譚睿陟 鐘霞 王麗 楊思進 徐厚平

關鍵詞蛭龍活血通瘀膠囊;腦出血;炎癥;長鏈非編碼RNA;轉錄組測序

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是常見的腦卒中類型之一，發(fā)病率僅次于腦梗死，具有極高的致殘率和致死率[1]。據(jù)研究統(tǒng)計，患者腦卒中后1 年的病死率接近60%，僅有20%的患者在腦卒中6 個月后能存活并獨立生活[2]，且男性發(fā)病率遠高于女性[3]。可見，腦卒中已嚴重威脅患者的生命安全，影響患者及其家屬的生活質量。ICH 由腦組織出血引起，并可由高血壓、動靜脈畸形或頭部外傷導致，其病理生理學特征為嚴重的炎癥、鐵毒性、水腫、氧化應激和凝血酶形成[4]。蛭龍活血通瘀膠囊由水蛭、地龍、大血藤、黃芪、桂枝等藥材組成，是西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院研制的院內制劑，被廣泛用于ICH 的臨床治療，效果明顯[5-6]。此外，多項動物實驗研究亦發(fā)現(xiàn)，蛭龍活血通瘀膠囊能有效改善大鼠/小鼠ICH 導致的腦損傷，具有顯著的腦保護作用[7-9]。然而，蛭龍活血通瘀膠囊干預ICH 的具體作用機制尚不明確。近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分長鏈非編碼RNA（longnon-coding RNA，LncRNA）參與了染色體沉默、基因組印記、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸?shù)榷鄠€重要的調控過程[10-12]，且在中樞神經系統(tǒng)損傷中扮演關鍵角色，如誘導ICH 后細胞自噬和神經炎癥[13]。本研究擬采用尾狀核注射膠原酶以建立ICH小鼠模型，先考察蛭龍活血通瘀膠囊對小鼠ICH的影響，再通過轉錄組測序分析差異LncRNA并進行基因本體（gene ontology，GO）富集，預測有效LncRNA 和靶基因，最后通過體內實驗進行驗證，旨在為明確蛭龍活血通瘀膠囊改善ICH后腦損傷的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LightCycler480 Ⅱ型實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（瑞士Roche 公司），Mini-Protein Tetra System 型蛋白質電泳轉印系統(tǒng)、ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），RM2255 型組織切片系統(tǒng)（德國Leica 公司），BX61VS型全自動虛擬切片掃描系統(tǒng)（日本Olympus 公司），NanoDrop 2000 型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品和試劑

蛭龍活血通瘀膠囊（批號20180216，規(guī)格0.4 g/粒）由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備;Ⅶ型膠原酶（批號C0773）購自美國Sigma 公司;cDNA 逆轉錄試劑（批號R323-01）、熒光定量PCR 試劑（批號Q711-03）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;蘇木精-伊紅染色試劑盒（批號C0105）和尼氏染色試劑盒（批號C0117）均購自上海碧云天生物技術有限公司;免疫組化試劑盒（批號PV-9000）和3，3′- 二氨基聯(lián)苯胺（批號ZLI-9017）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;小鼠白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（批號分別為sc-52012、sc-52746、sc-365062）均購自美國Santa Cruz 公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗（批號31430）和Trizol 總RNA抽提試劑（批號15596026）均購自美國Invitrogen 公司;考馬斯亮藍（批號B104237）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;SuperSignalTM West Pico PLUS 高敏發(fā)光液（批號pierce34580）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6 小鼠33 只，8 周齡，購自成都藥康生物科技有限公司，動物生產許可證號為SCXK（川）-2020-034。所有小鼠均飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學動物實驗中心動物房內，溫度為20～22 ℃，相對濕度為50%～60%，12 h/12 h明暗交替。本實驗方案已通過西南醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準，審批編號為20211111-002。

2 方法

2.1 造模

小鼠經腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，頭部向上固定于腦立體定位儀上，于前囟區(qū)域備皮，用75%乙醇消毒，縱向剪開該處皮膚約1 cm，用3%過氧化氫除去骨膜并暴露前囟及右側顱骨，定位右側尾狀核（前囟右2.5mm，前囟前左側0.2 mm），鉆孔，注射0.075 U/μL Ⅶ型膠原酶溶液1 μL，進針深度為3 mm，5 min 注射完畢，留針5 min 后以1 mm/min 緩慢出針，骨蠟封閉進針孔，縫合皮膚并消毒。實驗過程中保持室溫（25±2）℃。術后24 h，待小鼠清醒后進行改良的神經功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS），若mNSS評分≥7 分則提示建模成功[14]。

