姜 萱， 楊 瑤, 徐秀麗， 晁仲昊， 張石群， 程 陽， 鄒孝強(qiáng)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

二十二碳六烯酸(DHA)是大腦組織中常見的ω-3長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)，有多種藥理與生理功能[1-6]。DHA是大腦生長和維持功能所必需的脂肪酸，對嬰幼兒的神經(jīng)、視力、大腦發(fā)育有著重要意義，但是嬰兒內(nèi)源性合成DHA不能滿足自身生長發(fā)育需求，故需通過飲食補(bǔ)充DHA[7-8]。嬰兒的消化系統(tǒng)發(fā)育不完善，其胃脂肪酶的水平雖然與成年人相似，但胰脂肪酶和膽鹽的含量分別僅為成年人的5%～10%和50%，所以嬰兒的每日脂肪攝入量雖然是成年人的3～5倍，但其消化能力有限，吸收率顯著低于成人[7-8]。因此，提高DHA在嬰兒體內(nèi)的生物利用度非常重要。

中長中(MLM)型結(jié)構(gòu)脂是最典型的中長鏈結(jié)構(gòu)脂(MLSL)，即中鏈脂肪酸(MCFA)位于sn-1,3位，而長鏈脂肪酸(LCFA)位于sn-2位。人體內(nèi)的胃脂肪酶和胰脂肪酶特異性作用于sn-1,3位，同時(shí)由于MCFA有良好的水溶性，在sn-1,3位的MCFA與LCFA相比更容易被水解，并經(jīng)門靜脈吸收后快速供能[9]；水解產(chǎn)生的sn-2位的單甘酯(MAG)富含LCFA，可通過腸壁快速吸收。因此，MLM型結(jié)構(gòu)脂被認(rèn)為是功能性脂肪酸的理想載體[10-11]。

有研究以商業(yè)真菌發(fā)酵的微生物油為原料，通過酶促酯交換及酸解反應(yīng)，制備了富含PUFA的MLSL[12-15]。許多研究為提高反應(yīng)速率選擇反應(yīng)溫度40～60℃，在長時(shí)間的保溫反應(yīng)過程中PUFA較易發(fā)生氧化，喪失生物活性。同時(shí)，酶促酯交換反應(yīng)的體系中不僅包含MLM型結(jié)構(gòu)脂，還包含其他類型的MLSL及未反應(yīng)的底物，MLM型結(jié)構(gòu)脂分離困難；而酶促酸解反應(yīng)中，sn-1,3位特異性脂肪酶對PUFA的活性較低，最終的產(chǎn)品中較多MLSL含有2個(gè)LCFA分子。因此，酯交換和酸解法難以獲得高純度的MLM型結(jié)構(gòu)脂 。本研究在25℃下采用兩步酶法制備富含MLM型結(jié)構(gòu)脂的產(chǎn)品，減少了DHA在反應(yīng)過程中的氧化，同時(shí)有效提高了產(chǎn)品中MLM型結(jié)構(gòu)脂的含量。

本研究首先制備sn-2位富含DHA的MAG，隨后通過脂肪酶催化其與癸酸(CA)的酯化反應(yīng)獲得MLM型MLSL。對酯化反應(yīng)的除水方式，脂肪酶種類及添加量，底物摩爾比及反應(yīng)時(shí)間對甘油酯組成的影響進(jìn)行了考察，并對最終產(chǎn)物的組成進(jìn)行了分析，以期為富含DHA的中長鏈結(jié)構(gòu)脂的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DHA藻油(來源于裂殖壺藻)，廈門匯盛生物有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme RM IM(來源于Rhizomucormiehei)、Lipozyme 435(來源于Candidaantarctica)、Lipozyme TL IM(來源于Thermomyceslanuginosus)、Novozym 40086(來源于Aspergillusoryzae)，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；無水乙醇(純度≥99.5%)，上海麥克林生化科技有限公司；癸酸(純度99%)，北京百靈威科技有限公司；正己烷、異丙醇，色譜純，百靈威科技有限公司；2,7-二氯熒光素、正己烷、乙腈、乙酸、氯仿，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4 ?分子篩，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；薄層色譜硅膠板(20 cm×20 cm，10 cm×20 cm)，乳山市太陽干燥劑有限公司；三油酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、二油酸甘油酯混標(biāo)(其中1,3-二油酸甘油酯含量為85%、1,2-二油酸甘油酯含量為15%)、2-油酸甘油酯(純度≥95%)、1-油酸甘油酯(純度≥99%)、37種脂肪酸甲酯混標(biāo)，Sigma-Aldrich上海有限公司；DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液(9.99 mg/mL)，Supelco公司。

