薛永常，麻新妍

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧，大連 116034）

黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）是唇形科多年生藥用植物，其藥用組分為黃酮。查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）是黃酮類化合物合成途徑的關(guān)鍵調(diào)控酶［1］，可催化查爾酮為柚皮素，控制著其下游黃酮及異黃酮等次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量［2］，對(duì)查爾酮異構(gòu)酶的研究具有重要意義。研究表明chi超量表達(dá)可以提高甘草發(fā)根黃酮化合物的含量［3］及紅掌花青素的合成［4］；chi下降調(diào)節(jié)可降低冬棗花色苷和槲皮素含量，延緩冬棗變紅［5］。而CHI 既可提高啤酒花中黃腐醇和脫甲基黃腐醇活性，從而影響啤酒風(fēng)味和品質(zhì)［6］，又能增加銀杏雙黃酮的生成，抑制乳腺癌細(xì)胞體外增殖，已成為乳腺癌治療的一種新手段［7］；同時(shí)CHI 還能促進(jìn)?；S酮醇苷前體楊梅素生物合成，使?；S酮醇苷大增［8-9］，成為治療II型糖尿病的潛在新藥。在傳統(tǒng)中藥中黃芩多以根部入藥，無(wú)序采集嚴(yán)重破壞了野生黃芩的生境，因此保護(hù)黃芩自然資源，探究黃芩整株植物不同器官在中草藥的利用十分必要。Park 等［10］及郭雙雙等［11］分別從黃芩毛狀根及愈傷組織中克隆chi，證明超表達(dá)chi可提高黃芩毛狀根黃酮化合物的含量。本研究擬從黃芩葉mRNA中反轉(zhuǎn)錄獲得chi全長(zhǎng)cDNA，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為野生黃芩資源的可持續(xù)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）采自河北省承德市霧靈山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α及BL21（DE3），由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及儀器

TransZol UP 試劑盒（北京全式金生物有限公司）、PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2、pMDTM19-T Vector cloning kit、QuickCutTMEcoRI、Quick-CutTMHindIII、Taq DNA polymerase（5 U/μL）、DNA Marker（寶生物工程（大連）有限公司）、Fast Pure 質(zhì)粒提取試劑盒（南京諾維贊生物科技有限公司）；

Thermal Cycle Dice TP610（日本TaKaRa 公司）、Himac CR-21G高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)

參考NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為HQ153041.1、KT963462.1、KP064512.1 的黃芩查爾酮異構(gòu)酶基因mRNA 序列，通過(guò)比對(duì)，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增chi全長(zhǎng)cDNA的特異性引物：

M-CHI-S：ATGTCTGCTTCGCCATCCG

M-CHI-A：TTAAAACAACTCCGATAGTCTT GCC

1.3.2 黃芩chi基因克隆、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及鑒定

選取盛花期黃芩葉片，TransZol UP 法提取其總RNA，使用PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2，以M-CHI-S 和M-CHI-A 為特異引物擴(kuò)增chicDNA。目的擴(kuò)增產(chǎn)物與pMDTM19-T 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定后進(jìn)行測(cè)序，NCBI在線分析目的基因序列。

1.3.3chi基因的原核表達(dá)

EcoRI 及HindIII 對(duì)pET-32a（+）及pMDTM19-Tchi雙酶切，回收目的DNA 片段并連接，構(gòu)建其表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。

加入適當(dāng)濃度的IPTG 于pET-32a（+）-chi培養(yǎng)液，以誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。培養(yǎng)液在4℃，13 000 g離心10 min，2 × SDS 上樣緩沖液懸浮沉淀；煮沸5 min 后置冰上3 min；13 000 g 離心1 min，取10 μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因chi的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增

以黃芩葉總RNA 為模板進(jìn)行chi的RT-PCR。電泳圖譜顯示在500～750 bp 呈現(xiàn)一條清晰擴(kuò)增條帶，與預(yù)期的chi基本一致（如圖1）。

圖1 chi基因擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of chi gene fragment

2.2 目的基因的鑒定

2.2.1 重組質(zhì)粒的提取及鑒定

挑選白色陽(yáng)性單克隆菌落提取質(zhì)粒DNA，電泳圖譜呈現(xiàn)一條約3 kb 的清晰的條帶，與目的質(zhì)粒大小基本一致（圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒DNA電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid DNA

對(duì)質(zhì)粒DNA 進(jìn)行特異引物PCR，能夠從重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出一條約700 bp 清晰條帶（圖3），與chi大小基本一致，質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖3 質(zhì)粒DNA中擴(kuò)增chi基因電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of chi gene from recombinant plasmid DNA

對(duì)重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果顯示，在約2 800 bp 和700 bp 各出現(xiàn)一條清晰的條帶，與pMDTM19-T 載體及擴(kuò)增片段一致（圖4），說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖4 重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.4 Recombinant plasmid cut by two endonucleases

2.2 目的基因序列的生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的目的基因片段全長(zhǎng)648 bp，為一個(gè)起始密碼子為ATG、終止密碼子為T(mén)AA的完整ORF。同源性分析表明，其與S. baicalensischalcone isomerase（ID：HQ153041.1）相 似 度 達(dá) 到100%，擬編碼215 個(gè)氨基酸，理論分子量為36.854 KDa。EXPASY protparam 預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)為5.09，擬翻譯蛋白的分子式為C1040H1632N258O321S4，屬于穩(wěn)定性親水性蛋白。BLAST 比對(duì)表明，該蛋白中含有查爾酮酶核心區(qū)域及查爾酮異構(gòu)酶催化特有結(jié)構(gòu)域PLN02559 模塊，屬于查爾酮_3 超家族（圖5），其主要作用是將查爾酮異構(gòu)化為柚皮素，從而進(jìn)行花青素等黃酮類化合物的產(chǎn)生。因此，該目的基因序列為chi全長(zhǎng)序列，并將該重組質(zhì)粒命名為pMDTM19-T-chi。

