榮渝虹，張發(fā)明，楊 娟，李 良，吳 珂，孫仕仙①，鄭 毅1,，7②

(1.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650233；2.西南林業(yè)大學(xué)國家高原濕地研究中心/濕地學(xué)院，云南 昆明 650233；3.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 景洪 666100；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，云南 昆明 650201；5.西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院/環(huán)境修復(fù)與健康研究院，云南 昆明 650233；6.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650201；7.云南開放大學(xué)校長辦公室，云南 昆明 650223)

磺胺類抗生素(sulfanomide drugs, SAs)主要用于預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病，在歐洲是使用量第二大的獸藥抗生素[1]，也是我國生產(chǎn)和使用量最大的獸藥之一[2-3]。國際協(xié)調(diào)委員會規(guī)定的獸藥生態(tài)毒害效應(yīng)觸發(fā)值為100 μg·kg-1[4]，我國養(yǎng)殖場廢水中ρ(SAs)較高時可達142.9 μg·L-1[5]。人體若過量攝入磺胺類藥物，可能導(dǎo)致高膽紅素血癥、腦核性黃疽等疾病[6]。2017年，磺胺甲唑(SMZ)被世界衛(wèi)生組織(WHO)的國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)列為3類致癌物之一?；前粪奏?SDZ)、磺胺喹啉(SQX)等則被列入“飼料藥物添加劑使用規(guī)范”中[7]。

生物修復(fù)包括堆肥、膜生物反應(yīng)器、活性泥污、微生物、人工濕地系統(tǒng)等。植物是人工濕地系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者，能利用根圈阻隔、積累及根際修復(fù)作用降低環(huán)境中的污染風(fēng)險，是目前最具潛力的生物修復(fù)技術(shù)之一[8]。禾本科香根草(Vetiveriazizanioides)因其生長迅速、具有長達3～4 m發(fā)達網(wǎng)狀須根、環(huán)境適應(yīng)能力強、水陸雙棲、對污染物有很強的耐受性等優(yōu)點，在植物修復(fù)方面被廣泛應(yīng)用[9]。

以香根草為修復(fù)植物，以磺胺吡啶(SPY)、SMZ、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)和SQX這4種在環(huán)境中檢出率高且量大的磺胺抗生素為混合目標(biāo)污染物，通過溫室模擬水培試驗，以15 d為試驗周期，選取100 μg·L-1為施藥濃度，研究這4種磺胺抗生素在營養(yǎng)液及香根草不同組織中的殘留濃度動態(tài)，尋找其吸收、去除規(guī)律，為水環(huán)境中磺胺抗生素的植物修復(fù)提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗植物

供試植物香根草購置于江西省紅壤研究所，篩選苗齡半年、株高80 cm、根長60～80 cm、長勢一致的成年植株備用，用1/2濃度霍格蘭改良營養(yǎng)液[10](pH=6.0)作為水培溶液。

1.2 藥品與試劑

4種磺胺抗生素標(biāo)準(zhǔn)品均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。Waters Oasis MCX小柱60 mg/3 mL購于Waters公司。色譜純級的乙酸乙酯、乙腈、甲醇、正己烷、甲酸購于Merck KGaA公司。

1.3 水培試驗設(shè)計

試驗于2020年10月在西南林業(yè)大學(xué)格林溫室大棚內(nèi)進行，培養(yǎng)器皿為棕色小口栽植玻璃瓶，瓶身和瓶口用黑色塑料袋避光包裹。每個培養(yǎng)器皿中均加入4 L 1/2濃度霍格蘭改良營養(yǎng)液和4種SAs混合溶液(ρ均為100 μg·L-1)。分為2組處理：第1組種植香根草，質(zhì)量為(300±0.5) g，第2組不種植物(對照)，每組處理4個重復(fù)。

1.4 樣品采集與分析測定

1.4.1采集方法

向盛有營養(yǎng)液的棕色玻璃瓶中同時放入香根草和SAs，分別于第1、2、3、4、5、6、12、15天采集香根草5 g根組織、5 g葉組織、10 mL水樣。每次取樣前，用質(zhì)量差法補齊由于蒸騰和取樣造成的霍格蘭營養(yǎng)液損失。

