劉建勇，王照蘭，杜建材，張穎娟，3

（1.內(nèi)蒙古師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古師范大學(xué) 學(xué)報(bào)編輯部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022）

胡枝子屬（Lespedeza）植物，為豆科（Leguminosae）重要的野生牧草種質(zhì)資源，全世界有60 余種，我國(guó)26 種［1］，屬多年生草本狀半灌木或灌木。其根系發(fā)達(dá)，抗干旱、寒冷，耐貧瘠，生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛分布于沙石地、丘陵水土流失嚴(yán)重地帶及退化沙化草地等，在我國(guó)北方地區(qū)水土保持、退化沙化草地植被恢復(fù)、荒漠化防治中具有重要的開(kāi)發(fā)利用潛力［2］。但是，與紫花苜蓿（Medicago sativa）、三葉草（Trifolium repens）、錦雞兒（Caragana sinica）等其他豆科牧草相比，對(duì)胡枝子屬植物的研究和利用相對(duì)滯后，培育出的胡枝子品種較少［3］。

隨著國(guó)家生態(tài)治理和荒漠化防止政策的實(shí)施，胡枝子屬植物的重要價(jià)值，引起了許多學(xué)者的關(guān)注。黃瑾等［4］研究了達(dá)烏里胡枝子在黃土丘陵區(qū)的生產(chǎn)力及土壤水分。趙國(guó)靖等［5］揭示了達(dá)烏里胡枝子根系形態(tài)特征對(duì)土壤水分變化的響應(yīng)。薛菲等［6］開(kāi)展了胡枝子對(duì)鹽堿脅迫的生理響應(yīng)。有關(guān)尖葉胡枝子（Lespedeza hedysaroides）、牛枝子（Lespedeza potaninii）和達(dá)烏里胡枝子（Lespedeza davurica）3 個(gè)物種抗旱機(jī)理的研究報(bào)道尚少。

尖葉胡枝子（L.hedysaroides）為小灌木，主要分布于我國(guó)東北及華北，是華北地區(qū)山地天然草地中最常見(jiàn)的豆科牧草之一［1］。牛枝子（L.potaninii）為半灌木，分布于我國(guó)華北、西北、華中等多個(gè)省區(qū)，生長(zhǎng)于荒漠草原、草原帶的沙質(zhì)地、丘陵地、礫石地、石質(zhì)山坡及山麓，耐干旱，可作水土保持及固沙植物［1］。達(dá)烏里胡枝子（L.davurica）為草本狀半灌木，主要分布在我國(guó)東北、華北、西北、華中至云南，生長(zhǎng)于森林草原和草原地帶的干山坡，丘陵坡地、沙質(zhì)地，為草原群落的次優(yōu)勢(shì)成分或伴生成分，耐旱耐瘠薄，適于放牧或刈割，也可作為山地、丘陵地及沙化草地的水土保持植物［1］。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定上述3 種植物在干旱脅迫條件下的生理指標(biāo)，了解3 種植物的抗旱機(jī)理，旨在探討其抗旱生理變化特征，為開(kāi)展其轉(zhuǎn)錄組研究、新品種培育以及在干旱條件下的種植利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

研究材料為課題組通過(guò)前期研究培育出的尖葉胡枝子、牛枝子和達(dá)烏里胡枝子，均來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 種子處理 選取上述3 種胡枝子粒大飽滿的成熟種子（果實(shí)），分別用砂紙進(jìn)行打磨，去除其果皮并破除其種子硬實(shí)性（通過(guò)預(yù)備試驗(yàn)，確保打磨后的種子發(fā)芽率達(dá)75% 以上）。將打磨好的干凈種子，按不同種分別放入盛有75% 乙醇的燒杯中，滅菌處理3 min 后，倒出75% 乙醇，加入蒸餾水，快速?zèng)_洗多次。之后分別取出各種子，置于多層干濾紙上，風(fēng)干待用。

