董華恒 溫欣 于淼 陳營

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005)

紅豆杉是紅豆杉目紅豆杉科紅豆杉屬的一種喬木，又稱紫杉，也稱赤柏松，是世界上公認(rèn)的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物。紅豆杉的藥用價(jià)值主要體現(xiàn)在其提取物——次生代謝衍生物——紫杉醇。紫杉醇是從紅豆杉的樹皮中分離提純的天然次生代謝產(chǎn)物，在臨床上已經(jīng)廣泛用于乳腺癌、卵巢癌等的治療。紫杉醇作為一個(gè)具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物，其廣泛而顯著的生物活性、全新獨(dú)特的作用機(jī)制等使其受到了植物學(xué)家、化學(xué)家、藥理學(xué)家、分子生物學(xué)家的極大青睞，使其成為20世紀(jì)下半葉舉世矚目的抗癌明星和研究重點(diǎn)[1,2]。但是從紅豆杉樹皮中分離提純的紫杉醇數(shù)量少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了臨床的需要[3,4]，也有學(xué)者采用化學(xué)合成的方法，但其合成路線復(fù)雜、反應(yīng)條件難以控制，合成率低[5]，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)雖具有生產(chǎn)周期短、操作簡單的優(yōu)勢，但是目前已知的微生物生產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)量很低，不能夠滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)要求，因此獲得能夠適用于發(fā)酵生產(chǎn)的工業(yè)菌株是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的前提。

宏基因組學(xué)是一種直接對微生物群體中包含的全部基因組信息進(jìn)行研究的手段。其規(guī)避了對樣品中的微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，提供了一種對不可分離培養(yǎng)的微生物進(jìn)行研究的途徑，更真實(shí)地反映樣本中微生物組成、互作情況，同時(shí)在分子水平對其代謝通路、基因功能進(jìn)行研究[6,7]。本實(shí)驗(yàn)基于宏基因組技術(shù)分析紅豆杉葉發(fā)酵液的微生物菌群，分析其主要代謝通路和合成紫杉醇的相關(guān)酶和微生物，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供優(yōu)勢菌種，從而縮短提取時(shí)間，提高紫杉醇的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

采摘加拿大曼地亞紅豆杉針葉和枝條，置于冰箱內(nèi)冷藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：酵母膏0.5g，(NH4)2SO43g，NaCl 5g，KH2PO40.4g，MgSO40.3g，F(xiàn)eSO40.01g，蒸餾水1000mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

取適量實(shí)驗(yàn)室留存的紅豆杉枝葉樣品清洗晾干后取其葉片絞碎，樣品置于300mL錐形瓶中。配制1000mL富集培養(yǎng)基，121℃滅菌20min。向錐形瓶中加入10g針葉碎片，35℃、140rpm震蕩培養(yǎng)，直至培養(yǎng)液渾濁并且針葉碎片出現(xiàn)明顯降解，為原代共生菌富集液。取原代富集液按5%接種含10%紅豆杉葉的富集培養(yǎng)基，35℃、140rpm震蕩培養(yǎng)4～5d，為一代菌群富集液。同樣操作至三代菌群富集液。每代菌群富集液為3個(gè)平行。

在超凈臺中分別吸取上述最終菌群富集液的3個(gè)平行樣品4mL，置于滅過菌的離心管中，8000rpm離心5min。取出后倒掉上清液，留底部沉淀，命名為h1、h2、h3，冷凍保存后送于公司進(jìn)行微生物宏基因組分析。

1.2.2 宏基因組測序

本實(shí)驗(yàn)樣本采用Illumina Novaseq平臺對測序樣本進(jìn)行雙端測序。采用Illumina測序平臺測序獲得的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)存在一定比例低質(zhì)量數(shù)據(jù)，為了保證后續(xù)分析的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，需要對原始的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括質(zhì)控和去宿主序列，獲取用于后續(xù)分析的有效序列(clean data)。3組數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾后剩余的序列數(shù)占Raw reads 的百分比相近。測序質(zhì)量基本合格，可以用于后續(xù)分析。

1.2.3 物種組成分析

為了研究樣品物種組成及多樣性信息，用Kraken2對所有樣品的全部的有效序列進(jìn)行注釋分類。繼續(xù)用Bracken對Kraken2得到的分類結(jié)果進(jìn)行分類后貝葉斯重新估算豐度來估算宏基因組樣本的物種水平或?qū)偌壺S度。