夾層反應(yīng)釜；低溫恒溫槽；SHZ-3型循環(huán)水多用真空泵；Agilent 7820A氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀、Waters Acquity UPLC、Waters Xevo G2-S Q-TOF 質(zhì)譜儀，美國Waters科技有限公司；Alltech 3300蒸發(fā)光檢測器，美國Grace公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MAG的制備

參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行MAG的制備。為了減少2-MAG發(fā)生酰基遷移，并防止PUFA氧化，DHA藻油的酶促醇解在25℃下進(jìn)行。將DHA藻油和無水乙醇按照質(zhì)量比1∶3混合，置于25 mL夾層反應(yīng)釜中，添加10% Lipozyme 435，在350 r/min磁力攪拌下反應(yīng)6 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去體系中的乙醇，得粗產(chǎn)物。再采用溶劑進(jìn)行萃取，具體為：取1 mL粗產(chǎn)物溶解在9 mL 95%乙腈中，用9 mL正己烷洗滌乙腈體系3次；取乙腈相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后，溶于10 mL氯仿中，然后與10%乙醇溶液充分混合，分離后收集氯仿層，并用10 mL氯仿洗滌水相2次，合并氯仿層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，得到MAG。

1.2.2 sn-2位富含DHA的中長鏈結(jié)構(gòu)脂的制備

將1.2.1制備的MAG與CA以一定的摩爾比混合，添加一定量的脂肪酶，在25℃、350 r/min磁力攪拌、除水條件下進(jìn)行反應(yīng)，每隔一定時(shí)間取樣，分析反應(yīng)產(chǎn)物的甘油酯組成。

1.2.3 甘油酯組成分析

利用配有LiChrospher Si柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)的高效液相色譜(HPLC)和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)對中長鏈結(jié)構(gòu)脂的甘油酯組成進(jìn)行分析。HPLC條件：柱溫30℃；ELSD溫度55℃；流動(dòng)相A為正己烷-異丙醇(體積比99∶1)，流動(dòng)相B為異丙醇-正己烷-乙酸(體積比1∶1∶0.01)，流速為1.0 mL/min；梯度洗脫程序?yàn)榱鲃?dòng)相A在10 min內(nèi)由100%線性降至80%，在10～14 min降至70%，隨后在1 min內(nèi)升至100%并保持5 min，總運(yùn)行時(shí)間為20 min。采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量。

1.2.4 甘油三酯(TAG)脂肪酸組成分析

取50 μL待測樣品，采用薄層層析(TLC)將樣品中的TAG分離，展開劑為正己烷-乙醚-乙酸(體積比80∶20∶1)[17]。在硅膠板上均勻噴灑0.2% 2,7-二氯熒光素乙醇溶液，在紫外光下顯色，刮下對應(yīng)TAG的條帶，加入500 μL 2 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，充分旋渦振蕩后，用2 mL正己烷萃取脂肪酸甲酯2次，經(jīng)無水硫酸鈉柱干燥、氮?dú)鉂饪s后，進(jìn)行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：SP-TM-380毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm×0.2 μm)；色譜柱升溫程序?yàn)橄仍?00℃下保持4 min，然后以15℃/min的速率升溫到180℃并保持4 min，最后以4℃/min的速率升溫至215℃；進(jìn)樣口溫度和火焰離子化檢測器溫度均為250℃；載氣為氮?dú)?，流速? mL/min；分流比100∶1。

通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行定性，通過峰面積歸一化法進(jìn)行定量。

1.2.5 sn-2位脂肪酸組成分析

將30 mg樣品溶解于10 mL乙醚中，添加0.3 mL烯丙基溴化鎂，劇烈攪拌1 min后，加入8 mL酸緩沖液(含0.27 mol/L HCl和0.4 mol/L硼酸)停止反應(yīng)。除去水相，將乙醚萃取液用硼酸洗滌2次，并用無水硫酸鈉干燥。采用氮?dú)鈱⒁颐严嗾舭l(fā)至150 μL，用氯仿-丙酮(體積比90∶10)為展開劑，在硼酸浸漬的TLC板上分離。將sn-2 MAG條帶刮下，并用2 mL乙醚萃取2次，用無水硫酸鈉干燥、氮?dú)鉂饪s后進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，采用氣相色譜分析脂肪酸組成[18]。