2.2 分組、給藥與采樣

2.2.1 藥效學觀察將24 只小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為假手術1 組、模型1 組和蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組[0.35、1.40 g/kg，以水為溶劑，劑量根據(jù)成人日劑量（0.08 g/kg）換算并結合多次動物預實驗結果設置]，每組6 只。模型1 組和各藥物組小鼠按“2.1”項下方法復制ICH 模型，假手術1 組小鼠除不注射膠原酶外其余操作同“2.1”項。術后1 h，各藥物組小鼠灌胃相應藥液，假手術1 組和模型1 組小鼠灌胃生理鹽水，每天1 次，連續(xù)3d。末次給藥后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，經心臟采血處死后迅速分離大腦，并提取ICH血腫周圍組織。血液樣品于室溫下放置1 h 后，以3 000 r/min 離心15 min，分離血清。腦組織分為兩部分，一部分用4%多聚甲醛溶液固定，用于后續(xù)形態(tài)學觀察和免疫組化實驗;另一部分凍存于-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)RNA和蛋白表達檢測。

2.2.2 轉錄組測序將剩余的9 只小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為假手術2 組、模型2 組和干預組（蛭龍活血通瘀膠囊1.40 g/kg，選擇藥效學實驗中改善效果較好的劑量），每組3 只。小鼠造模和給藥同“2.2.1”項。末次給藥后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，經心臟采血處死后迅速分離全腦組織。將全腦組織快速凍存于液氮中，一部分用干冰保存寄往廣州基迪奧生物科技有限公司，以提取高質量RNA并進行測序;另一部用于實時定量PCR驗證。

2.3 小鼠腦組織形態(tài)學觀察

取“2.2.1”項下固定于4%多聚甲醛溶液中的腦組織適量，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度4 μm），經脫蠟、復水后用蘇木精-伊紅染料（蘇木精染色5 min，伊紅染色40 s）、尼氏染料（染色1 h）染色，晾干后用中性樹膠封片。使用全自動虛擬切片掃描系統(tǒng)觀察各組小鼠的腦組織形態(tài)學變化。

2.4 小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α表達的檢測

采用免疫組化法進行檢測。取“2.2.1”項下固定于4%多聚甲醛溶液中的腦組織適量，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度4 μm），經脫蠟后用檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）微波修復抗原，以5%胎牛血清室溫封閉30 min，隨后滴加IL-1β、TNF-α一抗（稀釋比例均為1 ∶ 200），4 ℃孵育過夜;再滴加生物素標記的二抗，室溫孵育1 h 后，使用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（稀釋20 倍）顯色，蘇木精復染細胞核，晾干后用中性樹膠封片。使用全自動虛擬切片掃描系統(tǒng)采集圖片并評估IL-1β、TNF-α表達情況，陽性細胞被染成棕色，棕色越深即表達越強。

2.5 小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α蛋白表達的檢測

采用Western blot 法進行檢測。取“2.2.1”項下凍存的腦組織適量，液氮研磨后加入RIPA裂解液冰上孵育30 min，超聲（功率200 W，頻率20 kHz）處理2 s×5 次;以13 000 r/min 離心10 min，取上清液，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取100 ℃加熱變性的蛋白70 μg 進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V轉膜60 min 后將蛋白轉印至聚偏二氟乙烯膜上，用5%胎牛血清室溫封閉1 h，分別加入IL-1β、TNF-α一抗（稀釋比例均為1 ∶1 000）和GAPDH一抗（稀釋比例為1 ∶5 000），4 ℃孵育過夜;隨后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗（稀釋比例為1 ∶5 000），室溫孵育1 h，用高敏發(fā)光液浸泡30 s 后置于凝膠成像系統(tǒng)下成像。使用Image J V1.8.0 軟件分析蛋白的條帶灰度值，以GAPDH為內參計算目標蛋白的相對表達量。

2.6 小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α mRNA和有效LncRNA及靶基因表達的檢測

采用實時定量PCR 法進行檢測。取“2.2.1”項下凍存或“2.2.2”項下液氮中的腦組織適量，液氮研磨后加入Trizol 總RNA抽提試劑提取總RNA。使用超微量分光光度計測定RNA濃度和純度后，每個樣本取RNA 1 μg進行逆轉錄以制備相應的cDNA。cDNA經無酶水40 μL稀釋后，采用基于SYBR green 體系的PCR 試劑進行PCR 擴增。PCR 反應體系（10 μL）包含上/下游引物各0.5 μL、2×擴增試劑5 μL、cDNA模板1 μL、無酶水3 μL。PCR反應條件如下：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法，以GAPDH為內參計算目標基因的相對表達量。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及產物長度見表1。