1.4.2提取方法

將植物組織用純水洗凈、剪碎，濾去水樣殘渣，參照GB 29694—2013《動物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測定 高效液相色譜法》[11]進行提取和凈化。水樣直接過柱處理，然后用0.22 μm孔徑尼龍濾膜過濾，待高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)測定。

1.4.3計算方法與數(shù)據(jù)分析

溶液與植物組織中SAs的殘留濃度用下式計算:

CP=Ct×V/m。

(1)

式(1)中，CP為溶液或植物組織中SAs的殘留濃度，μg·L-1或μg·kg-1；Ct為某時刻實測的SAs濃度值，μg·L-1或μg·kg-1；V為溶液體積或植物組織質(zhì)量，L或kg；m為取樣體積或質(zhì)量，L或kg。

轉(zhuǎn)移系數(shù)(TF)計算公式為

TF=C莖葉/C根。

(2)

式(2)中，C莖葉和C根分別為香根草莖葉和根中的SAs殘留濃度，μg·kg-1。

溶液中SAs去除率計算公式為

R=(C0-Ct)/C0×100%。

(3)

式(3)中，R為溶液中SAs去除率，%；C0為溶液中SAs初始濃度，μg·L-1；Ct為t時刻溶液中SAs殘留濃度，μg·L-1。

采用WPS 2020和SPSS 26軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素(one-way ANOVA)和Duncan法進行方差分析，Pearson法進行相關(guān)分析，最小顯著差異(LSD)法進行多重比較(P<0.05)。利用Origin 2019軟件作圖。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 測定儀器及參數(shù)

用液相色譜儀(賽默飛世爾 Ulti-Mate 3 000)串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(賽默飛世爾TSQ Endura)進行定量分析。高效液相色譜條件：色譜柱2.1 μm×100 mm×1.9 μm，柱溫 35 ℃，流速 0.2 mL·min-1，進樣量 5 μL。流動相：A為φ=0.05%的甲酸水，B為甲醇(色譜純)，進行梯度洗脫。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(H-ESI)；正離子模式電壓3 000 V；負(fù)離子模式電壓2 500 V；鞘氣壓力35 psi；輔助氣壓力 15 psi；離子源溫度 350 ℃；離子傳輸管溫度 350 ℃；氣化室溫度200 ℃；采用選擇反應(yīng)檢測掃描(SRM)模式采集。

1.6 回收率測定結(jié)果

向植物和水樣品中分別添加10和100 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)混合SAs溶液，每個添加水平4個重復(fù)。香根草莖葉的SAs回收率為80.3%～119.5%，根為78.6%～132.2%，溶液為88.6%～113.6%，該方法準(zhǔn)確度符合試驗要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)液中SAs的殘留動態(tài)

所有處理組中，營養(yǎng)液的SAs濃度從第1天到15天顯著下降(圖1)。第15天時，香根草組的營養(yǎng)液SAs質(zhì)量濃度(32.95～48.05 μg·L-1)顯著低于對照(66.65～70.54 μg·L-1)。

SPY—磺胺吡啶；SMZ——磺胺甲唑；SDM—磺胺二甲氧嘧啶；SQX—磺胺喹啉。

2.1.1營養(yǎng)液中SAs的去除率

相比于對照組，種植香根草顯著提高了營養(yǎng)液中SAs的去除率(P<0.05)(表1)。第6天香根草組的SAs去除率較對照組提高12.3%～21.7%，第15天提高了2倍左右。此時香根草組對SAs的去除率由高到低依次為SMZ>SDM>SPY>SQX，對照組為SMZ>SQX>SPY>SDM，表明無論是否栽種香根草，SMZ的去除率均最高，但香根草顯著提高了SDM的降解水平。

表1 營養(yǎng)液中不同種類磺胺類抗生素(SAs)的去除率

2.1.2營養(yǎng)液中SAs的去除動力學(xué)方程

在所有處理中，SAs在營養(yǎng)液中的降解趨勢符合一級動力學(xué)方程(表2)。種植香根草組的降解速率常數(shù)是對照組的2.0～2.5倍。香根草組的SAs降解半衰期(t0.5)比對照組縮短了12～16 d(表3)，表明種植香根草能顯著促進水體中SAs的降解(P<0.05)。對照組SAs的降解半衰期從大到小依次為SDM>SPY>SQX/SMZ，香根草組為SQX>SPY>SDM>SMZ，表明SDM在營養(yǎng)液中最不易降解，而香根草能較快地去除SDM。