1.2.6 酯化反應(yīng)產(chǎn)物中TAG的純化

參考Hita等[19]的方法對1.2.2得到的酯化反應(yīng)產(chǎn)物中TAG進(jìn)行分離純化。將5.0 g酯化反應(yīng)產(chǎn)物溶于125 mL正己烷，加入75 mL 0.8 mol/L KOH溶液(30%乙醇配制)，充分混合，游離脂肪酸及其鉀鹽溶于水相，TAG溶于有機(jī)相；兩相分離后，用10 mL正己烷洗滌水相2次；合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到純化的TAG。

1.2.7 TAG構(gòu)型分析

將1.2.6所得純化的TAG用色譜純正己烷配制成質(zhì)量濃度為 0.5 mg/mL的溶液,進(jìn)配備BEH C18 柱(2.1 mm×50 mm×1.9 μm)和四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)分析甘油三酯的構(gòu)型。UPLC條件：進(jìn)樣量1.0 μL;柱溫45℃；流動(dòng)相 A為乙腈-異丙醇(體積比1∶9)，流動(dòng)相 B為40%乙腈溶液，流動(dòng)相中均加入10 mmol/L的乙酸銨;梯度洗脫程序?yàn)榱鲃?dòng)相A在0～1 min為70%，在1～30 min由70%線性升至87%，保持1 min，在31～32 min由87%線性降至70%，保持4 min;流速300 μL/min。MS條件：ESI 正離子模式；毛細(xì)管電壓3.5 kV，錐孔電壓30 V；離子源溫度100℃；碰撞氣體為氬氣，流速50 L/h；脫溶劑溫度400℃；去溶劑化氣體為氮?dú)?，流?00 L/h；質(zhì)量掃描范圍(m/z)200～1 500。根據(jù)質(zhì)譜信息對TAG構(gòu)型進(jìn)行準(zhǔn)確定性，采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有樣品測定均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)由Microsoft Excel 2010和Origin 8.5軟件計(jì)算得出，并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用SAS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)。顯著性水平為α=0.05，在p<0.05 時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 MAG的甘油酯組成

DHA藻油經(jīng)過醇解及溶劑萃取后，得到的MAG的甘油酯組成如圖1所示。由圖1可以看出，MAG中2-MAG含量為80.21%。

圖1 MAG的甘油酯組成

2.2 M-DHA-M型MLSL制備的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 除水方式對酯化反應(yīng)的影響

在MAG與CA的酯化反應(yīng)中，及時(shí)從反應(yīng)體系中除去副產(chǎn)物水，將大大提高產(chǎn)品中TAG的產(chǎn)率。在MAG與CA摩爾比1∶3、Lipozyme TL IM添加量為底物質(zhì)量的10%、反應(yīng)溫度25℃條件下，考察不同除水方式對反應(yīng)體系中TAG含量的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，常壓下的反應(yīng)體系反應(yīng)24 h后，TAG含量均顯著高于10 h時(shí)的，說明在10 h時(shí)酯化反應(yīng)尚未達(dá)到平衡。在常壓下，選用棍形分子篩+正己烷體系的TAG含量較高，反應(yīng)24 h時(shí)TAG含量達(dá)到82.75%；而選用球形分子篩的反應(yīng)中，在正己烷體系和無溶劑體系下反應(yīng)24 h后，TAG含量分別達(dá)到75.04%和63.34%。在真空度0.05 MPa下的反應(yīng)體系在5 h內(nèi)TAG含量急劇上升，7 h后接近平衡，反應(yīng)9 h時(shí)TAG含量達(dá)到97.48%,遠(yuǎn)高于其他3種除水方式的。有研究表明，正己烷作為溶劑會(huì)導(dǎo)致?；w移率上升[20]；而真空環(huán)境下，TAG積累速率更高，平衡條件下TAG含量更高，說明真空除水效率高，與文獻(xiàn)[16]結(jié)果相符,且真空除水避免了溶劑對?；w移的影響。因此，選擇0.05 MPa真空作為除水的最佳方法。

