得麗扎爾·熱合曼，卡得了亞·哈依沙爾，王中香，劉丹，李軼杰（新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，新疆 烏魯木齊 830046）

宮頸癌被認(rèn)為是女性中僅次于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌的第四大癌癥[1]。大多數(shù)宮頸癌都由高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）16 和18 型等持續(xù)感染導(dǎo)致[1]。盡管HPV 疫苗現(xiàn)在已在全球范圍內(nèi)用于阻斷HPV 感染，但不能有效治療已感染HPV 的數(shù)百萬患者[2]。過去的20 年中，腫瘤的基因治療備受矚目，并已取得令人振奮的成果。然而，被輸送到體內(nèi)用于基因治療的裸核酸分子常常面臨血管內(nèi)降解、免疫清除、腎濾除、腫瘤組織滲透及吸收困難、內(nèi)涵體逃逸及脫靶等生理和生物屏障[3-4]。因而，抗腫瘤基因治療臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)就是如何提高治療分子在體內(nèi)輸送的效率和腫瘤組織的靶向性。研究[5]表明，某些專性或兼性厭氧菌可以在腫瘤內(nèi)選擇性積聚和增殖，并抑制其生長。一些減毒致病細(xì)菌如志賀氏菌、單核增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌已被用來作為活載體輸送核酸分子到腫瘤組織和細(xì)胞。然而，由于擔(dān)心這些減毒細(xì)菌可能出現(xiàn)回復(fù)突變到致命的表型，其安全性備受質(zhì)疑[6]?；诎踩钥紤]，研究人員開始探索益生菌如食品或共生乳酸菌用于輸送核酸分子到腫瘤組織的可能性[7]。過去10 年中，共生腸道細(xì)菌如短雙歧桿菌，已被用于乳腺癌、結(jié)腸腺癌等體內(nèi)腫瘤的治療[8-9]。本課題組前期工作中已經(jīng)分別證實(shí)了使用瘤內(nèi)或靜脈注射HPV16 E7 shRNA 的重組乳酸乳球菌均能抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長[10]；攜帶IL-12 基因的乳酸乳球菌抗腫瘤效果優(yōu)于原核表達(dá)重組IL-12 的乳酸乳球菌，其中瘤內(nèi)注射途徑抗腫瘤效果優(yōu)于靜脈途徑[11]。為了克服兼性厭氧的乳酸乳球菌能在正常組織內(nèi)存活的風(fēng)險(xiǎn)，本研究將通過口服輸送厭氧的重組短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve,B.breve）聯(lián)合RNAi 和細(xì)胞因子療法在小鼠體內(nèi)抑制HPV16相關(guān)腫瘤的方法，通過對(duì)小鼠體內(nèi)的腫瘤生長趨勢、正常組織和血清中短雙歧桿菌的數(shù)量和主要器官組織H-E 染色切片的分析，探討短雙歧桿菌作為腫瘤基因治療載體的可行性和應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)，為宮頸癌的基因治療提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

pMG36e-E7 shRNA[10]和pMG36e-mIL-12D[11]質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。短雙歧桿菌（B.breveCICC 6184）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，含有HPV16 型E6/E7 基因的小鼠肺上皮TC-1 腫瘤細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存。6～8周齡、雌性C57BL/6小鼠[SYXK（新）2016-0002]購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。改良型RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青/鏈霉素和0.25%胰蛋白酶（1×）溶液均購自HyClone 公司，IFN-γ、IL-12 酶聯(lián)免疫試劑盒購自武漢博士德公司，HPV16 E7 鼠單抗購自Santa Cruz 公司，IL-12 兔單抗購自BD 公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。其他實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 短雙歧桿菌的電轉(zhuǎn)化

