解曉燕，薛婷，張?jiān)祈担瑥埵康?，周洋，賈少迪，喻大華

1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)信息工程學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)理學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010

前言

吸煙是導(dǎo)致全球死亡率增加的主要原因之一，該死亡率是完全可以預(yù)防的，但仍然是全球一個(gè)重大的疾病負(fù)擔(dān)［1］。一項(xiàng)基于學(xué)校的青少年煙草調(diào)查報(bào)告稱，13.6%的青少年使用煙草，55.9%的青少年接觸過二手煙［2］。青春期是大腦發(fā)育成熟的關(guān)鍵時(shí)期，在這個(gè)關(guān)鍵時(shí)期如果長期接觸尼古丁可能會增加尼古丁成癮的風(fēng)險(xiǎn)，并干擾正常的神經(jīng)生物學(xué)過程［3-5］。先前有傳統(tǒng)的靜息態(tài)功能性磁共振成像（fMRI）研究表明，吸煙可以增加或減少大腦某些特定區(qū)域的功能連接［6-8］。最近有研究發(fā)現(xiàn)，大腦在靜息狀態(tài)下的功能連接在掃描采集過程中不是靜態(tài)的，而是不斷動態(tài)變化的［9-11］。動態(tài)功能網(wǎng)絡(luò)連接是對傳統(tǒng)靜息狀態(tài)下大腦功能網(wǎng)絡(luò)連接的擴(kuò)展，用于測量在整個(gè)掃描期間大腦網(wǎng)絡(luò)之間的連接變化。因此，基于網(wǎng)絡(luò)水平上對大腦某些特定區(qū)域進(jìn)行整體性的分析方式能夠更全面地描述吸煙對青少年大腦功能連接的影響。但是目前針對青少年吸煙者的默認(rèn)模式網(wǎng)絡(luò)（DMN）內(nèi)部的動態(tài)功能連接研究是存在空白的。而此次的研究應(yīng)用動態(tài)功能連接分析方法探討青少年吸煙者和非吸煙者在靜息狀態(tài)下大腦DMN 內(nèi)部的功能連接變化，并進(jìn)一步分析動態(tài)功能連接指標(biāo)與吸煙統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究得到內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)。參加本研究的所有年輕的吸煙者和非吸煙者（男性，年齡16～24歲，漢族，大學(xué)本科）都是從內(nèi)蒙古科技大學(xué)通過網(wǎng)絡(luò)或廣告張貼招聘的。所有參與者在完整了解實(shí)驗(yàn)程序后簽署知情同意書。所有的實(shí)驗(yàn)程序都遵循人類醫(yī)學(xué)研究指南（赫爾辛基宣言）。

根據(jù)美國《精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊》第5 版（DSM-V）中尼古丁依賴的診斷標(biāo)準(zhǔn)對年輕的吸煙者進(jìn)行篩查，并根據(jù)尼古丁依賴測試量表（FTND）對年輕吸煙者的尼古丁依賴程度進(jìn)行評估。納入本次研究的年輕吸煙者的具體標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）符合DSM-V對尼古丁依賴診斷的標(biāo)準(zhǔn)；（2）FTND 測試量表得分大于3；（3）沒有飲酒以及吸食任何毒品史或者各種（網(wǎng)絡(luò)游戲、賭博等）成癮史；（4）在過去兩年中每天的吸煙數(shù)量大于或等于10 支，并且在過去一年中沒有戒煙行為或者嘗試戒煙但是不超過3 個(gè)月。年輕非吸煙者的具體標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）一生中吸煙數(shù)量不超過3支；（2）父母和室友都不吸煙（為了避免受到二手煙的影響）。參加本次研究的所有被試都應(yīng)符合以下要求：（1）根據(jù)愛丁堡利手量表測量為慣用右手；（2）沒有任何根據(jù)臨床診斷或醫(yī)療記錄評估的身體疾病（腦腫瘤、阻塞性肺病、肝炎或癲癇等）；（3）沒有任何精神疾病，尿檢中沒有發(fā)現(xiàn)其他藥物濫用（吸煙者的尼古丁除外）；（4）無任何核磁共振掃描禁忌，如顱腦受傷、顱內(nèi)有金屬植入物等大腦結(jié)構(gòu)的異常。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)篩選出30 名青少年吸煙者和30 名青少年非吸煙者參與本次研究，所有被試的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)的信息如表1所示。