1.2.4 功能數(shù)據(jù)庫注釋

使用HUMAnN2軟件，將質(zhì)控和去宿主之后的序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，過濾掉比對失敗的reads，統(tǒng)計(jì)UniRef90各個(gè)蛋白的相對豐度，根據(jù)UniRef90 的ID和各個(gè)功能數(shù)據(jù)庫ID的對應(yīng)關(guān)系，統(tǒng)計(jì)各個(gè)功能數(shù)據(jù)庫對應(yīng)功能相對豐度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅豆杉葉際共生菌群的多樣性分析

本實(shí)驗(yàn)首先是以紅豆杉葉為唯一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)，使富集到的菌群均為紅豆杉葉際共生菌，以排除其他雜菌的干擾，確保這些檢測到的菌種與紫杉醇的合成代謝相關(guān)。

由每個(gè)樣本在各分類水平注釋的相對程度可知，本實(shí)驗(yàn)樣品的所有序列都能夠確定到種水平上。由圖1可以看出，3個(gè)樣本的絕對優(yōu)勢菌門為Ascomycota(子囊菌門)存在較高的相對豐度。在屬水平上，該樣本的優(yōu)勢菌屬有Wickerhamomyces(威克罕默氏屬)、Clavispora(棒孢酵母屬)、Meyerozyma(季也蒙念珠菌)、Aspergillus(曲霉屬)。在種水平上，Wickerhamomycesanomalus(威克罕默氏菌)、Clavisporalusitaniae(葡萄牙棒孢酵母)、Meyerozymaguilliermondii(季也蒙念珠菌)、Aspergillusnidulans(構(gòu)巢曲霉)為樣本的優(yōu)勢菌種，且威克罕默氏屬的威克罕默氏菌為絕對優(yōu)勢菌種，存在較高的相對豐度。上述檢測結(jié)果與Flores-Bustamante ZR等[8]的研究結(jié)果一致，即紫杉醇的生產(chǎn)者主要屬于子囊菌門，故這些菌種可能與紫杉醇的合成有關(guān)。

圖1 各個(gè)樣品在門、屬、種水平上的相對分布情況柱形圖注：相對豐度前20的物種。

2.2 紅豆杉共生菌主要代謝通路及紫杉醇合成的分析

對樣本的基因進(jìn)行KEGG注釋，統(tǒng)計(jì)其可能參與或涉及的代謝途徑。由圖2可知，樣本的功能基因在Level1層級有6大類的代謝通路，分別為細(xì)胞過程(Cellular Processes)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、人類疾病(Human Diseases)、新陳代謝(Metabolism)、生物體系統(tǒng)(Organismal Systems)，其主要位于新陳代謝的代謝途徑中。主要功能基因二級代謝途徑有20類，其中富集差異表達(dá)基因最多的8個(gè)KEGG通路包括氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、輔因子和維生素的代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)、翻譯(Translation)、折疊、分類和降解(Folding,sorting and degradation)、運(yùn)輸和分解代謝(Transport and catabolism)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(Endocrine system)。

圖2 KEGG代謝通路的Level1和Level2層級豐度柱形圖

其中，氨基酸代謝和碳水化合物代謝最為活躍。在該樣本中檢測到了一些高豐度碳代謝基因，包括pgm(磷酸葡萄糖變位酶)、己糖激酶(HK)的基因、galM(醛糖-1-差向異構(gòu)酶)等，共11個(gè)。糖酵解/糖異生途徑的特征基因明顯多于其他碳代謝途徑，這說明糖酵解和糖異生途徑在該樣本的碳循環(huán)過程中比較活躍，可以為生命活動提供能量[9]。除此之外，氨基酸代謝和碳水化合物代謝所產(chǎn)生的一些中間產(chǎn)物如乙酰輔酶A、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸等與紫杉醇的合成相關(guān)。紫杉醇類化合物是通過異戊二烯前體合成的，萜類的異戊二烯結(jié)構(gòu)單元可以通過位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑(MVA)或位于質(zhì)體中的磷酸甲基赤蘚糖醇途徑(MEP)合成。MVA途徑起始于乙酰輔酶A，MEP途徑則起始于丙酮酸和甘油醛-3-磷酸，這2種途徑再經(jīng)過共同的中間體IPP最終合成紫杉醇[5]。