將在200 mL PYG 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的短雙歧桿菌，按1∶25 接種到含0.5 mol/L 蔗糖的新鮮PYG培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至D值達(dá)0.3～0.6；菌體用無菌去離子水洗滌2 次，50 mmol/L EDTA 洗滌1 次，無菌去離子水洗滌3 次，最后重懸于去離子水配置的含0.5 mol/L蔗糖和10%甘油的溶液中，分裝成100 μL/管。將0.5 μg pMG36e-E7 shRNA[10]及pMG36e-mIL-12D質(zhì)粒與80 μL細(xì)菌液混勻，加入預(yù)冷的電穿孔比色杯（1 mm 間隙）中。使用Bio-Rad PulserⅡ電轉(zhuǎn)儀，以1.25 kV、25 μF、200 Ω、5.0 ms 條件電轉(zhuǎn)后，加入900 μL PYG培養(yǎng)基重懸細(xì)菌，再轉(zhuǎn)到Eppendorf離心管中放置于37 ℃培養(yǎng)箱中，在厭氧條件下培養(yǎng)3 h。取200 μL 菌液涂布在含10 μg/mL 紅霉素的PYG 瓊脂培養(yǎng)基上，并在37 ℃、厭氧條件下溫育36～48 h后，挑取單菌落篩選鑒定。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測短雙歧桿菌對(duì)骨髓細(xì)胞活性的影響

將采用注射器沖擊法分離的C57BL/6 小鼠骨髓細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中制備成單細(xì)胞懸液，再按感染復(fù)數(shù)（短雙歧桿菌∶每個(gè)骨髓細(xì)胞）分別為10∶1、100∶1 和1 000∶1 加入短雙歧桿菌并混勻，對(duì)照組骨髓細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入相同體積的PBS，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞活性檢測參考Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，采用100 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每個(gè)樣加入2.5 μL AnnenxinⅤ-FITC 和2.5 μL PI 染液，室溫、避光染色25 min，加150 μL 結(jié)合緩沖液，銅網(wǎng)過濾，F(xiàn)ACS Calibur 流式細(xì)胞儀檢測短雙歧桿菌對(duì)細(xì)胞活性的影響。

1.4 重組短雙歧桿菌感染TC-1細(xì)胞及其鑒定

將培養(yǎng)好的TC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)入35 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至細(xì)胞總數(shù)約1×106個(gè)，實(shí)驗(yàn)分為E7 干擾重組短雙歧桿菌（B-E7R）組和IL-12 治療重組短雙歧桿菌（B-IL-12）組，各組按TC-1 細(xì)胞∶重組短雙歧桿菌=1∶1 000的比例分別加入預(yù)先用100 μg/mL氨芐青霉素處理1 h的含pMG36e-E7 shRNA 或pMG36e-mIL-12D重組短雙歧桿菌的PBS 懸液，37 ℃培養(yǎng)3 h 后，用滅菌PBS徹底洗去未進(jìn)入細(xì)胞的重組短雙歧桿菌。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后離心、收集細(xì)胞，加入300μL的細(xì)胞裂解液冰浴30 min 后，將不同處理的細(xì)胞裂解液經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以3 g/L脫脂奶粉溶液封閉2 h。分別以1∶2 000 稀釋倍數(shù)加鼠抗HPV16 E7或兔抗IL-12，室溫處理2 h、后用PBS洗3次），加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記兔抗鼠/羊抗兔IgG，室溫處理1 h后PBS洗滌3次，最后加底物DAB 顯色并拍照。以β-actin 作為內(nèi)參，用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.5 小鼠TC-1細(xì)胞移植瘤模型的建立與治療處理

于8～10 周齡、雌性C57BL/6 小鼠右后背部皮下接種1×105個(gè)TC-1 細(xì)胞。當(dāng)皮下移植瘤可觸及時(shí)（腫瘤直徑2～4 mm），隨機(jī)分為對(duì)照組、B-E7R 組、B-IL-12 組、B-E7R-IL-12 組和短以歧桿功（Bif）組5組，每組8只，各組之間的平均腫瘤大小沒有顯著差異。按文獻(xiàn)[7]方法，收集1×109個(gè)活的重組短雙歧桿菌，洗滌3次，重懸于200 μL PBS后，通過灌胃送入小鼠胃部。在重組短雙歧桿菌口服后的第1、3和7天，每組各取3 只小鼠安樂死，將主要器官解剖取出、稱重后，以1 g 器官組織對(duì)應(yīng)1 mL PBS，加入9 份含0.1%吐溫-20的PBS后，用組織勻漿器勻漿。然后取200 μL 不同稀釋倍數(shù)（1∶10 和1∶100）勻漿液置于紅霉素抗性PYG固體培養(yǎng)基上。取部分器官組織制備石蠟切片進(jìn)行H-E染色。