注：正己烷體系(正己烷體積為底物質(zhì)量的4倍);球形分子篩和棍形分子篩添加量均為200 mg；分子篩在馬弗爐中500℃下活化4 h

2.2.2 脂肪酶種類對酯化反應(yīng)的影響

本研究采用固定化脂肪酶催化MAG與CA的酯化反應(yīng)。Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM及Novozym 40086為特異性催化sn-1,3位的固定化脂肪酶，為了提高TAG的生產(chǎn)效率，比較了3種脂肪酶在酯化反應(yīng)中的催化能力。在MAG與CA摩爾比1∶3、脂肪酶添加量為底物質(zhì)量的10%、反應(yīng)溫度25℃、真空度0.05 MPa條件下，考察脂肪酶種類對反應(yīng)體系中TAG含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 脂肪酶種類對酯化反應(yīng)體系中TAG含量的影響

由圖3可以看出，使用不同種類的脂肪酶不會(huì)改變反應(yīng)的平衡狀態(tài)，但會(huì)影響反應(yīng)效率，從而影響反應(yīng)平衡所需時(shí)間。Lipozyme TL IM在反應(yīng)5 h內(nèi)表現(xiàn)出最強(qiáng)的催化活力，反應(yīng)5 h時(shí)反應(yīng)體系中TAG含量達(dá)到93.57%，而反應(yīng)7 h時(shí)，Novozym 40086、Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM催化的反應(yīng)體系中的TAG含量均接近96.50%。Lipozyme TL IM的價(jià)格相對其他2種脂肪酶更低。綜合考慮經(jīng)濟(jì)性及催化性能，選擇Lipozyme TL IM作為酯化反應(yīng)的催化劑。

2.2.3 MAG與CA摩爾比對酯化反應(yīng)的影響

在可逆反應(yīng)中，底物摩爾比是影響反應(yīng)平衡狀態(tài)的重要因素，同時(shí)影響反應(yīng)效率。在Lipozyme TL IM添加量為底物質(zhì)量的10%、反應(yīng)溫度25℃、真空度0.05 MPa條件下，考察MAG與CA摩爾比對反應(yīng)體系中TAG含量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 MAG與CA摩爾比對酯化反應(yīng)體系中TAG含量的影響

由圖4可以看出，反應(yīng)9 h時(shí)，MAG與CA摩爾比為1∶2的反應(yīng)體系中TAG含量為92.05%，而MAG與CA摩爾比為1∶3、1∶4及1∶5的反應(yīng)體系中TAG含量均高于97%。隨著MAG與CA摩爾比從1∶2增加到1∶3，酯化反應(yīng)速率和平衡狀態(tài)下TAG含量均有顯著提升；MAG與CA摩爾比從1∶3增加到1∶5，反應(yīng)速率和TAG含量提高幅度較小，表明CA足量時(shí)，其含量提升對反應(yīng)速率及平衡狀態(tài)的影響較小。但是CA的增加會(huì)導(dǎo)致體系中脂肪酸含量顯著增加，促進(jìn)氧化，且過量的脂肪酸會(huì)增加脫酸的成本，因此應(yīng)選擇脂肪酸含量更低的MAG與CA摩爾比[21]。綜合考慮，選擇MAG與CA摩爾比1∶3。

2.2.4 Lipozyme TL IM添加量對酯化反應(yīng)的影響

在MAG與CA摩爾比1∶3、反應(yīng)溫度25℃、真空度0.05 MPa條件下，考察Lipozyme TL IM添加量對反應(yīng)體系中TAG含量的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出：Lipozyme TL IM添加量為10%時(shí)，反應(yīng)體系中TAG含量在反應(yīng)時(shí)間0～5 h時(shí)急劇上升，反應(yīng)5 h達(dá)到91.36%，反應(yīng)7 h后趨于穩(wěn)定，達(dá)到96.56%；Lipozyme TL IM添加量4%、6%及8%的反應(yīng)體系中TAG含量隨反應(yīng)時(shí)間延長不斷上升，在反應(yīng)9 h時(shí)分別達(dá)到88.95%、94.84%及96.55%。在4%～10%的范圍內(nèi)，反應(yīng)速率隨著Lipozyme TL IM添加量的增加而提高，這是由于Lipozyme TL IM添加量較低時(shí)，體系內(nèi)酶的含量不足以滿足底物的接觸需求；隨著Lipozyme TL IM添加量的增加，酶與底物接觸頻率增加，酯化反應(yīng)速率提高。由于反應(yīng)9 h時(shí)Lipozyme TL IM添加量為8%的反應(yīng)體系與添加量為10%的反應(yīng)體系中TAG含量接近，因此選擇Lipozyme TL IM添加量為8%。