圖5 chi基因的結(jié)構(gòu)域分析Fig. 5 The Analysis of chi gene domain

與來(lái)源不同科、屬的茶花、紫蘇、丹參、青棗、藿香、大花美人蕉chi的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析（圖6）表明，該序列與同為唇形科黃芩、鼠尾草屬丹參、紫蘇屬紫蘇親緣關(guān)系最近，同源性分別為100%、99%、95%；但與荊芥屬藿香親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，再次是鼠李科棗屬青棗、山茶科茶花及美人蕉科的大花美人蕉。說(shuō)明chi在同科屬中是相對(duì)保守的，在不同科植物有一定的差異，這與CHI 在黃酮化合物生物合成途徑的地位及作用是相一致的。

圖6 chi系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建Fig. 6 The phylogenetic tree of chi gene

同時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)源黃芩不同組織/器官——毛狀根（HQ153041.1）、愈傷組織（KP064512.1）及本文葉片擴(kuò)增的chi序列比對(duì)（圖7），發(fā)現(xiàn)chi在黃芩毛狀根、愈傷組織及葉片中各只有一個(gè)核苷酸的差異，序列高度保守，同源性接近100%，說(shuō)明CHI在黃芩的不同部位及不同器官可能執(zhí)行同樣的功能，在進(jìn)化中高度保守。

圖7 不同黃芩器官chi序列比對(duì)圖Fig.7 Multiple alignment of chi from different scutellariae organs

而從其擬表達(dá)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，其α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲及延伸鏈占比分別為42.33%、26.89%及21.40%，說(shuō)明該目的蛋白性質(zhì)穩(wěn)定（圖8），與同源性分析結(jié)果一致。

圖8 擬表達(dá)的CHI蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 The tertiary structure prediction of pupative CHI

2.3 chi基因的原核表達(dá)與SDS-PAGE分析

培養(yǎng)含有pET-32a（+）及pET-32a（+）-chi的單克隆菌落至OD600為0.6。加入終濃度為0.5 mmol/L和1 mmol/L的IPTG以誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。

SDS-PAGE 圖譜（圖9）顯示，pET-32a（+）在整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程中均無(wú)特異蛋白表達(dá)。pET-32a（+）-chi菌株在0.5 mmol/L 和1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)10 h 后，均能表達(dá)出一30 kDa 的融合蛋白，與同源性分析的大小基本一致。同時(shí)從圖譜中看出，0.5 mmol/L 和1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)下pET-32a（+）-chi的蛋白表達(dá)差異不大，說(shuō)明0.5 mmol/L IPTG 已足夠蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量在誘導(dǎo)16 h 時(shí)達(dá)到峰值。說(shuō)明chi基因在大腸桿菌BL21（DE3）得以高效表達(dá)。

圖9 chi基因表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of chi expressed product

3 結(jié)果與討論

本研究從黃芩葉mRNA 中反轉(zhuǎn)錄克隆出一個(gè)648 bp的全長(zhǎng)chi基因序列，生物信息學(xué)分析表明其具有查爾酮異構(gòu)酶催化特有結(jié)構(gòu)域PLN02559，屬于查爾酮_3 超家族成員。構(gòu)建的表達(dá)載體pET-32a（+）-chi在IPTG 誘導(dǎo)下在大腸桿菌中異源表達(dá)出一分子量約為30.0 kDa 的目的融合蛋白，為進(jìn)一步研究CHI的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

在對(duì)苜蓿CHI 的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)合不同底物時(shí)主要是保守的Thr48 和Tyr106 與2 個(gè)水分子及在Asn113 和Thr90 與黃酮的7-羥基之間的兩組氫鍵起催化作用［13-14］，且在相近物種中是高度保守的，并且與濕泥霉菌、真菌及變形桿菌等CHI 的保守序列區(qū)（CDD：174782）也存在較大相似度［15-17］，暗示著CHI作為黃酮類物質(zhì)生物合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，從細(xì)菌到高等植物中普遍存在，它們可能具有非常古老的起源，且進(jìn)化保守，預(yù)示著可能執(zhí)行著相似的功能［9，18］。而本研究的chi進(jìn)化顯示chi在黃芩不同器官高度保守，與其它相近科屬的物種之間也有廣泛的同源性，在不同科屬植物中的代謝進(jìn)化中執(zhí)行了相同/相似的功能，這與郭雙雙等［11］的結(jié)果是一致的。而從黃芩毛狀根、愈傷組織及葉片chi幾乎完全相同，預(yù)示著傳統(tǒng)中草藥實(shí)踐中可以通過(guò)組織培養(yǎng)毛狀根、愈傷組織或葉替代野生黃芩根用藥，對(duì)于保護(hù)野生黃芩資源具有重要的意義。本研究對(duì)黃芩chi的研究為進(jìn)一步研究CHI 的生物學(xué)功能，提高黃芩不同器官中黃酮類化合物含量，為野生黃芩資源的可持續(xù)綜合利用提供理論依據(jù)。