吳偉懷，劉寶慧，鹿鵬鵬，梁艷瓊，賀春萍，李銳，易克賢

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，海口 571101；2.南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，南京 210095；3.海南大學植物保護學院，?？?570228）

0 引言

由黑頂柄銹菌（Puccinia melanocephalaSydow）引起的甘蔗褐銹病是甘蔗生產(chǎn)中較為嚴重的病害之一[1]。該病主要為害葉片，起初病斑為淡黃色小斑點，并伴有黃色暈圈，后期病斑擴大，顏色變?yōu)樯詈稚?。夏孢子堆為紅褐色，大多數(shù)著生在葉背面，嚴重時，葉正面也可見紅褐色孢子堆。受害后的甘蔗分蘗減少，蔗莖變細[2]。在我國，甘蔗銹病在云南、四川、江西、福建和廣東等甘蔗產(chǎn)區(qū)發(fā)生，一般減產(chǎn)15%～30%，嚴重時可達40%以上，使得蔗糖含量下降10%～36%[3]。過去，該病害的鑒定主要依賴常規(guī)的形態(tài)學并結(jié)合傳統(tǒng)的鑒別寄主法。該方法需經(jīng)過病原菌的分離（獲得）—形態(tài)鑒定—回接與再分離等過程，整個過程費時費力，還需要具備專業(yè)的分類學知識以及豐富的經(jīng)驗。即使如此，其結(jié)果的準確性和可信度易受外界因素的影響，難以滿足快速、高通量鑒定與檢測的實際需求。顯然，依靠上述方法是無法對甘蔗褐銹病早期發(fā)生情況進行快速準確鑒定。所以有必要對甘蔗褐銹病菌的檢測與監(jiān)測技術(shù)做進一步的研究。

由巢式PCR（Nested PCR）基礎(chǔ)上改進而來的單管巢式PCR（Single-tube nested PCR），其具體原理是在同一個PCR 管中加入兩對引物（外引物、內(nèi)引物對）以完成兩輪PCR 擴增；擴增所需反應(yīng)液組分與普通PCR 的一樣，只是在擴增時外引物的退火溫度要高于內(nèi)引物對的退火溫度約10 ℃。這樣在第一輪外引物擴增時，而此溫度下內(nèi)引物不能結(jié)合；隨后第二輪內(nèi)引物擴增以第一輪擴增反應(yīng)產(chǎn)物為模板，內(nèi)引物在較低退火溫度擴增時，此時外引物則因消耗完（控制外引物量）而不能進行有效擴增[4]。與巢氏PCR相比，單管巢氏PCR由于試驗過程中不需要開PCR 管操作，從而降低了污染的風險[4]。目前該技術(shù)已在梨火疫病病原菌（Erwinia amylovora）[5]、母羊胎兒組織弓形蟲（Toxoplasma gondii）[6]、貓屎胎三毛滴蟲（Tritrichomonas foetus）[7]、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）[8]、谷物樣品鐮刀病菌（Fusarium culmorum）[9]、菠蘿凋萎病（Pineapple mealybug wilt）[10]、內(nèi)臟利什曼?。╒isceral leishmaniasis）[11]、濃毒癥（Pythiosis）[12]、結(jié)核性腦膜炎（Tuberculous meningitis）[13]、人類瘧原蟲（Human plasmodium）[14]等病原物檢測中得以應(yīng)用。目前，針對甘蔗褐銹菌雖已建立了該病原菌的常規(guī)PCR[15-16]以及巢式PCR分子檢測方法[17]，但是關(guān)于該病原菌的單管巢式PCR的檢測體系尚未建立。為此，本文擬建立甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR檢測體系，為該病原菌的鑒定與檢測提供一種可靠的分子診斷技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試樣品DNA 共計16份，分別為甘蔗褐銹病菌（P.melanocephala）、甘蔗黃銹病菌（P.kuehnii）、咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）、橡膠炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、咖啡褐斑病菌（Cercospora coffeicola）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）各2 份，以及甘蔗黑穗病菌（Sporisorium scitamineum）、劍麻莖腐病菌（Aspergillus niger）、雞蛋花鞘銹菌（Coleosporium plumierae）、葡萄層銹病菌（Phakopsora ampelopsidis）各1份（表1）。