表1 青少年被試人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Demographic data of adolescent subjects

1.2 數(shù)據(jù)采集

fMRI數(shù)據(jù)是使用內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院飛利浦3.0T 掃描儀（Achieva，飛利浦，荷蘭）采集的。在磁共振掃描之前，告知被試者要緩慢躺下切勿碰撞頭部等注意事項(xiàng)以及在磁共振掃描過程中可能會出現(xiàn)的身體不適感。在被試者的頭部下方放上泡沫墊以保持舒服的狀態(tài)和最小化因被試亂動引起的頭部運(yùn)動，使用耳塞來降低掃描儀產(chǎn)生的噪音。fMRI 是使用回波平面成像序列獲得的。fMRI 掃描過程中的主要參數(shù)如下：重復(fù)時(shí)間為2 000 ms，回波時(shí)間為30 ms，切片厚度為5 mm，翻轉(zhuǎn)角為90°，視場為220 mm×220 mm，數(shù)據(jù)矩陣為64×64，體素的大小為1 mm3的三維MRI序列，采集的時(shí)間點(diǎn)數(shù)為180 個(gè)。在掃描過程中受試者被告知要保持清醒，閉上眼睛，不要想任何事情。掃描結(jié)束后，所有受試者被問及在整個(gè)掃描過程中是否保持清醒。兩位放射科專家檢查了所有受試者的影像，以排除任何臨床上無癥狀的病變。

1.3 動態(tài)功能連接分析處理方法

fMRI 數(shù)據(jù)的預(yù)處理是使用基于SPM12 軟件包的數(shù)據(jù)處理工具箱Gretna 在Matlab2019 平臺上進(jìn)行的。預(yù)處理的步驟包括頭部運(yùn)動校正、時(shí)間層校正、空間標(biāo)準(zhǔn)化、空間平滑（半高全寬6 mm 的高斯核）和回歸頭部運(yùn)動參數(shù)、腦白質(zhì)信號和腦脊液信號［12］。首先，在Matlab2019 軟件上使用GIFT 工具箱中的組水平空間獨(dú)立成分分析將預(yù)處理后的fMRI數(shù)據(jù)分解為功能網(wǎng)絡(luò)，并且使用一個(gè)相對高階的模型（100 個(gè)獨(dú)立成分）進(jìn)行劃分功能網(wǎng)絡(luò)［13］。在獲取的100個(gè)獨(dú)立成分中，以斯坦福大學(xué)的功能感興趣區(qū)域分析標(biāo)準(zhǔn)模板匹配出本研究感興趣的屬于DMN 的成分。然后，為了更好地理解功能網(wǎng)絡(luò)連接的動態(tài)特性，對所有的被試采用滑動時(shí)間窗口分析方法計(jì)算動態(tài)功能網(wǎng)絡(luò)連接生成所有被試的協(xié)方差矩陣［14］。最后，對生成的協(xié)方差矩陣進(jìn)行k-均值聚類分析，用以檢測特定的功能連接模式，使用肘部法則來確定最佳的聚類數(shù)目，然后計(jì)算受試者的動態(tài)功能連接指標(biāo)［15］。動態(tài)功能連接指標(biāo)包括：（1）時(shí)間分?jǐn)?shù)：受試者屬于某個(gè)狀態(tài)的時(shí)間窗口數(shù)目占總窗口數(shù)目的百分比；（2）平均停留時(shí)間：受試者在某個(gè)狀態(tài)停留的平均時(shí)間長度；（3）轉(zhuǎn)換次數(shù)：受試者從一個(gè)狀態(tài)切換到其它狀態(tài)的總的切換次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

在GIFT 工具箱中使用雙樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)方法對青少年吸煙組和非吸煙組的動態(tài)功能連接進(jìn)行比較，以檢測特定狀態(tài)下DMN 的動態(tài)功能連接差異，統(tǒng)計(jì)性閾值設(shè)置為P<0.05，并用錯誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate,FDR）進(jìn)行校正［16］。兩組動態(tài)功能連接指標(biāo)數(shù)據(jù)用M（Q1,Q3）表示。使用非參數(shù)曼惠特尼U檢驗(yàn)檢測兩組動態(tài)功能連接指標(biāo)的差異［12］，使用斯皮爾曼相關(guān)方法評估有差異的動態(tài)功能連接指標(biāo)與吸煙統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)（煙齡，包年，F(xiàn)TND）的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過組水平空間獨(dú)立成分分析并根據(jù)視覺和解剖等先驗(yàn)知識篩選得到DMN（18,19,26,35和57）的獨(dú)立成分空間分布（圖1）。