圖5 Lipozyme TL IM添加量對酯化反應(yīng)體系中TAG含量的影響

綜上，通過單因素實(shí)驗(yàn)，得到酯化反應(yīng)的最優(yōu)條件為：反應(yīng)溫度25℃，MAG與CA摩爾比1∶3，脂肪酶Lipozyme TL IM添加量為底物質(zhì)量的8%，真空度0.05 MPa，反應(yīng)時(shí)間9 h。在優(yōu)化條件下得到的產(chǎn)物中TAG含量為96.55%。

2.3 TAG的脂肪酸組成

對最優(yōu)酯化條件得到的產(chǎn)物按1.2.4方法分離TAG，并測定其脂肪酸組成，同時(shí)與DHA藻油的脂肪酸組成進(jìn)行對比，結(jié)果如表1所示。

由表1可知:DHA、棕櫚酸(PA，C16∶0)及二十二碳五烯酸(DPA，C22∶5)是DHA藻油中的主要脂肪酸，含量分別為54.12%、25.72%及10.96%；而其sn-2位脂肪酸組成中，PUFA(包括DPA和DHA)總含量為87.86%，其中DHA含量為69.39%。TAG中總脂肪酸以癸酸和DHA為主，含量分別為40.27%和40.04%；與DHA藻油相比，TAG中DHA含量略有下降，棕櫚酸含量顯著下降，而癸酸含量顯著提升。TAG中sn-2位的脂肪酸主要為DHA和DPA，含量分別為72.15%和14.73%，癸酸含量僅為3.17%，表明在優(yōu)化條件下?；w移率低。與DHA藻油相比，TAG中sn-2位的DHA含量更高，原因可能是以下兩點(diǎn)：一是脂肪酶對DHA的活性較低，在醇解制備MAG的過程中，傾向于水解具有較短碳鏈及低不飽和脂肪酸，對DHA有一定的富集效果；二是sn-2位上的部分脂肪酸，如棕櫚酸及油酸，更容易發(fā)生?；D(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致sn-2位的DHA含量增加。

表1 原料及TAG的脂肪酸組成 %

2.4 產(chǎn)品的TAG構(gòu)型

采用UPLC-Q-TOF-MS分離鑒定產(chǎn)品中的TAG構(gòu)型，結(jié)果見表2。

表2 產(chǎn)品的TAG種類及含量

由表2可知:從產(chǎn)品中共分析出14個(gè)TAG母離子，從中鑒定出16種甘油酯，其中MLSL含量為99.14%，含有DHA的 MLSL含量為67.69%； DHA-CA-CA及DPA-CA-CA是產(chǎn)品中最主要的2種TAG，含量分別為54.78%及20.49%。

結(jié)合脂肪酸組成與甘油三酯的鑒定，可以認(rèn)為產(chǎn)品中的主要成分是MLM型TAG，且富含CA-DHA-CA。

3 結(jié) 論

本研究以酶催化醇解DHA藻油(來源于裂殖壺藻)獲得的sn-2位富含DHA的MAG為反應(yīng)原料，以CA為?；w，通過脂肪酶催化酯化反應(yīng)制備sn-2位富含DHA的MLSL。最優(yōu)酯化反應(yīng)條件為：MAG與CA摩爾比1∶3，反應(yīng)溫度25℃，脂肪酶Lipozyme TL IM添加量為底物質(zhì)量的8%，真空度0.05 MPa，反應(yīng)時(shí)間9 h。在最優(yōu)條件下，酯化產(chǎn)物中TAG含量為96.55%，TAG的脂肪酸組成中，DHA占總脂肪酸的40.04%，占sn-2位脂肪酸的72.15%；純化的產(chǎn)品中中長鏈結(jié)構(gòu)脂含量為99.14%，含DHA的中長鏈結(jié)構(gòu)脂含量為67.69%。該產(chǎn)品富含CA-DHA-CA，可從分子層面提升DHA的生物利用率，并應(yīng)用于嬰兒配方食品及功能性食品。