表1 供試菌株Table 1 Strains used in this study

其中甘蔗褐銹病菌Pm1與Pm2，經(jīng)提取核酸后檢測與克隆測序確認為甘蔗褐銹病菌后，作為本試驗的陽性樣品；而來自甘蔗褐銹病菌Pm1 菌株的ITS 質(zhì)粒DNA 則作為靈敏度分析的DNA 模板；而其余甘蔗黃銹病菌、雞蛋花鞘銹菌、橡膠炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、稻瘟病菌、劍麻莖腐病菌、甘蔗黑穗病菌樣品、葡萄層銹病菌等DNA 樣品一起作為特異性分析模板。所有菌株DNA 樣品均保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA提取

甘蔗褐銹病菌DNA 的提取方法采用CTAB法提取[18]；其他供試菌株的DNA 提取均采用真菌DNA 提取試劑盒（E.Z.N.ATM Fungal DNA kit，Omega公司，美國）提取，具體實驗步驟按試劑盒的參考說明書進行。

1.2.2 甘蔗褐銹病菌ITS重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用WHITE等設(shè)計的引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[19]對甘蔗褐銹病菌基因組DNA 進行擴增。反應(yīng)體系為20 μL∶dd H2O 14.3 μL，10×rTaqBuffer 2 μL，2.5 mmol/L d NTPs 1.6 μL，rTaqDNA Polymerase 0.1 μL，10 μmol/L 的上下引物各0.5 μL，30 ng/μL 模板DNA 1 μL。PCR擴增程序為：94 ℃下預變性3 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個循環(huán)后72 ℃延伸4 min，結(jié)束后保存于12 ℃。將擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。取2 μL PCR 回收產(chǎn)物與pEASY-T1連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌培養(yǎng)（E.colitrans T1），經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性克隆后，用OMEGA 質(zhì)粒提取試劑盒提取構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA，委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司廣州實驗室進行測序。

1.2.3 引物設(shè)計

通過下載與甘蔗褐銹病菌ITS 序列同源性比較高的相關(guān)序列，比對獲得甘蔗褐銹病菌ITS 序列的保守區(qū)域?；趩喂艹彩絇CR 擴增引物設(shè)計原理：一般外引物退火溫度高于內(nèi)引物10 ℃左右，以所獲得Pm1 菌株ITS 序列為參考，利用Primer explorer 5.0 在線軟件針對多態(tài)性豐富特異性區(qū)域設(shè)計引物，設(shè)計好的引物委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司廣州合成部合成。

1.2.4 外引物與內(nèi)引物最佳退火溫度篩選

為了確認甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 最佳的退火溫度，對所設(shè)計的內(nèi)引物進行52～66 ℃梯度退火溫度擴增，篩選出最佳退火溫度；在內(nèi)引物最佳退火溫度的基礎(chǔ)上，對外引物設(shè)置61～73 ℃梯度退火溫度，從中篩選出高于內(nèi)引物最佳退火溫度大約10 ℃的外引物最佳退火溫度。

上述擴增均采用20 μL 反應(yīng)體系，其具體程序與參數(shù)同1.2.2。內(nèi)引物的反應(yīng)程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，梯度退火溫度52～66 ℃10 s，72 ℃延伸25 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸4 min，12 ℃保存。外引物的反應(yīng)程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，梯度退火溫度61～73 ℃10 s，72 ℃延伸25 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸4 min，12℃保存。

1.2.5 外引物與內(nèi)引物最佳濃度比篩選

單管巢式PCR 正常運轉(zhuǎn)的第二個條件即為：通過外引物與內(nèi)引物量的不同而到達控制外引物擴增。具體而言，在第一輪擴增中（外引物擴增）引物消耗殆盡后，內(nèi)引物則以外引物產(chǎn)生的模板進行第二輪擴增。為此，以篩選出的外、內(nèi)最佳退火溫度為基礎(chǔ)，設(shè)置外引物為1 nmol/L、10 pmol/L、0.1 pmol/L、10 fmol/L、1 fmol/L、0.1 fmol/L 6個不同的濃度，內(nèi)引物設(shè)置為10 μmol/L，交叉組合進行單管巢式PCR濃度比試驗。