腫瘤生長抑制檢測中，荷瘤小鼠連續(xù)3 d分別口服200 μL PBS或懸浮在PBS中的1×109個(gè)活短雙歧桿菌（Bif組）、干擾治療重組短雙歧桿菌（B-E7R組）、IL-12治療重組短雙歧桿菌（B-IL-12組）或聯(lián)合治療重組短雙歧桿菌（B-E7R-IL-12組），1周后重復(fù)治療1次。小鼠注射腫瘤細(xì)胞后，每隔1 d記錄體質(zhì)量變化，以后每3～4 d觀察并記錄腫瘤的生長情況，當(dāng)腫瘤直徑≥18 mm時(shí)對(duì)小鼠實(shí)施安樂死。所有動(dòng)物研究均按照新疆大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定進(jìn)行。腫瘤體積計(jì)算方法：腫瘤體積（mm3）=（長徑×短徑2）／2。

1.6 ELISA法檢測荷瘤小鼠血清中IL-12和IFN-γ水平

首次短雙歧桿菌口服治療后第3天，用毛細(xì)吸管眼靜脈采血法收集荷瘤小鼠血液并分離血清。血清IL-12和IFN-γ水平用ELISA法檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Prism 8 軟件分析數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)都獨(dú)立重復(fù)3次。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 短雙歧桿菌不影響小鼠骨髓細(xì)胞的活性

短雙歧桿菌與小鼠骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果如圖1所示，在感染復(fù)數(shù)為10∶1、100∶1 和1 000∶1 時(shí)，短雙歧桿菌均沒有對(duì)骨髓細(xì)胞的凋亡和壞死水平造成顯著影響（均P＞0.05）。TC-1腫瘤細(xì)胞與短雙歧桿菌共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也觀察到相似的結(jié)果，表明短雙歧桿菌及其代謝產(chǎn)物不影響腫瘤細(xì)胞的活性。

圖1 短雙歧桿菌對(duì)骨髓細(xì)胞活性沒有顯著影響

2.2 感染重組短雙歧桿菌對(duì)TC-1 細(xì)胞E7 和IL-12表達(dá)的影響

WB 法檢測結(jié)果（圖2）顯示，與B-IL-12 組相比，B-E7R組TC-1細(xì)胞表達(dá)的E7蛋白水平明顯降低（P＜0.01）；B-IL-12 組TC-1 細(xì)胞中有較弱的特異性IL-12的表達(dá)，而B-E7R組的TC-1細(xì)胞則沒有IL-12的表達(dá)（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，氨芐青霉素處理的重組短雙歧桿菌能夠介導(dǎo)攜帶的DNA 進(jìn)入TC-1 細(xì)胞且影響后者E7和IL-2的表達(dá)。

圖2 重組短雙歧桿菌感染對(duì)TC-1細(xì)胞中E7和IL-12表達(dá)的影響

2.3 重組短雙歧桿菌經(jīng)灌胃后可特異性地靶向腫瘤組織

灌胃后1 d，在荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、腎、移植瘤勻漿液和血清中均檢測到短雙歧桿菌的生長（圖3A）。7 d 后，只在血清和腫瘤勻漿中可見（圖3B）。這些結(jié)果表明，重組短雙歧桿菌具有體內(nèi)靶向腫瘤組織的能力，但血液中會(huì)維持少量的菌體存在。