2.7 轉錄組測序數(shù)據(jù)處理

為保證數(shù)據(jù)質量，需要在信息分析之前對原始的RNA數(shù)據(jù)進行分析和過濾，以減少無效數(shù)據(jù)對結果造成的干擾。本研究利用Fastp 軟件對測序得到的原始數(shù)據(jù)（raw reads）進行質量分析，過濾低質量數(shù)據(jù)[15];利用R V4.0.4 軟件“DESeq2 包”篩選高質量數(shù)據(jù)中的差異LncRNA，標準為錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.05 且|樣品間表達量比值[log2（FC）]|>1[16];根據(jù)差異LncRNA與其鄰近蛋白編碼基因相關（順式mRNA），或差異LncRNA與其共表達的蛋白編碼基因相關（反式mRNA）分析得到與差異LncRNA 關聯(lián)的順式或反式mRNA[17];將順式或反式mRNA數(shù)據(jù)導入GO數(shù)據(jù)網站（http：//geneontology.org）進行功能分類并富集，應用超幾何檢驗找出與整個基因組背景相比顯著富集的GO條目;利用R V4.0.4 軟件“熱圖（heat map）包”對差異LncRNA表達模式進行層級聚類分析，并使用熱圖呈現(xiàn)聚類結果。蛭龍活血通瘀膠囊干預相關有效LncRNA的篩選標準如下：在模型2 組中找出與假手術2 組相比有顯著差異的LncRNA，且其在干預組中的表達相對于模型組有明顯改善，此LncRNA即為蛭龍活血通瘀膠囊干預ICH相關的有效LncRNA。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 蛭龍活血通瘀膠囊對ICH模型小鼠腦組織形態(tài)的影響

蘇木精-伊紅染色結果（圖1）顯示，與假手術1 組比較，模型1 組小鼠腦組織病理損傷嚴重，細胞間隙增大、排列紊亂;與模型1 組比較，蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組小鼠腦組織病理損傷均有所減輕，其中高劑量組的改善效果更明顯。尼氏染色結果（圖1）顯示，與假手術1組比較，模型1 組小鼠神經元大量減少，腦神經損壞嚴重;與模型1 組比較，蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組小鼠神經元均有所恢復，其中高劑量組恢復更佳。

3.2 蛭龍活血通瘀膠囊對ICH模型小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β和TNF-α表達的影響

3.2.1 免疫組化法模型1 組小鼠腦組織中IL-1 β和TNF-α的表達水平均高于假手術1 組，而蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α的表達水平均低于模型1 組。結果見圖2。

3.2.2 Western blot 法與假手術1 組比較，模型1 組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05）;與模型1 組比較，蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。結果見圖3、圖4。

3.2.3 實時定量PCR 法與假手術1 組比較，模型1 組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.05）;與模型1 組比較，蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。結果見圖5。

3.3 轉錄組測序樣本RNA質量分析

除去含數(shù)據(jù)接頭（adapter）序列、含未知堿基比例大于10%序列、全部都是A堿基序列以及低質量序列數(shù)據(jù)后，所得有效數(shù)據(jù)（clean data）占比均高于99%，表明數(shù)據(jù)質量佳。結果見表2。

3.4 差異LncRNA分析

假手術2 組與模型2 組比較，有44 個差異LncRNA，包括顯著上升的LncRNA 25 個、顯著下降的LncRNA 19個;而模型2 組與干預組比較，有16 個差異LncRNA，包括顯著上升的LncRNA 8 個、顯著降低的LncRNA 8 個。結果見圖6。

3.5 GO富集

差異LncRNA 與順式mRNA關聯(lián)的相關功能主要集中在生物調節(jié)、細胞進程、生物進程陽性調節(jié)、發(fā)育進程等方面，顯著富集的GO條目見圖7A;差異LncRNA與反式mRNA關聯(lián)的相關功能主要集中在刺激響應、代謝調節(jié)、免疫進程等方面，顯著富集的GO條目見圖7B。

3.6 有效LncRNA分析

篩選到1 個LncRNA 在模型2 組中表達較假手術2組更高，且經蛭龍活血通瘀膠囊干預后顯著下調，經數(shù)據(jù)庫（http：//asia.ensembl.org）查詢發(fā)現(xiàn)其為LncRNADlst-211，其靶基因為ribosomal protein S6 kinase-like 1（Rps6kl1）。此外，還發(fā)現(xiàn)LncRNA-MSTRG.8169.4 在模型2 組中低表達，而經蛭龍活血通瘀膠囊干預后顯著上調。聚類分析結果見圖8。

3.7 有效LncRNA的PCR驗證

與假手術2組比較，模型2組小鼠腦組織中Lnc RNADlst-211 的相對表達量顯著升高（P<0.05），Rps6kl1、LncRNA-MSTRG.8169.4 的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。與模型2 組比較，干預組小鼠腦組織中LncRNADlst-211 的相對表達量顯著降低（P<0.05），Rps6kl1、LncRNA-MSTRG.8169.4 的相對表達量均顯著升高（P<0.05）。結果見圖9。