1.2.6 特異性分析及驗證

選取甘蔗褐銹病菌、甘蔗黃銹病菌、咖啡駝孢銹菌、橡膠炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、稻瘟病菌菌株各2 株，以及雞蛋花鞘銹菌、葡萄層銹菌、甘蔗黑穗病菌、劍麻莖腐病菌株各1株，以上述16份菌株DNA為模板，并以dd H2O 為陰性對照。對所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系進行特異性分析。PCR 反應(yīng)體系以及反應(yīng)程序以1.2.4和1.2.5最終確定的條件為準。

選用EcoRI酶對PCR產(chǎn)物進行酶切驗證。酶切體系（20 μL）：10×Quick CutBuffer2 μL、PCR產(chǎn)物8 μL、EcoRI 1.5 μL、dd H2O 8.5 μL。酶切程序：37 ℃3 h 30 min，65 ℃30 min。酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂凝膠電泳檢測。

1.2.7 靈敏度分析

利用超微量分光光度計（NanoDrop 2000c）將質(zhì)粒DNA 初始濃度調(diào)整為10 ng/μL，采用梯度稀釋法對DNA 進行100～10-6倍的稀釋，以dd H2O 為陰性對照，進行PCR 檢測。采用優(yōu)化后的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系，進行靈敏度分析。并利用PmF2/R2 進行普通PCR 靈敏度檢測，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考1.2.4和1.2.5。

1.2.8 田間疑似病樣采集與DNA提取

從廣東湛江農(nóng)墾東方紅農(nóng)場甘蔗地收集疑似甘蔗褐銹病病葉，采用CTAB 法提取葉片總DNA，以進行單管巢式PCR檢測鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR的引物設(shè)計

將甘蔗褐銹病菌ITS 序列與下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫中包括銹菌目10 個科14 個屬的24 條同源序列通過DNAStar 軟件以及在MultAlin 網(wǎng)站上（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin.html）進行多重比對。結(jié)果表明，甘蔗褐銹病菌ITS 序列與其它菌株序列存在差異區(qū)域，最終根據(jù)差異區(qū)域設(shè)計了外引物對PmF1/R1 與內(nèi)引物對PmF2/R2，二者預期擴增片段大小分別為433 bp、266 bp（表2）。

表2 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 引物Table 2 Single-tube nested PCR primers for P.melanocephala

2.2 內(nèi)引物與外引物的最佳退火溫度

根據(jù)已合成引物的預期退火溫度，將內(nèi)引物對PmF2/R2設(shè)置為52～66 ℃8 個梯度退火溫度進行PCR 擴增。結(jié)果表明，在供試的8 個退火溫度中，內(nèi)引物PmF2/R2 在退火溫度為52～57.3 ℃時，均能擴增出特異目的條帶；退火溫度為60.5 ℃時未擴增出特異性目的條帶。因此，內(nèi)引物的最高退火溫度為57.3 ℃。據(jù)此，選取52 ℃作為內(nèi)引物的最佳退火溫度，開展后續(xù)試驗（圖1）。

圖1 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR內(nèi)引物最佳退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperature for internal single-tube nested primers for P.melanocephala

同理，根據(jù)已合成引物的預期退火溫度，將外引物設(shè)置為61～73 ℃8 個梯度退火溫度進行PCR 擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有退火溫度為61～63.4 ℃時能擴增出清晰且特異條帶，退火溫度為65.5 ℃時，所擴增出的條帶較微弱，而其余4 個退火溫度均未出現(xiàn)目的條帶（圖2）。而內(nèi)引物在退火溫度60.5 ℃及其以上時，并不能有效擴增。換言之，只有外引物退火溫度為60.5 ℃及以上時，方可到達單管巢式PCR 中外引物有效擴增。當退火溫度為63.4 ℃，條帶最為清晰，所以，選取63 ℃作為外引物的最佳退火溫度。