圖3 口服重組短雙歧桿菌1 d（A）和7 d（B）后不同器官勻漿液培養(yǎng)的結(jié)果

2.4 重組短雙歧桿菌能明顯抑制移植瘤的生長

荷瘤小鼠在注射TC-1 細(xì)胞22 d后，PBS對(duì)照組的小鼠先后因腫瘤直徑≥18 mm 實(shí)施安樂死，同時(shí)，B-E7R 組[（491.8±320）mm3]、B-IL12 組[（429±198）mm3]和B-E7R-IL-12 組[（360±324）mm3]小鼠腫瘤體積均極顯著低于PBS 對(duì)照組[（1 121±246）mm3]（均P＜0.01），且顯著低于短雙歧桿菌組[（890±273）mm3]（均P＜0.05），見圖4A，而各組小鼠體質(zhì)量沒有顯著差異（圖4B）。該結(jié)果表明，攜帶治療性分子E7 shRNA 和IL-12 的重組短雙歧桿菌能夠顯著抑制小鼠移植瘤的生長，聯(lián)合使用抑制效果優(yōu)于單獨(dú)使用，但差異不顯著。

圖4 重組短雙歧桿菌治療后移植瘤體積（A）和荷瘤小鼠體質(zhì)量（B）的變化

2.5 口服重組短雙歧桿菌后荷瘤小鼠主要器官組織無損傷

口服重組短雙歧桿菌7 d后的主要器官組織H-E染色結(jié)果（圖5）顯示，與PBS 組處理相比，重組短雙歧桿菌組小鼠主要器官組織并未發(fā)生明顯的改變，也未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性膿腫病灶。該結(jié)果表明，口服重組短雙歧桿菌未對(duì)主要器官組織產(chǎn)生損傷。

圖5 荷瘤小鼠口服重組短雙歧桿菌7 d后主要器官組織切片的H-E染色結(jié)果（標(biāo)尺：100 μm）

2.6 重組短雙歧桿菌不影響荷瘤小鼠血清中IL-12與IFN-γ的表達(dá)水平

ELISA檢測結(jié)果（圖6）顯示，各組荷瘤小鼠血清中IL-12 與IFN-γ 的含量均無顯著差異，該結(jié)果說明攜帶治療基因的重組短雙歧桿菌治療不會(huì)影響荷瘤小鼠體內(nèi)這些分子的表達(dá)水平。

圖6 重組短雙歧桿菌治療不影響荷瘤小鼠血清中IL-12和IFN-γ水平

3 討論

RNAi 可應(yīng)用于癌癥治療的任何階段，甚至是最難治療的Ⅳ期癌癥[12]，因而在傳染性疾病和惡性腫瘤的治療上展現(xiàn)出無窮潛力。目前RNAi 治療臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)就是如何提高RNAi 治療分子體內(nèi)輸送效率和靶向性[13]。此外，IL-12 通過激活T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ 介導(dǎo)的抗腫瘤活性，長期以來被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤免疫治療方法，但直接應(yīng)用IL-12 會(huì)導(dǎo)致發(fā)生全身不良反應(yīng)，甚至危及生命。因而，最大限度地向腫瘤微環(huán)境輸送IL-12，同時(shí)盡量減少全身暴露的給藥系統(tǒng)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[14]。采用細(xì)菌作為腫瘤靶向的基因治療輸送載體可以很好地解決RNAi 和細(xì)胞因子療法的腫瘤靶向輸送問題。與其他藥物輸送方法相比，細(xì)菌靶向腫瘤的效率不受腫瘤“基因組成”的影響。而作為微觀的“機(jī)器人工廠”，細(xì)菌載體還可以根據(jù)臨床需要按照遺傳法則和生物合成機(jī)制生產(chǎn)和靶向腫瘤組織輸送分子抗癌藥物。作為藥物的分子既可用于單獨(dú)治療，也可輔助其他抗癌療法，以獲得更好的臨床效果[15]。本研究前期采用兼性厭氧乳酸乳球菌作為基因治療的輸送載體分別測試了在小鼠瘤內(nèi)、尾靜脈和鼻腔黏膜輸送shRNA 或重組IL-12 抗實(shí)體腫瘤的效果，結(jié)果顯示，瘤內(nèi)途徑好于靜脈，靜脈輸送途徑優(yōu)于鼻黏膜途徑[10-11]。鑒于瘤內(nèi)途徑不便于臨床操作，靜脈輸送存在菌血癥風(fēng)險(xiǎn)，因而攜帶治療性分子的重組菌通過口服輸送是否同樣具有腫瘤靶向性和抗腫瘤活性是本研究的目的之一。