圖1 默認(rèn)模式網(wǎng)絡(luò)的獨(dú)立成分空間Figure 1 Spatial distribution of the independent components in the default mode network

運(yùn)用滑動窗相關(guān)法，將滑動窗口的大小設(shè)置為30 TR，步長設(shè)置為1 TR，滑動時(shí)間窗的窗口以1 TR的步長沿著時(shí)間軸滑動。每個(gè)被試的核磁數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理后，數(shù)據(jù)的時(shí)間序列的長度變?yōu)?70 TR，所以每個(gè)被試會生成140 個(gè)時(shí)間窗口，60 個(gè)被試共生成8 400個(gè)時(shí)間窗口。然后通過k-均值聚類方法并且使用肘部法則將動態(tài)功能網(wǎng)絡(luò)連接聚類為4 種功能連接狀態(tài)（圖2）。在8 400 個(gè)時(shí)間窗口中，有1 705 個(gè)時(shí)間窗口屬于狀態(tài)1，占所有時(shí)間窗口的比例為20%；有2 859 個(gè)時(shí)間窗口屬于狀態(tài)2，占所有時(shí)間窗口的比例為34%；有1 223 個(gè)時(shí)間窗口屬于狀態(tài)3，占所有時(shí)間窗口的比例為15%；有2 613 個(gè)時(shí)間窗口屬于狀態(tài)4，占所有時(shí)間窗口的比例為31%。每個(gè)狀態(tài)表示DMN 內(nèi)部具有不同的連接強(qiáng)度，每個(gè)狀態(tài)的聚類質(zhì)心的功能連接模式和強(qiáng)度在圖2的4 個(gè)功能連接矩陣中顯示。

圖2 4個(gè)動態(tài)功能連接狀態(tài)的聚類質(zhì)心Figure 2 Cluster centroids of 4 dynamic functional connectivity states

通過雙樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)檢測出吸煙組和非吸煙組DMN內(nèi)部的動態(tài)功能連接在狀態(tài)2具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。圖3中紅色的矩形表明，統(tǒng)計(jì)顯著性閾值（P<0.05,FDR 校正）。結(jié)果表明，相比于非吸煙者，青少年吸煙者的DMN 內(nèi)部的功能連接性顯著性降低。

圖3 吸煙組和非吸煙組在狀態(tài)2的功能網(wǎng)絡(luò)連接的顯著性差異Figure 3 Significant differences in functional network connectivity in state 2 between smoking group and non-smoking group

曼惠特尼U檢驗(yàn)是一種非參數(shù)檢驗(yàn)方法，如果研究的兩組樣本數(shù)據(jù)之間相互獨(dú)立，但是不符合正態(tài)分布，則可以使用曼惠特尼U檢驗(yàn)方法研究兩組數(shù)據(jù)的差異性，該檢驗(yàn)方法的有效性與t檢驗(yàn)方法相當(dāng)，并且容易計(jì)算檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量［12］。通過驗(yàn)證吸煙組和非吸煙組的動態(tài)功能連接指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，兩組樣本數(shù)據(jù)之間相互獨(dú)立，但是均不符合正態(tài)分布。在數(shù)據(jù)分析軟件SPSS中采用非參數(shù)曼惠特尼U檢驗(yàn)方法檢測兩組動態(tài)功能連接指標(biāo)的差異，結(jié)果如表2所示，青少年吸煙組和非吸煙組的動態(tài)功能連接指標(biāo)中的平均停留時(shí)間在狀態(tài)3存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.038），兩組其它的動態(tài)功能連接指標(biāo)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

表2 吸煙組和非吸煙組的動態(tài)功能連接指標(biāo)的顯著性分析Table 2 Significance analysis of dynamic functional connectivity indices in smoking group and non-smoking group

由斯皮爾曼相關(guān)方法分析表明，在狀態(tài)3 中，吸煙組的平均停留時(shí)間與煙齡呈顯著性正相關(guān)（r=0.389,P=0.034）（圖4），但是與包年、FTND無顯著相關(guān)性。

