%、84.1%—88.4%、83.6%—88.4%;2 型組內(nèi)毒株的核苷酸同源性為87.3%—100%,與3 型、4 型毒株的核苷酸同源性分別為81.5%—86.8%、82.5%—86.2%;3 型組內(nèi)毒株的核苷酸同源性為90.5%—100.0%,與4 型毒株的核苷酸同源性為82.0%—86.2%;4 型組內(nèi)毒株的核苷酸同源性為88.4%—100.0%。

3 討論

戊型肝炎病毒是人病毒性肝炎的重要病原之一,全球每年超過百萬人感染,被世界衛(wèi)生組織認定為影響發(fā)展中國家的重要公共衛(wèi)生問題[15]。 動物HEV 感染宿主范圍廣、種類多、變異快,目前已在豬、雞、兔、駱駝、牛、羊等動物中獲得了不同動物的HEV 分離株[16]。 豬是主要的病毒儲庫,是人戊型肝炎的主要傳染源之一,我國豬HEV 的流行情況復雜,存在感染率高、同一地點不同基因型重復污染、與多種病原共存的現(xiàn)象[17]。 目前,全世界范圍內(nèi)把HEV 分成4 個基因型,本研究團隊于2007 年在上海郊區(qū)豬場首次發(fā)現(xiàn)我國大陸存在HEV 基因3 型毒株[18],為戊型肝炎的防控提供了重要的病原信息,而且分子流行病學調查發(fā)現(xiàn)HEV 的陽性率為26%[12]。 2009 年,周錦萍等[19]對上海51 個豬場1 699 份豬糞便樣本進行HEV RNA 檢測發(fā)現(xiàn),HEV 陽性率為11.83%。

近幾年,鮮有對上海地區(qū)豬HEV 感染情況的文獻報道。 為了解近期上海地區(qū)豬HEV 流行情況,本研究對上海郊區(qū)的3 個豬場進行了流行病學調查,發(fā)現(xiàn)一個豬場的HEV 感染率為30%,且具有基因3 型和基因4 型HEV 共存的現(xiàn)象,3 型的感染率為5.6%,4 型的感染率為24.4%,與2008 年于水生等[20]的調查結果基本一致,基因3 型HEV 與基因4 型競爭感染中仍舊處于劣勢。 另外2 個豬場各45 份樣本中,只發(fā)現(xiàn)其中一個豬場1 份為基因4 型的HEV,另一個豬場中沒有HEV 感染。 本次調查的豬場間感染率差別大,通過對豬場的管理和衛(wèi)生情況調查發(fā)現(xiàn),感染率低的豬場是規(guī)?；i場,豬場管理更完善,并設有糞污處理設施,排泄物能及時清除,衛(wèi)生條件較好,在一定程度上減少了易感豬群傳播感染。

雖然感染豬沒有明顯的肝炎臨床癥狀,但肝臟部位有不同程度的病變[21],對于相關生產(chǎn)指標有負面影響,給養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失。 豬肉是人類主要的肉食品來源之一,豬的肝臟HEV 相關抗原的陽性檢出率高[21],必然會對人類的健康構成潛在威脅,應予以關注,加強豬肉、豬肝食品衛(wèi)生宣傳管理。 建議豬場提高管理水平,重視豬場消毒衛(wèi)生及糞便的無害化處理,以降低HEV 的感染,這些措施也在本研究中零感染的豬場得到了印證。

本研究中,FX01、FX03、FX04、JS01 毒株為基因4 型,與參考毒株SAAS-FX17 的核苷酸同源性為95.2%—96.3%;FX06 毒株屬于基因3 型,與參考毒株SAAS-JDY5 的核苷酸同源性為97.9%。 上述2 個參考毒株分別為本研究團隊于2009 年、2012 年分離的毒株,并進行了全基因序列測定[22-23]。 同源性分析顯示,本研究中的毒株與10 年前分離于上海的毒株遺傳關系最近。