1.2.2 發(fā)芽試驗(yàn) 在15 cm 口徑的培養(yǎng)皿中，鋪兩層濾紙，將上述處理好的種子置于濾紙上，每個(gè)培養(yǎng)皿200 粒種子，每種胡枝子50 個(gè)培養(yǎng)皿。之后，將培養(yǎng)皿放入植物培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)芽（溫度25 ℃，光強(qiáng)5 500 lx，光/黑=12 h/12 h）。發(fā)芽24 d 后，倒出培養(yǎng)皿中的水，再向各培養(yǎng)皿中加入15%PEG‐6000 溶液，進(jìn)行模擬干旱脅迫處理。在脅迫的0 h（對(duì)照）、6.5 h、13 h、19.5 h、26 h，依次取各種胡枝子的幼苗（包括根和葉），測(cè)定RWC（相對(duì)含水量）、REC（相對(duì)電導(dǎo)率）、SOD（超氧化物歧化酶）活性和MDA（丙二醛）含量，每種胡枝子的4 個(gè)指標(biāo)在各個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)，均設(shè)3 次重復(fù)。

1.3 測(cè)試方法

相對(duì)含水量測(cè)定采用了飽和稱量法；質(zhì)膜透性測(cè)定采用了相對(duì)電導(dǎo)率法；丙二醛含量測(cè)定采用了硫代巴比妥酸法［7］。超氧化物歧化酶測(cè)定使用上海生物科技有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體方法采用分光光度法（具體操作略有改動(dòng)），即首先將各個(gè)處理梯度的胡枝子幼苗樣品（約0.15 g），從-80 ℃超低溫冰箱取出，置于預(yù)冷好的研缽，加液氮快速研磨好后，轉(zhuǎn)入提前預(yù)冷好的離2.5 mL 心管，之后加入1 mL 提取液，充分震蕩均勻。在8 000 r/min 離心機(jī)離心10 min，溫度保持4 ℃，取上清液，置于冰上。之后按照試劑盒步驟依次加入試劑，混勻，室溫靜置30 min，加入1 mL 比色皿中，測(cè)定各處理在560 nm 處的吸光度（測(cè)定前將分光光度計(jì)預(yù)熱30 min 以上，并調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至560 nm，用蒸餾水調(diào)零）。按照下式計(jì)算各處理樣品SOD 酶活性。

式中：I為抑制百分率；M為樣本質(zhì)量；C為對(duì)照管；D為吸光度測(cè)定管。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL2019 和SPSS26 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 干旱脅迫下三種胡枝子幼苗的相對(duì)含水量

15% 的PEG 溶液模擬干旱脅迫不同時(shí)間梯度下，3 種胡枝子幼苗的相對(duì)含水量變化如圖1 所示。從圖1 可以看出，在未受脅迫的條件下，牛枝子的相對(duì)含水量最高，為90.75%，其次是尖葉胡枝子（89.82%），相對(duì)含水量最低的是達(dá)烏里胡枝子（83.99%）。

圖1 不同時(shí)間梯度15% PEG 溶液干旱脅迫下三種胡枝子的相對(duì)含水量變化Fig.1 Changes of relative water content of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

隨著脅迫（15%PEG 溶液處理）時(shí)間的延長(zhǎng)，尖葉胡枝子和牛枝子的幼苗相對(duì)含水量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但二者對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)情況有所不同。尖葉胡枝子在脅迫6.5 h、13 h 時(shí)與未脅迫對(duì)照相比差異不顯著（P>0.05），在脅迫19.5 h 時(shí)，其幼苗相對(duì)含水量發(fā)生顯著下降（P<0.05）；而牛枝子在脅迫6.5 h 時(shí)，幼苗相對(duì)含水量發(fā)生顯著下降（P<0.05），為80.10%，之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，其幼苗相對(duì)含水量基本保持穩(wěn)定（P>0.05）。

達(dá)烏里胡枝子幼苗在15%PEG 溶液處理6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 下的相對(duì)含水量與其未脅迫對(duì)照相比差異均不顯著（P>0.05），其幼苗對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出了相對(duì)較好的耐受性。

2.2 干旱脅迫下三種胡枝子幼苗相對(duì)電導(dǎo)率

理論上，植物受到干旱脅迫時(shí)，若細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到傷害，則會(huì)引起細(xì)胞膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)容物外滲，使外滲液電導(dǎo)值增大。三種胡枝子相對(duì)電導(dǎo)率隨脅迫時(shí)間的變化如圖2 所示。由圖2 可見(jiàn)，在未受脅迫的環(huán)境下，達(dá)烏里胡枝子的相對(duì)電導(dǎo)率最高，為30.62%，其次是尖葉胡枝子（26.86%），相對(duì)電導(dǎo)率最低的是牛枝子（14.82%）。