相比兼性厭氧的乳酸乳球菌，絕對(duì)厭氧菌的雙歧桿菌靶向腫瘤厭氧區(qū)定殖的能力更專一，對(duì)正常組織的影響更小，且雙歧桿菌在腫瘤微環(huán)境中的累積還能促進(jìn)抗CD47機(jī)制，抑制腫瘤生長[9]；一些雙歧桿菌菌株已在日本用作處方藥[15]。研究[7-8,15-16]表明，靜脈輸送的雙歧桿細(xì)菌在24～96 h 內(nèi)在小鼠肝、腎、脾、肺、血液和骨髓等非惡性組織中完全消失，而僅在腫瘤組織中生長，但口服輸送的短雙歧桿菌在組織內(nèi)會(huì)駐留5周以上[17]。本研究證實(shí)，口服7 d后，短雙歧桿菌能特異性地分布在小鼠移植瘤組織中，但與PBS組相比抑制腫瘤生長并無顯著效果。實(shí)驗(yàn)中攜帶HPV16 E7 shRNA 的重組短雙歧桿菌和攜帶IL-12 真核表達(dá)框的重組短雙歧桿菌均顯著抑制了荷瘤小鼠宮頸癌細(xì)胞TC-1 移植瘤的生長，而沒有產(chǎn)生體質(zhì)量減輕和主要器官損害等副作用。在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，攜帶IL-12 DNA的乳酸乳球菌經(jīng)鼻黏膜或靜脈輸送后誘導(dǎo)血清中IL-12 和IFN-γ 升高[11]。本研究中口服攜帶IL-12 基因的短雙歧桿菌的小鼠血清中并未檢測到IL-12 與IFN-γ 的表達(dá)升高，這可能與口服的短雙歧桿菌未用氨芐青霉素弱化細(xì)胞壁，導(dǎo)致治療性DNA分子進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞效率較弱[10-11]，或者與pMG36e 載體在短雙歧桿菌體內(nèi)拷貝數(shù)較低有關(guān)，這也在一定程度上消除了IL-12過量表達(dá)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的副作用。雖然雙歧桿菌等益生菌可保護(hù)和重建腸道的屏障功能抑制致病菌體內(nèi)的易位[18]，但本研究顯示，口服輸送短雙歧桿菌7 d后血清中仍能檢測到短雙歧桿菌的存在，這可能與短雙歧桿菌等益生菌能抑制病原菌易位，但并不影響自身易位的特性有關(guān)[17]。雖然雙歧桿菌對(duì)宿主不利的報(bào)道很少[18]，這可能與負(fù)面結(jié)果很難發(fā)表有關(guān)[19]。本研究中，口服重組短雙歧桿菌7 d 后主要器官組織病理切片未見異常，表明該治療方案相對(duì)安全；但血清中存在的少量短雙歧桿菌提示對(duì)免疫低下的人群使用短雙歧桿菌等益生菌作為功能食品或基因治療的載體時(shí)，仍需關(guān)注可能存在的風(fēng)險(xiǎn)[20]，即使這種風(fēng)險(xiǎn)可用青霉素輕易除去[21]。

綜上所述，本研究通過口服輸送攜帶shRNA 和IL-12 DNA 的重組短雙歧桿菌到荷宮頸癌移植瘤小鼠體內(nèi)，能夠靶向腫瘤組織并顯著抑制移植瘤的生長，雖然口服后一段時(shí)間內(nèi)血清中存在易位的短雙歧桿菌，但未見對(duì)主要器官組織造成明顯的損傷，也不影響小鼠骨髓細(xì)胞的活性。