表2 營養(yǎng)液中SAs去除動力學(xué)方程

表3 營養(yǎng)液中不同種類SAs降解速率、半衰期(t0.5)和99%消除時間(t0.99)

2.2 香根草植物體內(nèi)SAs的殘留動態(tài)

香根草根中SAs的含量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(圖2)，根中SAs的殘留總量由高到低依次為SDM(22.97 μg·kg-1)>SQX(19.53 μg·kg-1)>SMZ(15.33 μg·kg-1)>SPY(6.60 μg·kg-1)。

香根草莖葉中SAs的含量呈現(xiàn)波動狀態(tài)(圖2)，莖葉中SAs的殘留總量由高到低依次為SMZ(7.02 μg·kg-1)>SDM(5.82 μg·kg-1)>SPY(4.76 μg·kg-1)>SQX(2.79 μg·kg-1)。

SPY—磺胺吡啶，SMZ—磺胺甲唑，SDM—磺胺二甲氧嘧啶，SQX—磺胺喹啉。

2.3 香根草對不同種類SAs的轉(zhuǎn)移系數(shù)變化

轉(zhuǎn)移系數(shù)是描述和評價植物將化合物從根部向地上部分運輸和富集的能力，轉(zhuǎn)移系數(shù)越大則轉(zhuǎn)運能力越強。前人研究表明，多數(shù)磺胺類抗生素的植物轉(zhuǎn)移系數(shù)小于1[12]，筆者研究結(jié)果與之一致。15 d中SAs在香根草組織中的轉(zhuǎn)移系數(shù)呈現(xiàn)波動趨勢，峰值出現(xiàn)在第4和15天(表4)。

表4 香根草對不同種類SAs的轉(zhuǎn)移系數(shù)

香根草對SAs轉(zhuǎn)運能力從大到小依次為SPY>SMZ>SDM>SQX，到第15天SPY和SDM的轉(zhuǎn)移系數(shù)均大于1，推測此時營養(yǎng)液中SAs的濃度已較低，植物的莖葉一起協(xié)同吸收降解SAs。

2.4 相關(guān)性分析

分析不同種類SAs的處理時間、香根草莖葉和根及營養(yǎng)液中SAs濃度、轉(zhuǎn)移系數(shù)和去除率這幾者的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，處理時間與營養(yǎng)液SAs濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，表明隨著時間延長，營養(yǎng)液中的SAs濃度逐漸降低，去除率逐漸增高。

香根草莖葉和根系中SPY、SDM含量與轉(zhuǎn)移系數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與SQX呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，表明香根草能將根中的SAs向地上部分運輸，且對SPY和SDM的轉(zhuǎn)運能力最強；香根草根中SMZ與SQX含量與營養(yǎng)液濃度、去除率呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，而與轉(zhuǎn)移系數(shù)無顯著相關(guān)，推測香根草根系對SMZ有較好的吸收、去除效果，但向上轉(zhuǎn)運的能力較弱；香根草莖葉與根中SPY含量與轉(zhuǎn)移系數(shù)均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，且轉(zhuǎn)移系數(shù)與營養(yǎng)液中SPY濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，表明香根草對SPY有較好的吸收、轉(zhuǎn)運效果。

3 討論

第15天香根草組對初始質(zhì)量濃度為100 μg·L-1SAs的去除率為52.86%～65.69%、降解常數(shù)為0.055～0.073；對照組去除率為30.0%～32.9%、降解常數(shù)為0.025～0.029。在榮婧[13]的試驗結(jié)果中，風(fēng)車草、鳳眼蓮、水生美人蕉、菖蒲對1 mg·L-1SDZ 21 d的去除率為48.7%～59.8%，降解常數(shù)為0.032～0.039，對照組去除率為45.6%，降解常數(shù)為0.028。表明香根草對SAs的去除效果優(yōu)于其他4種水生植物，這與植物生物量[14]、根系分泌物[15]、植物遷移轉(zhuǎn)化能力[16]及根際微生物環(huán)境[17]等有關(guān)。