圖2 不同時(shí)間梯度15%PEG 溶液干旱脅迫下三種胡枝子電導(dǎo)率變化Fig.2 Changes of electrical conductivity of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，尖葉胡枝子和達(dá)烏里胡枝子的幼苗相對(duì)電導(dǎo)率均在6.5 h 時(shí)，出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，但尖葉胡枝子的各個(gè)處理和對(duì)照之間均差異不顯著（P>0.05）。達(dá)烏里胡枝子在脅迫6.5 h 時(shí)，幼苗電導(dǎo)率顯著低于對(duì)照（P<0.05），在處理6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 之間差異不顯著（P>0.05），但均顯著低于對(duì)照（P<0.05）。

牛枝子在脅迫6.5 h 時(shí)，幼苗相對(duì)電導(dǎo)率亦發(fā)生顯著下降（P<0.05），降為11.56%，之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，從整體來(lái)看產(chǎn)生了上升趨勢(shì)。

2.3 干旱脅迫下三種胡枝子幼苗丙二醛含量

植物在干旱脅迫到超過(guò)其可以承受的程度時(shí)，會(huì)產(chǎn)生膜脂過(guò)氧化作用。膜脂過(guò)氧化的最終結(jié)果是產(chǎn)生丙二醛。丙二醛的積累對(duì)膜和細(xì)胞造成一定的傷害。

三種胡枝子的幼苗，在6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理的丙二醛含量與未經(jīng)處理的對(duì)照相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異均不顯著（P>0.05），如圖3 所示。表明15% 的PEG 溶液模擬干旱脅迫6.5 h~26 h，尚未對(duì)參試的尖葉胡枝子、牛枝子和達(dá)烏里胡枝子的細(xì)胞膜產(chǎn)生顯著傷害。

圖3 不同時(shí)間梯度15% PEG 溶液模擬干旱脅迫下三種胡枝子丙二醛含量變化Fig.3 Changes of MDA of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

2.4 干旱脅迫下三種胡枝子幼苗超氧化物歧化酶活性

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的重要保護(hù)酶之一，在細(xì)胞抗氧化、衰老 中 起 著 至 關(guān) 重 要 的 作 用［10］。 經(jīng)15%PEG 溶液模擬干旱脅迫6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 后，3 種供試胡枝子幼苗的SOD 活性都有不同程度提高，但不同胡枝子間的變化趨勢(shì)不同（圖4）。由圖4 可知，尖葉胡枝子在未經(jīng)脅迫處理時(shí)，其SOD 活性為59.72 U/mg，之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD 活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)脅迫時(shí)間達(dá)26 h，達(dá)到顯著水平（P<0.05）。此時(shí)其SOD 活性為132.64 U/mg，比未經(jīng)脅迫的對(duì)照增加了72.92 U/mg，SOD 活性提高了122%。

圖4 不同時(shí)間梯度15% PEG 溶液模擬干旱脅迫下三種胡枝子超氧化物歧化酶活性變化Fig.4 Changes of SOD of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

牛枝子在未經(jīng)干旱脅迫處理時(shí)，其SOD 活性為63.11 U/mg，之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD 活性呈先升高后下降的趨勢(shì)。具體表現(xiàn)為：在脅迫時(shí)間6.5 h 至13 h 時(shí)，SOD 活性快速升高，并在脅迫13 h 時(shí)達(dá)到高峰，且與對(duì)照相比差異顯著（P<0.05）。此時(shí)其SOD 活性達(dá)到108.04 U/mg，比對(duì)照增加了44.93 U/mg，SOD 活性提高了72%。

達(dá)烏里胡枝子在未經(jīng)干旱脅迫處理時(shí)，其SOD 活性為67.63 U/mg，之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性也呈先升高后下降的趨勢(shì)。具體表現(xiàn)為：在脅迫時(shí)間6.5 h 至13 h 時(shí)，SOD 緩慢升高，在脅迫19.5 h時(shí)達(dá)到高峰，且與對(duì)照相比差異顯著（P<0.05）。此時(shí)其SOD 活性達(dá)到121.97 U/mg，比對(duì)照增加了54.33 U/mg，SOD 活性提高了80.72%。