通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻(xiàn)[8,9]找到了合成紫杉醇的一些關(guān)鍵酶以及能分泌這些酶的微生物[10-12]，如分泌去乙酰巴卡蛋白III-10β-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Deacetyl Baccatin III-10β-O-acetyltransferase，DBAT)的菌種有Aspergillus candidus(念珠曲霉)、Fusarium solani(茄病鐮刀菌)等；分泌香葉酰香葉酰二磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)的菌種有Clavisporalusitaniae(葡萄牙棒孢酵母)、Aspergillus luchuensis(蘆竹曲霉)、Fusarium solani(茄病鐮刀菌)等；Fusarium solani (茄病鐮刀菌)也是能分泌紫杉二烯合酶(Taxadiene synthase，TS)的菌種。

上述菌種均屬于本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢菌門子囊菌門，其中包括排名第2的優(yōu)勢菌種Clavispora lusitaniae(葡萄牙棒孢酵母)，以及排名第4的優(yōu)勢菌屬Aspergillus(曲霉屬)與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對應(yīng)。這些優(yōu)勢菌種的存在為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌種的篩選提供了理論基礎(chǔ)。

2.3 紅豆杉共生菌主要碳水化合物活性酶與紫杉醇活性的關(guān)系

碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(CAZy)共包括糖苷水解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、多糖裂合酶、碳水化合物酯酶、碳水化合物結(jié)合模塊、輔助模塊酶類6大類蛋白質(zhì)家族。由CAZy功能注釋結(jié)果可知，GT48、GH3、GT62、GH85、GH32、GH5等6類碳水化合物活性酶的活性在樣本中較高，其中樣本中的特征碳水化合物活性酶為GH5(糖苷水解酶家族5)。

糖苷水解酶在寡糖合成、烷基糖苷和芳香基糖苷的合成、氨基酸和多肽的糖基化以及抗生素的糖基化方面發(fā)揮了重要作用。糖基轉(zhuǎn)移酶在生物體內(nèi)催化活化的糖連接到不同的受體分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上[13]。糖基化是生物細(xì)胞中最重要的反應(yīng)之一，這種天然的修飾存在于多種生物學(xué)活性不一樣的天然化合物中，包括抗生素、抗癌藥物、激素、生物堿以及黃酮等多種代謝產(chǎn)物[14]。該樣品中還檢測到了一些抗生素的合成代謝途徑，如圖3所示，新霉素和卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素，這類抗生素的生物合成途徑中，糖基化通常是修飾的最后一步，通過糖的位置、類型和數(shù)量的改變對抗生素的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)；圖4中的新生霉素屬于糖苷類抗生素，其通常含有一個(gè)或多個(gè)糖基，研究表明，糖基可以維持、調(diào)節(jié)和改變糖苷類抗生素的生物活性，糖基化可以增加糖苷類抗生素的極性和水溶性，也可以增強(qiáng)某些抗生素的化學(xué)穩(wěn)定性[15,16]。糖苷水解酶的糖基化作用不僅可以改變抗生素的活性，還能改變紫杉醇的特性，在植物體內(nèi)除了有游離狀態(tài)的紫杉醇還有糖基化的紫杉醇，紫杉醇的糖基化可以大大提高其水溶性，從而便于其在臨床水平上的應(yīng)用。

圖3 合成新霉素、卡那霉素和慶大霉素的相關(guān)途徑

圖4 合成新生霉素的相關(guān)途徑

3 結(jié)論

紅豆杉是世界上公認(rèn)的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物，其藥用價(jià)值主要體現(xiàn)在其提取物——次生代謝衍生物紫杉醇，故獲得合成紫杉醇的菌種，對縮短提取時(shí)間，提高紫杉醇的提取率具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以紅豆杉葉為唯一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)，以確保富集到的菌群均為紅豆杉葉際共生菌，從而排除其他雜菌的干擾。后經(jīng)宏基因組技術(shù)分析可得，本實(shí)驗(yàn)所檢測到的菌種均處于紫杉醇的主要生產(chǎn)者——子囊菌門，且樣本中也存在合成紫杉醇的菌種Clavispora lusitaniae(葡萄牙棒孢酵母)，故通過分析推測樣本中的菌種可以參與紫杉醇的合成代謝，并且其分泌的糖苷水解酶和糖苷轉(zhuǎn)移酶可以使紫杉醇發(fā)生糖基化修飾，從而提高其水溶性，便于其在臨床水平上的應(yīng)用。