4 討論

ICH 是一種發(fā)病率高、致殘率高、致死率高、復發(fā)率高的腦血管疾病，好發(fā)于中老年人群，嚴重威脅人們的生命安全和生活質量[18]?，F(xiàn)有研究表明，高血壓和淀粉樣腦血管病是原發(fā)性ICH 的主要發(fā)病原因;除此以外，顱內動脈瘤、動脈硬化等也是ICH 的發(fā)病原因之一[19]。ICH 發(fā)病會造成腦組織局部占位性病變，同時釋放大量凝血酶，并激活損傷相關分子模式從而釋放出大量炎癥因子和補體因子，進而誘導腦組織炎癥反應、免疫細胞浸潤和腦細胞凋亡[20]。盡管針對原發(fā)性ICH 損傷的手術已可以減輕神經功能損傷并降低病死率，但是ICH患者的預后依然不佳[21]。因此，減輕ICH 誘導的炎癥和繼發(fā)性腦損傷成為目前ICH臨床治療的主要方向。

中醫(yī)認為，中風（腦卒中）發(fā)生多因風、火、痰、瘀、氣、虛等導致人體氣血陰陽運行失常、臟腑功能失調，故中醫(yī)治療注重祛風、補氣、化痰、活血[22-23]。根據(jù)多年臨床經驗，我院楊思進教授結合現(xiàn)代醫(yī)學理論提出補氣通絡、活血化瘀、化痰祛風的腦血管疾病治療方法，并組方蛭龍活血通瘀膠囊。該方主要包含黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等藥材，被廣泛用于腦卒中的臨床治療，并取得了良好的療效[24]。本研究結果也證實，蛭龍活血通瘀膠囊能顯著改善ICH模型小鼠的腦損傷，促進其腦神經功能恢復，同時能有效降低小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達，減輕繼發(fā)性腦損傷，符合目前ICH臨床治療的抗二次損傷策略。

LncRNA 是一種不具備蛋白質編碼能力的非編碼RNA，其長度超過200 個核苷酸[25]。已有研究證實，LncRNA能參與表觀遺傳介導的轉錄、翻譯、RNA代謝、細胞自噬和細胞凋亡等進程[26]，能調節(jié)神經元、小膠質細胞、星形膠質細胞等細胞炎癥[27]，還與脊髓損傷以及神經退行性疾病的發(fā)生有關[28]。基于此，本研究收集蛭龍活血通瘀膠囊干預前后的腦組織，快速提取總RNA后采用轉錄組測序技術對各組差異LncRNA 予以甄別。結果顯示，模型2 組和假手術2 組比較，有44 個差異LncRNA;模型2組和干預組比較，有16個差異LncRNA;通過進一步篩選發(fā)現(xiàn)了2 個有效LncRNA，即LncRNADlst-211 和LncRNA-MSTRG.8169.4。筆者通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA-Dlst-211 有順式作用靶基因。順式作用靶基因預測基本原理認為，LncRNA 的功能與其鄰近的蛋白編碼基因相關，位于上游的LncRNA 可能與啟動子或者共表達基因的其他順式作用元件有交集，進而在轉錄時或者轉錄后對基因的表達進行調控[29]。LncRNA-Dlst-211 的順式靶基因可能為Rps6kl1，該基因與腦神經發(fā)育相關，在腦部及中樞神經系統(tǒng)中呈高表達[30]。本研究在假手術2 組、模型2 組和干預組小鼠腦組織中檢測這兩個差異LncRNA（LncRNA-Dlst-211 和LncRNA-MSTRG.8169.4）以及LncRNA-Dlst-211 靶基因Rps6kl1 的表達情況，結果顯示，PCR驗證結果與測序結果一致，即LncRNA-Dlst-211 在模型2 組中的表達升高，在干預組中的表達顯著降低，其靶基因Rps6kl1 的表達與之相反;而LncRNA-MSTRG.8169.4 在模型2 組中的表達降低，在干預組中的表達顯著升高。

綜上所述，蛭龍活血通瘀膠囊能改善ICH 模型小鼠的腦損傷，并減輕炎癥反應;其作用機制可能與下調LncRNA-Dlst-211的表達，上調LncRNA-MSTRG.8169.4、Rps6kl1的表達有關。本研究通過轉錄組測序分析了蛭龍活血通瘀膠囊干預后的差異LncRNA 以及其靶基因，并在體內進行了驗證。后續(xù)筆者將進一步檢測差異LncRNA在腦組織中表達的細胞種類，并探討其在蛭龍活血通瘀膠囊改善ICH 損傷中的潛在分子機制。本研究有助于從非編碼RNA 水平闡明復方蛭龍活血通瘀膠囊改善ICH 的表觀遺傳機制，為中藥干預ICH 的研究開拓了新的思路，為中藥藥理研究提供了基礎科學依據(jù)。