圖2 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR外引物最佳退火溫度優(yōu)化Fig.2 Annealing temperature of single-tube nested PCR outer-primers for P.melanocephala

2.3 單管巢式PCR檢測體系外、內(nèi)引物最佳濃度比

通過設(shè)置外引物為1 nmol/L、10 pmol/L、0.1 pmol/L、10 fmol/L、1 fmol/L、0.1 fmol/L 6個濃度梯度，將內(nèi)引物濃度設(shè)為10 μmol/L，篩選可進行單管巢式PCR 外引物的有效量。試驗結(jié)果表明，供試的6 個不同外內(nèi)引物濃度比中，均能擴增出相應(yīng)的目的條帶（圖3）。從清晰度角度考慮，當引物濃度為10 pmol/L 時，肉眼可見條帶最為清晰明亮，所以將外引物的最佳濃度定位10 pmol/L。因此，外內(nèi)引物的最佳終濃度比為0.5 pmol/L∶0.5 μmol/L。

圖3 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR外內(nèi)引物最佳濃度篩選Fig.3 Screening of optimal concentration of outer and inner primers for single tube nested PCR for P.melanocephala

2.4 單管巢式PCR檢測體系特異性分析

利用所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系，對2份甘蔗褐銹病菌，以及14份其它非甘蔗褐銹病菌株DNA 進行擴增，并對PCR 產(chǎn)物進行酶切驗證其真實性。試驗結(jié)果表明，只有DNA 模板為甘蔗褐銹病菌時，可產(chǎn)生肉眼可見的清晰且特異的目的條帶，而其它14 株非甘蔗褐銹病菌DNA 均未擴增出目的條帶（圖4）。同時，擴增出的甘蔗褐銹病菌PCR 產(chǎn)物進行EcoRI酶切驗證，其酶切產(chǎn)物電泳出112 bp清晰條帶（圖5）。由此表明，所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR檢測體系具有高度的特異性。

圖4 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR特異性分析Fig.4 Specificity analysis of single-tube nested PCR for P.melanocephala

圖5 甘蔗褐銹病菌PCR產(chǎn)物酶切Fig.5 PCR product digestion of P.melanocephala

2.5 靈敏度效果分析

單管巢式PCR 靈敏度結(jié)果顯示，在供試的8 個模板濃度中，前7 個模板的擴增條帶強弱隨其濃度的降低而依次變?nèi)?。當質(zhì)粒模板濃度為10 fg/μL時，檢測出的目的條帶最弱；而當質(zhì)粒模板濃度大于10 fg/μL時，則檢測不出目的條帶。由此表明，所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系的最低檢測濃度為10 fg/μL（圖6A）。比較而言，普通PCR 的最低檢測濃度為10 pg/μL（圖6B）。所以，本試驗所開發(fā)的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR反應(yīng)體系的最低檢測終濃度（10 fg/μL）是常規(guī)PCR最低檢測終濃度（10 pg/μL）的1 000倍。

圖6 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR靈敏度檢測Fig.6 Sensitivity detection of single-tube nested for P.melanocephala

2.6 田間疑似病樣分子鑒定

對田間采集的19 份疑似病樣進行了單管巢式PCR 檢測，檢測結(jié)果表明，其中18 份樣品經(jīng)檢測均擴增出唯一條帶，其大小與預期的266 bp 一致。利用EcoRI 酶對18 份樣品PCR 產(chǎn)物進行酶切，酶切結(jié)果表明，所有樣品PCR 產(chǎn)物均可酶切出預期大小的目的條帶?？傊?，采集的19份疑似病樣經(jīng)單管巢式PCR 檢測后，其中18份樣品DNA 中均含有甘蔗褐銹病菌（表3）。

表3 田間疑似病樣的分子檢測Table 3 Molecular detection of suspected disease samples in the field