3 結(jié)論與討論

相對(duì)含水量與植物的代謝活動(dòng)密切相關(guān)，是用于研究植物抗旱性的重要生理指標(biāo)之一［8］。有研究表明，植物通過(guò)保持較高水平的葉片相對(duì)含水量來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)干旱條件的適應(yīng)［9］。本研究結(jié)果顯示，尖葉胡枝子和牛枝子的幼苗相對(duì)含水量，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與譚莎等［10］在研究3 個(gè)山茶品種受水分脅迫后的相對(duì)含水量變化趨勢(shì)的結(jié)果相一致。本研究中牛枝子在15%PEG 溶液脅迫6.5 h 時(shí)，幼苗相對(duì)含水量便發(fā)生顯著下降（P<0.05），之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)其相對(duì)含水量基本保持穩(wěn)定（P>0.05）；尖葉胡枝子在脅迫19.5 h 時(shí)，其幼苗相對(duì)含水量才發(fā)生顯著下降（P<0.05）；而達(dá)烏里胡枝子幼苗在6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 各個(gè)處理?xiàng)l件下的相對(duì)含水量與其未經(jīng)脅迫的對(duì)照相比差異均不顯著（P>0.05），這一研究結(jié)果與馬彥軍等［11］的PEG 脅迫后牛枝子含水量最多，尖葉胡枝子含水量較少的研究結(jié)果略有不同。本研究結(jié)果表明3 種胡枝子對(duì)PEG 脅迫的生理響應(yīng)不同。

植物細(xì)胞主要是由膜系統(tǒng)組成的多分子動(dòng)態(tài)體系。干旱造成膜結(jié)構(gòu)及其功能傷害的根本是因?yàn)槊撍畬?dǎo)致膜構(gòu)型改變和膜脂過(guò)氧化作用，進(jìn)而降解膜蛋白和使其變性等，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)外滲，引起電導(dǎo)率的上升［12］。本研究中尖葉胡枝子、達(dá)烏里胡枝子和牛枝子的幼苗相對(duì)電導(dǎo)率，均在脅迫6.5 h 時(shí)，出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。其原因可能是15% PEG 溶液短時(shí)間的處理，激發(fā)了其植物體內(nèi)某種防御機(jī)制，減少了細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的外滲。從3 個(gè)品系對(duì)各個(gè)時(shí)間梯度脅迫處理的整體響應(yīng)來(lái)看，存在差異。

丙二醛為膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量可以直接反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，從而間接反映植物的受害程度［13］。在干旱程度嚴(yán)重情況下，活性氧大量積累，引發(fā)細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，從而使細(xì)胞膜受到傷害，導(dǎo)致丙二醛含量上升。本研究中，3 種胡枝子在各個(gè)時(shí)間梯度處理下的丙二醛含量與其未經(jīng)處理的對(duì)照相比，差異均不顯著（P>0.05），表明15% 的PEG 溶液模擬干旱脅迫6.5 h~26 h，尚未對(duì)參試的3 種胡枝子幼苗細(xì)胞膜造成顯著傷害，膜脂過(guò)氧化尚未發(fā)生或者已經(jīng)發(fā)生但程度較輕。

超氧化物歧化酶是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能有效清除活性氧，進(jìn)而保護(hù)膜系統(tǒng)［14］。本研究中15%PEG 溶液模擬干旱脅迫6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 后，3 種胡枝子幼苗的SOD 活性都有不同程度的提高。這一研究結(jié)果與劉承等［15］在玉米抗旱性上的研究結(jié)果相同。不同胡枝子對(duì)各個(gè)脅迫處理的SOD 響應(yīng)不同。尖葉胡枝子在脅迫時(shí)間達(dá)26 h 時(shí)，SOD 活性顯著增加并達(dá)到高峰，為132.64 U/mg，比對(duì)照提高了122%；牛枝子在脅迫13 h 時(shí)達(dá)到高峰，為108.04 U/mg，比對(duì)照提高了72%，與對(duì)照相比差異顯著（P<0.05）；達(dá)烏里胡枝子在脅迫19.5h 時(shí)達(dá)到高峰，為121.97 U/mg，比對(duì)照提高了80.72%，且與對(duì)照相比差異顯著（P<0.05）。

植物的抗旱性是多種因素綜合作用的結(jié)果［15］。因此，某一項(xiàng)生理指標(biāo)難以全面、準(zhǔn)確地反映出其抗旱生理響應(yīng)情況。需要結(jié)合多個(gè)指標(biāo)綜合分析，本研究進(jìn)一步將結(jié)合分子水平的研究，深入探討其抗旱機(jī)制。