圖4 吸煙組在狀態(tài)3的平均居留時(shí)間與煙齡的顯著相關(guān)性Figure 4 Significant correlation between the mean dwell time of smoking group in state 3 and smoking duration

3 討論

DMN主要包括內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)、后扣帶回皮質(zhì)、楔前葉等腦區(qū)［17］。該網(wǎng)絡(luò)的腦區(qū)通常在靜息狀態(tài)時(shí)活動水平明顯強(qiáng)于其他腦區(qū)，并表現(xiàn)出自發(fā)性活動增加，但是在執(zhí)行認(rèn)知任務(wù)期間，DMN的活動會受到一定的抑制表現(xiàn)出自發(fā)性活動減少［18］。先前傳統(tǒng)的靜息態(tài)fMRI研究發(fā)現(xiàn)，相比于非吸煙者，吸煙者在靜息態(tài)時(shí)DMN 內(nèi)部的功能連接性降低［19］。除此之外，有研究表明，吸煙者DMN 腦區(qū)的活性降低可能是因?yàn)槟峁哦√岣呋谡J(rèn)知任務(wù)的整體注意力，從而增強(qiáng)任務(wù)表現(xiàn)的一般機(jī)制［20］。最近許多研究發(fā)現(xiàn)處于靜息態(tài)時(shí)的大腦不是一成不變的，而是動態(tài)變化的［21-23］。上述的研究沒有考慮大腦活動的動態(tài)特性，而此次研究運(yùn)用動態(tài)功能連接分析方法（滑動時(shí)間窗口分析方法）探討青少年吸煙者與非吸煙者DMN內(nèi)部的功能連接并且與先前靜息態(tài)fMRI研究得出的結(jié)論一致，得出吸煙者的DMN 內(nèi)部功能連接降低的結(jié)論。

本研究還對吸煙組和非吸煙組的動態(tài)功能連接指標(biāo)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)吸煙者在狀態(tài)3的平均停留時(shí)間較長。相比于其它2 個(gè)狀態(tài)的功能連接強(qiáng)度，狀態(tài)2和狀態(tài)3 顯示出相對弱的連接性。這表明吸煙者在功能連接性弱的狀態(tài)3 的平均時(shí)間長度更長。這與之前的一項(xiàng)研究解釋一致，尼古丁的使用會降低網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部和網(wǎng)絡(luò)之間的功能連接，導(dǎo)致吸煙者會在功能連接性弱的狀態(tài)的停留時(shí)間更長［24］。除此之外，本文還將狀態(tài)3 的平均停留時(shí)間與吸煙統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)（煙齡、包年和FTND）做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)煙齡（吸煙年限）與平均停留時(shí)間呈顯著性正相關(guān)，說明吸煙的年限越長，在功能連接性弱的狀態(tài)3的平均停留時(shí)間越長。這表明動態(tài)功能連接指標(biāo)可以作為研究青少年吸煙成癮者吸煙年限有用的生物標(biāo)志物。

從青春期到成年期正在經(jīng)歷一系列重大的神經(jīng)生物學(xué)變化，處于這個(gè)階段的青少年機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)及器官發(fā)育還不完善［25］。在青少年發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，大腦容易受到尼古丁的影響，極大部分的青少年在嘗試吸煙后難以戒煙，并且有很大的可能成為終生的吸煙者［26］。之前的fMRI 研究是以在靜息態(tài)時(shí)大腦是一成不變的前提下進(jìn)行研究的。本文通過動態(tài)功能連接分析方法，來探討青少年吸煙者和非吸煙者與認(rèn)知控制能力機(jī)制有關(guān)的DMN 內(nèi)的動態(tài)功能連接，研究的結(jié)果進(jìn)一步證明吸煙會導(dǎo)致DMN 功能連接性發(fā)生變化，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明吸煙會導(dǎo)致青少年DMN 的功能連接性降低，并且還發(fā)現(xiàn)煙齡對大腦DMN 的功能連接有直接的影響。青少年吸煙者吸煙的年限越長，對大腦DMN 功能網(wǎng)絡(luò)連接較弱的狀態(tài)的影響就越大，且維持在該狀態(tài)下的平均停留時(shí)間越長。希望本研究可以為青少年吸煙成癮機(jī)制提供新的見解，可以促進(jìn)大家對青少年吸煙成癮機(jī)制更全面的認(rèn)識。