3 討論與結(jié)論

隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，許多技術(shù)用于病原微生物的分子檢測中。巢式PCR 檢測技術(shù)由于通過兩輪PCR 的擴增而大大提高了檢測的靈敏性，也正是通過第一輪擴增而產(chǎn)生的非特異性序列，由于不包含第二輪引物的擴增位點以致于其特異性也大大提高[4]。正因為巢式PCR 具有較好的特異性與靈敏度，已被廣泛應(yīng)用。然而，巢式PCR 在以第一輪PCR產(chǎn)物作為模板擴增過程中其被潛在污染的風險也隨之增加。為此，基于巢式PCR改善而來的單管巢式PCR能很好地克服該缺點。

分子檢測技術(shù)得以廣泛應(yīng)用的前提條件就是高質(zhì)量的引物。換言之，開發(fā)出高度特異引物對是分子檢測技術(shù)賴以生存的首要條件[20-21]。為此，在本研究中通過對銹菌目10 個科14個屬的24 條ITS 序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)甘蔗褐銹病菌ITS區(qū)域與其它非甘蔗褐銹病菌存在一段特異區(qū)域?；谠撎禺愋詤^(qū)域，結(jié)合單管巢式PCR 引物設(shè)計原則中外引物對與內(nèi)引物對退火溫度的要求，最終設(shè)計了單管巢式PCR 嵌套式引物對PmF1/R1與PmF2/R2，二者退火溫度預期相差約15 ℃。這為甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。

單管巢式PCR 檢測技術(shù)得以運行的關(guān)鍵因素之一，即外引物的退火溫度必須高于內(nèi)引物的退火溫度10 ℃以上[10]。為此，本試驗對設(shè)計的2對引物外引物與內(nèi)引物的實際退火溫度進行了篩選。根據(jù)試驗結(jié)果，最終篩選出甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR分子檢測技術(shù)的外引物與內(nèi)引物的退火溫度分別為63 ℃與52 ℃。

在單管巢式PCR 檢測中，外引物與內(nèi)引物量的比例是建立該檢測體系的又一關(guān)鍵因素[4]。為此，本研究對外引物對PmF1/R1 與內(nèi)引物PmF2/R2 對之間的比例進行了篩選與優(yōu)化。經(jīng)試驗結(jié)果表明甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測技術(shù)外引物與內(nèi)引物的最佳比例為0.5 pmol/L∶0.5 μmol/L。盡管單管巢式PCR 檢測技術(shù)體系中外引物與內(nèi)引物的比例是十分關(guān)鍵的，但是針對不同引物其最佳引物比例也是不同的。如母羊胎兒組織勾形蟲外內(nèi)引物終濃度比例為0.01 μmol/L∶0.4 μmol/L[6]，谷物樣品鐮刀病菌外內(nèi)引物終濃度比0.1 fmol/L∶1 pmol/L[9]，菠蘿凋萎病外內(nèi)引物濃度比為2 pmol/L∶0.2 nmol/L[10]，貓屎胎三毛滴蟲外內(nèi)引物濃度比為12.5 fmol/L∶0.25 pmol/L[7]?？偠灾?，單管巢式PCR 檢測技術(shù)體系中外引物與內(nèi)引物的比例是十分關(guān)鍵的，但針對不同引物，其最佳比例也不同。

本研究先后對建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系的特異性、靈敏度等方面進行了測定。特異性結(jié)果顯示：該檢測體系只能從含有甘蔗褐銹病菌的DNA 模板中檢測出目的條帶，其它非同屬不同種的模板DNA 沒有產(chǎn)生任何條帶，具有高度的特異性。靈敏度結(jié)果顯示，甘蔗褐銹病菌單管巢式的靈敏度可達10 fg/μL。這一結(jié)果與結(jié)核性腦膜炎單管巢氏的靈敏度（1 fg/μL）[13]、霍亂弧菌的靈敏度（1 fg/μL）[8]相當，但是要比菠蘿凋萎病菌單管巢氏的靈敏度（0.95 pg/μL）[10]、膿毒癥病原菌（Pythium insidiosum）單管巢氏的靈敏度（2.7 pg/μL）[12]均要靈敏。最后利用該檢測技術(shù)，對19 份疑似病樣進行了檢測，其中18份樣本DNA 中均檢測出甘蔗褐銹病菌。由此可見，本研究所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系具有高度的特異性、靈敏性以及實用性。