香根草根系在前6 d能快速吸收SAs并達到峰值，同時香根草營養(yǎng)液中SAs的降解速率也較快，表明前6 d香根草的主動吸收與溶液中SAs的降解密切相關(guān)。而莖葉在前4 d能快速吸收SAs并達到峰值，根與葉吸收時間的差異與香根草在100 μg·L-1的SAs濃度脅迫下能按正常的新陳代謝速率進行吸收和降解有關(guān)[18]。隨著吸收量的增加，植物組織的損傷逐漸增大，根部的SAs達到儲存極限而啟動防御機制，將SAs滯留和固定在根部，以減少SAs向上運輸對其他器官造成傷害[19]。待儲存的SAs部分被轉(zhuǎn)化、植物機能恢復(fù)后，根部又繼續(xù)吸收營養(yǎng)液中的SAs，根部含量再次達到小峰值。當(dāng)SAs暴露濃度較低時，植物能利用污染物促進自身的代謝和營養(yǎng)供給[20]。營養(yǎng)液中SAs濃度的降低及植物內(nèi)部防御系統(tǒng)的破壞導(dǎo)致吸收和運輸量降低[21]，但隨著脅迫時間的延長，香根草恢復(fù)了對SAs的去除能力[22]。這與SUN等[23]、賈繼維等[24]的研究結(jié)果相似，表明香根草對SAs的吸收呈先上升后下降的波動狀態(tài)。

香根草根部的SAs殘留總量大于莖葉部，這與前人的研究結(jié)果[25]一致。植物吸收轉(zhuǎn)運SAs的方式為主動運輸，在植物組織內(nèi)的SAs的含量排序為根>葉>莖。根系的SAs殘留總量與莖葉SAs的殘留總量比值的排序是SQX(7倍)>SDM(4.0倍)>SMZ(2.2倍)>SPY(1.4倍)，由此可判斷植物對SQX更為敏感，可將SQX固定在根部，盡可能地少向上運輸，導(dǎo)致香根草根部的SQX富集比例較高。在100 μg·L-1的SAs脅迫下，水培香根草莖葉中的SAs殘留增長趨勢與根部積累量在1～9 d(SMZ除外)呈現(xiàn)一致性(圖2)，表明污染初期香根草對SAs具有一定的吸收、轉(zhuǎn)運能力，可將SAs通過轉(zhuǎn)化及蒸騰等作用排出體外；9～15 d莖葉的SAs含量處于穩(wěn)定趨勢，不再隨根部的積累而大幅變化，表明須根系的深根是香根草修復(fù)SAs的主要器官組織，能加快水中污染物的去除，具有較好的潛力[26]。

4 結(jié)論與展望

(1)香根草對100 μg·L-1的SAs具有較好的吸收和去除能力，植物在第6和12天出現(xiàn)2次吸收高峰，香根草溶液中前6 d SAs的降解速率較高。

(2)SAs在營養(yǎng)液中的去除符合一級動力學(xué)方程。相比于對照組，香根草組在營養(yǎng)液中的SAs去除率于培養(yǎng)的第15天提高20.0%～32.8%；SAs的半衰期縮短了12～16 d。

(3)隨著處理時間的延長，營養(yǎng)液中SAs的濃度逐漸降低、去除率逐漸升高。培養(yǎng)1～9 d香根草莖葉中的SAs含量隨著根中SAs含量的增加而增加、轉(zhuǎn)移系數(shù)也隨之增加。

(4)香根草對SDM有較好的去除效果，對SMZ、SQX有較強的根部富集能力，對SPY有較強的轉(zhuǎn)運能力。香根草對SAs具有較好的吸收和去除能力，可作為水體中SAs的優(yōu)勢修復(fù)植物，為抗生素污染修復(fù)的植物篩選提供理論依據(jù)，為濕地公園建設(shè)的生態(tài)功能方向提供一定的指導(dǎo)作用，但更深層次的修復(fù)機理和機制還需進一步深入探索研究。接下來的研究可向環(huán)境中的多種有機污染物[27]或有機污染物與重金屬復(fù)合治理的方向延伸[28-29]，修復(fù)手段可研究微生物與植物互作方向[30]，以挖掘更多的治理方法和有效途徑。

致謝：該研究由西南林業(yè)大學(xué)大型儀器共享平臺、云南省高原濕地保護修復(fù)與生態(tài)服務(wù)重點實驗室、西南林業(yè)大學(xué)環(huán)境污染與食品安全及人體健康省創(chuàng)新團隊提供設(shè)備及研究相關(guān)支持，在此一并表示感謝。